introduccion a la cromatografia

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introduccion a la cromatografia

  1. 1. t0 1 2 3 211299 Análisis Instrumental II – Quimicos Analistas 2006 CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL I: PRINCIPIOS Y PARAMETROS Dr. Dietrich von Baer v. L. Dra. Claudia Mardones P. Universidad de Concepción Facultad de Farmacia Departamento de Análisis Instrumental
  2. 2. CROMATOGRAFIA CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR Columna de Carbonato de Calcio Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella D. von Baer/C. Mardones 2008 Pigmentos naturales
  3. 3. CROMATOGRAFIA CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR Columna de Carbonato de Calcio Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella Eter de petróleo Pigmentos naturales D. von Baer/C. Mardones 2008
  4. 4. CROMATOGRAFIA CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR Columna de Carbonato de Calcio Mikhail Tswett: 1906: separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella Martin y Synge (1952): Obtienen Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla. Eter de petróleo Pigmentos naturalesMartin y James (1952): Inventan Cromatografía de Gas (1er método instrumental) D. von Baer/C. Mardones 2008
  5. 5. CROMATOGRAFIA CHROMATOS = COLOR GRAPHEIN = ESCRIBIR Columna de Carbonato de Calcio Mikhail Tswett (1906): separó pigmentos naturales coloreados sobre tiza haciendo pasar éter de petróleo sobre ella HOY: Conjunto de métodos de análisis químico instrumental que permiten separar los componentes de una mezcla, los cuales se distribuyen SELECTIVAMENTE entre: FASE ESTACIONARIA (en reposo) FASE MOVIL (se hace pasar a través de o en torno a FASE ESTACIONARIA ) Martin y Synge (1952): Reciben Premio Nóbel de Química por la invención de la Cromatografía de Partición en Papel: Clave para la separación de aminoácidos y diversos otros compuestos de interés biológico en mezcla. Eter de petróleo Pigmentos naturalesMartin y James (1952): Inventan Cromatografía de Gas (1er método instrumental) D. von Baer/C. Mardones 2008
  6. 6. CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS  Según ESTADO FISICO de las FASES: Crom. LIQ- LIQUIDO Crom. GAS- LIQUIDO Crom. LIQ - SOLIDO Crom. GAS – SOLIDO FASE MOVIL: Líquido Gas FASE ESTA- CIONARIA: Líquido Sólido Cromatógrafo de Líquidos Cromatógrafo de Gases INSTRUMENTO CROMATOGRAFO DE LIQUIDOS CROMATOGRAF O DE GASES D. von Baer/C. Mardones 2008
  7. 7. CLASIFICACION METODOS CROMATOGRAFICOS  Según el OBJETIVO: Identificar y cuantificar componentes de una mezcla Compuesto % A 12,5 B 25,0 C 50,0 D 12,5 • Analítica • Preparativa Aislar componentes de una mezcla D. von Baer/C. Mardones 2008
  8. 8. • PLANAR Fase estacionaria Fase móvil p1 p2 p3 m1 m2 D. von Baer/C. Mardones 2003  Según la FORMA de hacerla: En COLUMNA COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC
  9. 9. Fase móvil Fase estacionaria p1 p2 p3 m1 m2 • PLANAR COLUMNAS DE HPLC COLUMNA DE GC  Según la FORMA de hacerla: En COLUMNA D. von Baer/C. Mardones 2008
  10. 10.  Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION: • PARTICION O REPARTO: Solubilidad selectiva entre dos fases. Lo SIMILAR ES SOLUBLE EN LO SIMILAR Fase Estacionaria: LIQUIDO Fase Móvil: LIQUIDO o GAS D. von Baer/C. Mardones 2003 • PARTICION O REPARTO • ADSORCION • INTERCAMBIO IONICO • EXCLUSION • Para retener la fase estacionaria líquida, en la mayoría de los casos esta se une física- o química-mente a un soporte sólido • EN CROMATOGRAFIA LIQUIDO/LIQUIDO:  Para evitar que se mezclen las fases, se usan dos líquidos no miscibles como fase estacionaria y móvil, uno polar y uno apolar.  F. est. polar /F. móvil apolar: Fase Normal  F. est. apolar/ F. móvil polar: Fase Inversa • Casos particulares Crom. Reparto: - Crom. en Papel y Crom. Liquida en Fase Inversa
  11. 11.  Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION: • PARTICION O REPARTO • ADSORCION • INTERCAMBIO IONICO • EXCLUSION • ADSORCION: Fenómeno de SUPERFICIE Los solutos se concentran sobre la superficie de un sólido Fase Estacionaria: SOLIDO ADSORBENTE • Centros activos en la superficie del sólido interac- cionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil. • Retención depende de área superficial, la cual depende del tamaño de partícula y de la superficie interna ido interaccionan con grupos polares de los solutos, los cuales son desplazados por la fase móvil. D. von Baer/C. Mardones 2008
  12. 12. • INTERCAMBIO IONICO: Intercambio estequiométrico de IONES de Muestra y Fase Móvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA. + + + + + + + + +  Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION: • PARTICION O REPARTO • ADSORCION • INTERCAMBIO IONICO • EXCLUSION Fase estacionaria: Matriz rígida en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva- o negativamente y contraiones de carga opuesta, susceptibles de intercam- biarse con iones de la misma carga contenidos en en la Fase Móvil, la cual suele ser una solución tamponada, SEPARACION se produce por competencia entre iones analito y de la Fase Móvil por los grupos ionizados de la Fase Estacionaria. D. von Baer/C. Mardones 2008
  13. 13. • EXCLUSION: Separación en función de tamaño molecular. Solutos más pequeños penetran más en poros de Fase Estacio- naria POROSA (tamiz molecular)  Según el PRINCIPIO QUE RIGE LA SEPARACION: • PARTICION O REPARTO • ADSORCION • INTERCAMBIO IONICO • EXCLUSION Fase estacionaria: Matriz inerte que contiene pequeños poros en los cuales pueden penetran más las moléculas más pequeñas y menos las más grandes. La retención depende del tamaño de las moléculas solvatadas y del tamaño de los poros. D. von Baer/C. Mardones 2008
  14. 14. FASE ESTACIONARIA DETECTOR FASE MOVIL tm > retardo< retardo< retardo COLUMNA D. von Baer/C. Mardones 2003
  15. 15. FASE ESTACIONARIA DETECTOR FASE MOVIL tm COLUMNA D. von Baer/C. Mardones 2008
  16. 16. FASE ESTACIONARIA DETECTOR FASE MOVIL tm > retardo< retardo< retardo COLUMNA D. von Baer/C. Mardones 2008
  17. 17. FASE ESTACIONARIA DETECTOR FASE MOVIL tm > retardo< retardo< retardo COLUMNA D. von Baer/C. Mardones 2008
  18. 18. Señal t CROMATOGRAMA INFORMACIÓN CUALITATIVA INFORMACIÓN CUANTITATIVA tM 0 1 2 3 D. von Baer/C. Mardones 2008
  19. 19. Señal t CROMATOGRAMA INFORMACIÓN CUALITATIVA INFORMACIÓN CUANTITATIVA tM tR1 0 1 2 3 D. von Baer/C. Mardones 2008
  20. 20. Señal t CROMATOGRAMA INFORMACIÓN CUALITATIVA INFORMACIÓN CUANTITATIVA tM tR1 tR2 0 1 2 3 D. von Baer/C. Mardones 2003
  21. 21. Señal t0 1 2 3 CROMATOGRAMA INFORMACIÓN CUALITATIVA INFORMACIÓN CUANTITATIVA tM tR1 tR2 D. von Baer/C. Mardones 2008
  22. 22. Señal t0 1 2 3 CROMATOGRAMA INFORMACIÓN CUALITATIVA INFORMACIÓN CUANTITATIVA tM tR1’ tR2’ tR1 tR2 tR ’ = tR - tM D. von Baer/C. Mardones 2008
  23. 23. Fase estacionaria Fase móvil PARAMETROS CROMATOGRAFICOS I. Factor de Retención (Factor de Capacidad) = tR – tM tM k tR = tiempo de retención tM = tiempo muerto (to ) Como tR’ = tR- tM = tR’ tM k tiempo del soluto en Fase Estacionaria tiempo del soluto no retardado en Fase Móvil Idealmente, k’ debe estar entre 2 y 10. En la práctica 1< k < 20 es satisfactorio. D. von Baer/C. Mardones 2008
  24. 24. D. von Baer/C. Mardones 2003 Para modificar k:  En HPLC modificando la proporción de modificador orgánico de la fase móvil EN GC:  Variando T°
  25. 25. = tR2’ tR1’ α para tR2’ > tR1’ = k2 k1 α para k2 > k1 o bien II. Factor de Separación (Factor de Selectividad) El factor de separación α describe la migración de un pico presente en la mezcla en relación al otro que sufre menos retardo  α > 1 α recomendable que 1.1 < α < 1.5 D. von Baer/C. Mardones 2008
  26. 26. = tR2’ tR1’ α para tR2’ > tR1’ = k2 k1 α para k2 > k1 Columna C-1 Columna C-8 o bien α (2,1) = 1.6 α (2,1) = 2.1 II. Factor de Separación (Factor de Selectividad) D. von Baer/C. Mardones 2008
  27. 27. = tR2’ tR1’ α para tR2’ > tR1’ = k2 k1 α para k2 > k1 ¿ Es igual la calidad de la separación en casos A y B ? o bien II. Factor de Separación (Factor de Selectividad) = tR2’ ( cte) tR1’ (cte) α D. von Baer/C. Mardones 2008
  28. 28. Señal t0 1 2 3 4 tR2 k y α = constantes, pero calidad separación no es constante tM tR1 Si tM, tR1 , tR2 = constantes III. Eficiencia N = Número de Platos Teóricos h w < ancho > eficiencia: deseable h w > ancho < eficiencia: NO deseable D. von Baer/C. Mardones 2008
  29. 29. Eficiencia N N = Número de Platos Teóricos Señal t 0 1 2 3 tR2 h 16 tR wb N = wb = ancho de pico en la base = 4 σ [ ]2 D. von Baer/C. Mardones 2008
  30. 30. Eficiencia N N = Número de Platos Teóricos Señal t 0 1 2 3 tR2 h 5,545 tR wh N = [ ]2 wh = ancho de pico a mitad de altura 16 tR wb N = wb = ancho de pico en la base[ ]2 D. von Baer/C. Mardones 2008
  31. 31. N = 14 HETP = 2 HETP N = 28 HETP = 1 HETP HETP = 4 N = 7 HETP > N,< HEPT = Mayor eficiencia < N, > HEPT = Menor eficiencia Altura Equivalente de Plato Teórico (HETP) Sección eficaz responsable de un equilibrio de intercambio = L N HETP L = largo columna N = número de platos teóricos HETP Fase móvilFase móvil Fase estacionaria L D. von Baer/C. Mardones 2008
  32. 32. A: Efecto de camino múltiple o de laberinto HETP = A + B/ µ + C . µ Ecuación de van Deemter µ= velocidad lineal media de la fase móvil M M M M M M • A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme • A NO depende del flujo de fase móvil A = 2 λ. dp λ = factor de empaque dp = diámetro de partícula D. von Baer/C. Mardones 2008
  33. 33. A:Efecto de camino múltiple M M M M M M HETP = A + B/ µ + C . µ Ecuación de van Deemter µ= velocidad lineal media de la fase móvil • A depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con partículas pequeñas de tamaño uniforme Forma partícula Partículas irregulares > A  < eficiencia Partículas esféricas < A  > eficiencia Incidencia Tamaño partícula D. von Baer/C. Mardones 2008
  34. 34. B: Difusión longitudinal o axial HETP = A + B/ µ + C . µ Ecuación de van Deemter µ= velocidad lineal media de la fase móvil t1 D. von Baer/C. Mardones 2008
  35. 35. B: Difusión longitudinal o axial B depende de: • DM= Coeficiente difusión soluto en Fáse Móvil: mucho > en un GAS que en un líquido  + importante en GC que en HPLC • ψ = Factor de obstrucción o tortuosidad (sólo en columnas empacadas,  0 en columnas capilares) HETP = A + B/ µ + C . µ Ecuación de van Deemter µ= velocidad lineal media de la fase móvil t1 t2 B/µ depende del flujo  a >µ < contribución de B/µ a la HETP  > Eficiencia Difusión longitudinal aumenta a medida que analitos permanecen más tiempo en la columna D. von Baer/C. Mardones 2008
  36. 36. C: Resistencia a la transferencia de masaC: Resistencia a la transferencia de masa HETP = A + B/ µ + C . µ Ecuación de van Deemter µ= velocidad lineal media de la fase móvil Equilibrio No equilibrio • Término C Ec. van Deemter se refiere a la transferencia de masa del analito hacia y desde la Fase Estacionaria. C * µ: aumenta directamente con el flujo a >µ > C µ y < Eficiencia Distribución del analito en situación de: D. von Baer/C. Mardones 2008
  37. 37. Efecto del flujo sobre el ensanchamiento del peak cromatografico HETP= A + B/µ + C*µ HETP C*µ A µ B/ µ Global Flujo óptimo Crom. de Gas Incidencia B mucho menor en Cromatografía Liquida que Gaseosa, pues DM es < en un líquido que en gas, pero Transf. Masa en Fase Móvil (Cm) adquiere > importancia. HETP µ Crom. Líquida D. von Baer/C. Mardones 2008
  38. 38. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases. Señal tR2 - tR1 D. von Baer/C. Mardones 2008
  39. 39. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: 2 tR2 – tR1 wb1+ wb2 Rs= Wb1 y Wb2 = ancho en la base de dos picos vecinos Rs = Resolución Señal tR2 - tR1 RESOLUCION: Medida cuantitativa de las separación entre dos analitos contiguos en el cromatograma, considerando los anchos de los peaks en sus bases. D. von Baer/C. Mardones 2008
  40. 40. PARA EVALUAR CALIDAD DE SEPARACION EN SU CONJUNTO: 2 tR2 – tR1 wb1+ wb2 Rs= Wb1 y Wb2 = ancho en la base de dos picos vecinos Ecuación Maestra de la Cromatografía Rs = Resolución Si Wb1 ≈ Wb2 Rs = ( )α - 1 α ( )k k + 1 ( )√ 4 N Rs = 1,0 —> 97,9 % separación = 1,25 —> 99,4 % separación = 1,5 —> 99,7 % separación > 2,0 —> separación TOTAL Si dos picos vecinos tienen tamaño similar D. von Baer/C. Mardones 2008
  41. 41. Influencia de la eficiencia sobre la resolución cromatográfica N = 712 Rs=1.0 N= 1.600 Rs=1.5 N = 2.844 Rs=2.0 N = 11.344 Rs=4.0 1:1 1:4 1:16 Rs=1.25 Rs=1.0 Rs=0.8 Rs=0.6 1:1 2:11:1 4:1 8:1 16:1 32:1 Resolución vs. proporciones de área de 2 picos vecinos 98 % 99,7 % Total Total D. von Baer/C. Mardones 2008
  42. 42. Influencia de α ( factor de separación) sobre la resolución cromatográfica α = 1.25 Rs (3,4) = 2.0 α = 1.15 Rs (3,4) = 1.2 D. von Baer 2002 C8 C18
  43. 43. Factor de Asimetría (Tailing) T = b0,1 / a0.1 (definición IUPAC) T idealmente = 1, en la práctica T > 1 D. von Baer/C. Mardones 2008
  44. 44. Nunca la primera separación es la mejor D. von Baer/C. Mardones 2008
  45. 45. Nunca la primera separación es la mejor D. von Baer/C. Mardones 2008
  46. 46. Nunca la primera separación es la mejor D. von Baer/C. Mardones 2008
  47. 47. Nunca la primera separación es la mejor Separaciones DEBEN OPTIMIZARSE D. von Baer/C. Mardones 2008

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