Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)

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Cinética e Inhibición enzimática (laboratorio bioquimica)

  1. 1. Universidad de La Serena Facultad de Ciencias Departamento de Biología Laboratorio Bioquímica General Ingeniería en Alimentos Alumna: Natalia Vargas Guzmán Profesora: Carla Maturana Valdivia I Semestre 2013
  2. 2. La concentración de sustrato determina la actividad enzimática medida como la velocidad de la catálisis enzimática. Si la concentración de la enzima se mantiene saturada, la producción de producto será a una velocidad máxima.
  3. 3. Gráfica Michaelis-Menten: Ecuación Michaelis-Menten:
  4. 4. Gráfica Lineweaver-Burk: Ecuación Lineweaver-Burk:
  5. 5. Gráfica Eadie-Hofstee: Ecuación Eadie-Hofstee:
  6. 6. Gráfica Hanes-Woolf: Ecuación Hanes-Woolf:
  7. 7. Velocidad de reacción enzimática Inhibidores Irreversible Reversible Competitiva No competitiva Acompetitiva Activadores La forma de representar la inhibición gráficamente es con la doble reciproca
  8. 8. En la inhibición competitiva, el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo. Km Aument a Vmax Constant e
  9. 9. En la inhibición no competitiva el inhibidor se une a la enzima en otro lado, no es su sitio activo Km Vmax Constant e Disminuy e
  10. 10. En la inhibición acompetitiva el inhibidor se une al complejo enzima-sustrato ya conformado. Cambio proporcional en Km y Vmax
  11. 11. Objetivos: - Estudiar la influencia de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción enzimática. - Calcular la constante de Michaelis-Menten. Fundamento: Determinar de la actividad enzimática de una preparación de β-fructofuranosidasa en presencia de diferentes concentraciones de sacarosa como sustrato.
  12. 12. Materiales: • 8 tubos de ensayo • Pipeta • Baño termorregulador a 27°C • Espectrofotómetro • 8 Cubetas de espectrofotómetro Reactivos: • Solución Glucosa-Fructosa 0,01M • Soluciones de sacarosa (distintas concentraciones) • Reactivo DNS (inhibe o detiene la act. Enzimática) • Buffer acetato • Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una dilución que asegure un producto 5 moles/min.
  13. 13. Procedimientos: 1. Disponer serie de 6 tubos de ensayo con concentración creciente de sacarosa. 2. Luego agregar : - 1,5 mL Buffer acetato - 0,5 mL solución enzima 1/2000. 3. Equilibrar a 27°C por 3 minutos (Agregar sacarosa 1 mL). 4. Dejar en baño a 27°C por 40 minutos. 5. Agregar 2 mL de DNS, enfriar. 6. Agregar 15 mL de Agua destilada 7. Medir absorbancia (540nm).
  14. 14. Resultados y Conclusiones Para calcular la concentración de glucosa usaremos la ecuación de la recta obtenida por la curva de calibración: y = 0,183x - 0,0085 r² = 0,9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Absorbanciaa540nm Concentración Glucosa (mM) Curva de calibración Glucosa-Fructosa por el Método DNS Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183
  15. 15. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183 Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa. Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada tubo: C1 x V1 = C2 x V2 Concentración del tubo 1: 0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción Para calcular la velocidad de la reacción: V= [glucosa] tiempo de reacción: 40 minutos tiempo reacción
  16. 16. Tabla: Valores obtenidos Tubo [sacarosa] M Absorbanci a [Sacarosa en reacción] M [Glucosa] Velocidad de reacción (M/min) 1 0,45 2,95 0,15 16,1 0,40 2 0,3 3,07 0,1 16,8 0,42 3 0,2 3,01 0,066 16,49 0,41 4 0,1 2,04 0,033 11,2 0,28 5 0,05 1,42 0,0166 7,8 0,19 6 0,03 1,14 0,01 6,27 0,15 P 0,45 0,57 0,15 3,17 0,079
  17. 17. [sacarosa] M Velocidad de reacción (M/min) 0,45 0,40 0,3 0,42 0,2 0,41 0,1 0,28 0,05 0,19 0,03 0,15 Tabla datos gráfico Michaelis-Menten Vmax Km= Vmax 2 Vmax = 0,21 (M/min) 2 Km = 0,02 M
  18. 18. 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 Velocidad(M/min) Concentración sacarosa (M) Grafico Michaelis-Menten: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la -fructofuranosidasa Km Vmax Vmax 2
  19. 19. y = 0,0484x + 2,0082 R² = 0,9818 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 120 1/v(M/min) 1/[S] (M) Grafico Lineweaver-Burk: Influencia de la concentración de sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la -fructofuranosidasa
  20. 20. 1/s 1/v 6,67 2,5 10 2,38 15,15 2,44 30,30 3,57 60,24 5,26 100 6,67 Tabla datos gráfico Lineweaver-Burk y = 0,0484x + 2,0082 1 = 2,0082 (M/min) Vmax Km = 0,0484 Vmax Vmax = 0,4979 (M/min) 1 = 41,49 (M) Km Km = 0,0241 (M)
  21. 21. v/s v 2,67 0,4 4,2 0,42 6,21 0,41 8,48 0,28 11,45 0,19 15 0,15 Tabla datos gráfico Eadie-Hofstee: y = -0,0245x + 0,5043 Km = 0,0245 (M) Vmax = 0,5043 (M/min)
  22. 22. Grafico Vmax (M/min) Km (M) Michaelis-Menten 0,42 0,02 Lineweaver-Burk 0,49 0,024 Eadie-Hofstee 0,50 0,024 Observamos que los resultados obtenidos son muy similares, gracias a los diferentes gráficos podemos calcular la actividad enzimática y su valores de Km y Vmax. A mi parecer el gráfico mas eficiente es el de Lineweaver-Burk ya que la actividad enzimática representada de forma lineal facilita los cálculos.
  23. 23. Objetivos: - Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la velocidad de una reacción enzimática. Fundamento: Determinar la velocidad de la hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones por la β- fructofuranosidasa en presencia de una concentración constante de yodo acetato.
  24. 24. Materiales: • 14 tubos de ensayo • Pipeta Reactivos: • Yodo acetato 0,001M • Solución de Glucosa - Fructosa 0,01M • Solución de sacarosa a diferentes concentraciones • Reactivo DNS (inhibe o detiene la actividad enzimática) • Buffer acetato pH=4,7 0,05 M • Solución extracto β-fructofuranosidasa
  25. 25. Procedimientos: Luego agregar: - 1 mL Buffer acetato Equilibrar a 27°C por 3 minutos. Agregar 0,5 mL solución enzima 1/250. Dejar en baño a 27°C por 5 minutos. Agregar 2 mL de DNS a 100°C por 5 minutos (enfriar). Agregar 15 mL de Agua destilada Medir absorbancia (540nm). Con inhibidor Sin inhibidor
  26. 26. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085 [Glucosa] = Abs+0,0085 0,183 Reemplazamos la absorbancia de cada tubo para calcular la concentración de glucosa. Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada tubo: C1 x V1 = C2 x V2 Concentración del tubo 1: 0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción Para calcular la velocidad de la reacción: V= [glucosa] tiempo de reacción: 40 minutos tiempo reacción Resultados y Conclusiones Haremos los mismos procedimientos pero ahora calcularemos velocidad con y sin inhibidor
  27. 27. Tabla valores obtenidos SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR Tubo [sacarosa]M [Sacaros a en reacción ] M Abs [Glucosa ] M Velocida d (M/min) Abs [Glucos a] M Velocida d (M/min) 1 0,45 0,15 2,46 13,51 2,70 2,95 9,85 1,97 2 0,3 0,1 2,05 11,25 2,25 3,07 8,10 1,62 3 0,2 0,066 1,67 9,19 1,83 3,01 6,88 1,37 4 0,1 0,033 0,87 4,77 0,95 2,04 4,67 0,93 5 0,05 0,0166 0,56 3,10 0,62 1,42 3,12 0,62 6 0,03 0,01 0,45 2,48 0,49 1,14 2,30 0,46
  28. 28. [Sacarosa] M Velocidad C.I. M/min 0,15 1,97 0,1 1,62 0,066 1,37 0,033 0,93 0,0166 0,62 0,01 0,46 [Sacarosa] M Velocidad S.I. M/min 0,15 2,70 0,1 2,25 0,066 1,83 0,033 0,95 0,0166 0,62 0,01 0,49 Tablas para gráfico Michaelis-Menten
  29. 29. CON INHIBIDORSIN INHIBIDOR Vmax = 2,7 (M/min) Vmax = 1,35 (M/min) 2 Km = 0,04 (M) Vmax = 1,97 (M/min) Vmax = 0,985 (M/min) 2 Km = 0,028 (M) Vmax = Km 2
  30. 30. 1/[S] M 1/v S.I. (M/min) 6,67 0,507 10 0,617 16,67 0,729 33,33 1,075 62,5 1,613 100 2,174 1/[S] M 1/v C.I. (M/min) 6,67 0,370 10 0,444 16,67 0,546 33,33 1,052 62,5 1,612 100 2,040 Tablas para gráfico Lineweaver-Burk
  31. 31. SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR Km = 0,0186 Vmax 1 = 0,3016 (M/min) Vmax 1 x 1 = 1 Vmax 0,0186 Km 1 = 16,21 (M) Km Km = 0,0178 Vmax 1 = 0,4385 (M/min) Vmax 1 x 1 = 1 Vmax 0,0178 Km 1 = 24,63 (M) Km
  32. 32. Gráfico Michaelis-Menten: Vmax (M/min) Km (M) Sin inhibidor 2,70 0,040 Con inhibidor 1,97 0,028 Observamos que en presencia del Inhibidor yodo acetato , la Vmax y Km disminuye. Estamos en presencia de un inhibidor acompetitivo ya que el resultado es un cambio proporcional en la Vmax y Km Gráfico Lineweaver-Burk: Vmax (M/min) Km (M) Sin inhibidor 3,32 0,061 Con inhibidor 2,28 0,040

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