Diferenciación odontoblastos

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DIFERENCIACIÓN DE ODONTOBLASTOS

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Diferenciación odontoblastos

  1. 1. Fisiopatología PulparProfesor: Dr. Juan Carlos Munevar Presentado por: Jorge Gruber Diana Marín Postgrados Odontología Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougallTHE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July11, 2008
  2. 2. por experimentos DSPP Diferenciacion Odontoblastos BMP2 Ratones hipotesisHibridación in situ Expresión Mutaciones en Inmuno Histo forzada NF-Y o quimica. ADN de NF-Y Disminucion de Plásmido Eliminando fragmentos del BMP-2 promotor EMSA y CHIP Tiempo real RT- DSPP PCR Tiempo real Cultivo y Ensayo de Análisis cuantitativo tratamiento tranfeccion Western Blot celular transitoriaBMP2 NF-Y DSPP Via de señalización Expresion Diferenciación Odontoblastos Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  3. 3. Interacciones secuenciales Epitelio Dental Odontogénesis: y recíprocas Ectomesenquima Células Cresta Neural Craneal Odontoblastos*Dentinogénesis Estadios de cito diferenciación Gradientes temporoespaciales Se originan en el vértice de la cúspide principal y avanzan hacia la base del diente Expresión de genes específicos de la matriz extracelular dentinal Matriz orgánica 30% Colágeno y Proteínas no colágenas NCP Componentes inorgánicos 70% Hidroxiapatita Sialoproteína Dentinal DSP Fosfoproteína Dentinal DPP Modulador de la mineralización y formación de cristales de Sialofosfoproteína Dentinal DSP hidroxiapatita D’Souza R, 1997. Bone Mineral Res. •Thesleff I. 2003. J. Cell Sci. 116, 1647-1648 • Miletich I and Sharpe P. T. 2003. Hum Mol Genet. 1, R69 – R73
  4. 4. Un patrón especial Derivado Diferenciación y temporal que ODONTOBLASTO CCNC Mesenquimales origina la principal cúspide a avanza hacia la base del diente Factor de Activan TGF-β1 transcripción Intervienenheterotrimerico Y Superfamila NFY TGF-β3 Factor de Factores crecimiento COMO decrecimiento1-3 Acopla Proteína morfogenica ósea transformanteβ (BMP) SíntesisSecuencia de ADN Promueve Sialofosfoproteína Matriz orgánica CCAAT DENTINAL (DSPP) extracelular. 1-3. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  5. 5. •Presencia ramificaciones limitado por la membrana plasmática •Menor • Contiene componentes Radio tamaño cito esquelético Grande •Disminució • Presentan vesículas n capacidad CITOPLASMA secretora Rudimentario •Degeneraci PROCESO ón celular ODONTOBLASTICO RER • Muerte Basofilo celular Poco gradual CITOPLASMA desarrollado Extenso Asociado a ribosoma A. GOLGY RER Bien desarrollado supra anuclear GOLGY Nucleó BASAL NÚCLEOACTIVO JOVEN MADURO Goldberg M, Smith AJ, Cell and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis for repair and tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med. 2004 : 15;13-27
  6. 6. DSP ARN P II Gen DSPP DPP NH2 COOH ADN CCAAT 3’ 5’ ARNm E I E I E I E I E I E 5’ 3’ DSP DPP Splicing EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON 4 EXON 5 Eliminación de intrones5’ 3’ Heterogeneous mutations of human DSPP are associated with dentinogenesis imperfecta type II (DGI-II), type III (DGI-III), and dentin dysplasia type II (DD- II) (15–19). Biological function of DSPP during tooth development has been confirmed by DSPP knock-out mice. D’Souza, R. N., Cavender, A., Sunavala, G., Alvarez, J., Ohshima, T., Kulkarni, A. B., and MacDougall, M. (1997) J. Bone Miner. Res. 12,2040–2049
  7. 7. hDSPP EXPRESIÓN ODONTOBLASTO EXPRESIÓN PREAMELOBLASTO PERMANENTE TRANSITORIA DENTINOGENESIS IMPERFECTA II Función DG-II DSPP MUTACIONES MUTACIONES DISPLASIA DENTINALHETEROGENEAS 15-19 DD-II Ratones DSPP knock-out DENTINOGENESIS IMPERFECTA III ODONTOGENESIS & DG-III MINERALIZACIÓN * DENTINOGENESIS * DIFERENCIACIÓN ODONTOBLASTOS 15.Xiao, S., Yu, C., Chou, X., Yuan, W., Wang, Y., Bu, L., Fu, G., Qian, M., Yang, J., Shi, Y., Hu, L., Han, B., Wang, Z., Huang, W., Liu, J., Chen, Z., Zhao, G., and Kong, X. (2001) Nat. Genet. 27, 34520 19- Sreenath, T., Thyagarajan, T., Hall, B., Longenecker, G., D’Souza, R., Hong, S., Wright, J. T., MacDougall, M., Sauk, J., and Kulkarni, A. B. (2003)J. Biol. Chem. 278, 24874–24880
  8. 8. DIFERENCIACIÓN ODONTOBLASTO ATLAS DE LA MORFOGÉNESIS DENTAL ¿DIFERENCIACIÓN DEL ODONTOBLASTO? REGULADA FACTORES DE FACTORES DE CRECIMIENTO TRANSCRIPCIÓN BMPs (superfamilia TGF B) BMP2 OSTEOGENESIS 26 DÍA 13 EXPRESIÓN EPITELIO DENTAL Promueve la DESPUÉS SU EXPRESIÓN CAMBIA A LA PAPILA DENTAL diferenciación INCREMENTA EN DENTINOGENESIS29 de las células Stem BMP2 determina el destino de las BMP2 Mesenquimales células ectomesenquimatosas. DSPP SE EXPRESA INTENSAMENTE a osteoblastos EN ODONTOBLASTOS. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN FUNCIONES IMPORTANTES DURANTE RUNX2/SMAD27 LA ODONTOGENESIS 3026. Chen, D., Zhao, M., and Mundy, G. R. (2004) Growth Factors 22, 233–241 27. Reddi, A. H. (1997) Cytokine Growth Factor Rev.8, 11–20 28. Ducy, P., and Karsenty, G. (2000) Kidney Int. 57, 2207–2214 29. Venezian, R., Shenker, B. J., Datar, S., and Leboy, P. S.(1998) J. Cell Physiol. 174, 331–341 30. De Luca, F. D., Barnes, K. M., Uyeda, J. A., De-Levi, S., Abad, V., Palese, T., Mericq, V., andBaron. J. (2001) Endocrinology 142, 430–436
  9. 9. UNE PROMUEVE TGF-β1 O BMP2 Receptor FC FOSFORILACION ACTIVANDO COMPUESTODominio regulador N terminal y Dominio Proteína RAS cinasa C terminal RAF UNE ESTABILIZADO ACTIVANDOFOSFORILA FOSFORILA Serina P 14-3-3 Proteína 14-3-3 Dominio R N Terminal Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  10. 10. Separándose del HIDROLIZA FOSFORILA MEK RAS RAF activado EXPONE Tirosina 185 DESESTABILIZA Treonina 183 El labio de MAPc MAP CinasaFOSFORILA MEK Dimerización al ACTIVA Factores de núcleo transcripción Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  11. 11. NF-YA Complejo NF-Y COMPONE SUBUNIDADES NF-YB NF-YC En orden de secuencia Homologo DE NF-YB de ADN H2A Y H2B NF-YC Histona NECESARIO CCAAT Expresión UNE de genesHETERODIMERIZACION como el NF-YA ¨colágeno¨ Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  12. 12. NFY-B y NFY-C ADN Secuencia de nucleotidos 3’ 5’ Homologa Histonas H2A y H2B ADN Secuencia de nucleotidos Heterodimerizacion 3’5’ NFY-B NFY-C NFY-A CCAAT 3’ 5’Kim, I. S., Sinha, S., de Crombrugghe, B., and Maity, S. N. (1996) Mol. Cell Biol. 16, 4003–4013 Liberati, C., di Silvio, A., Ottolenghi, S., and Mantovani, R. (1999) J. Mol. Biol. 285, 1441–1455Bhattacharya, A., Deng, J. M., Zhang, Z., Behringer, R., de Crombrugghe, B., and Maity, S. N. (2003) Cancer Res. 63, 8167–8172
  13. 13. Es realizada por los odontoblastos, los cuales forman tres tipos de dentina fisiológicas. La dentina primaria y la dentina secundaria no presentan ningún tipo de diferencia histológica exceptuando la interface entre ambos tejidos.La dentina terciaria es sintetizada debido a respuestas mecánicas, térmicas o traumáticas. Goldberg M, Smith AJ, Cell and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis for repair and tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med. 2004 : 15;13-27
  14. 14. ESTADIOS TEMPRANOS ESTADIOS TARDÍOS DE DE LA DENTINA LA DENTINA VÍA DE LA MAPquinasa ( TGF beta) y ( FGF) colágeno tipo I, (BMP4) Generar la matriz de la (DMP1) dentina (DSPP) (TGF-BETA1) . S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular Characterizacion of young and mature odontoblasts: Bone
  15. 15. DENTINA SECUNDARIAExpresión de genes colágeno tipo I y DSPP Deposición activa de dentina De expresión de DMP1( fosfoproteína de la matriz de la dentina) De expresión IBSP ( sialoproteina del hueso) SPP1 (fosfo proteina secretada 1) La concentración de fosfatasa alcalina Amelogina transcriptasa Y influenciar en la deposición dentinaria S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular Characterizacion of young and mature odontoblasts: Bone
  16. 16. Receptor proteína serina / treonina quinasas Receptor I – fosforila II Activa al factor de transcripción SMAD Fosforila y trasloca al núcleo Expresión génicaLa Célula; Geoffrey M. Cooper y Robert E. Hausman; 4 edición; 2008
  17. 17. Muerte del GENERACIÓN Odontoblastoodontoblasto secundario DIFERENCIARAN • Célula Madre Células •Fibroblasto progenitoras • célula sub odontoblasticas SECRETAN • Celula Mesenquimaticas indiferenciadas de la pulpa Matriz dentinaria S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular Characterizacion of young and mature odontoblasts: Bone
  18. 18. DENTINA TERCIARIAFactores de crecimiento Expresados en procesos de desmineralización Familia de TGF- β TGF-β1 y el TGF -β3, S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular Characterizacion of young and mature odontoblasts: Bone
  19. 19. Diferenciación de células SEÑALIZACIÓN CONTROLA Vía de Activador de odontoblasticas trascripción proteína ( AP-1) ESTIMULA FORMADAS la transcripción Familia de proteínas osteocalcina ( JUN-FOS-ATF) fosfatasa alcalina INTERVIENEN colágeno Células pulpares •Diferenciación forman una línea • Proliferación de células • transformación reparadoras
  20. 20. Via de la AP-1 Compuesta Proteínas DSPP Fos Jun ATF Formar C-Jun, Jun-B y Jun D Expresión genes ayuda Homodimeros o Heterodimeros cofactor transcripcional p300 ( fosfoproteína nuclear)Narayanan K, Srinivas R, Peterson MC, Ramachandran A, Hao J, Thimmapaya B,Scherer PE, George A.J Biol Chem. 2004 Oct 22;279(43):44294-302. Epub 2004 Aug 11.
  21. 21. Uniones celula-celula pueden ser :Uniones GAP son: Compuestas por proteínas Conexina 6 de estas forman un conexon Especializadas Interviene en mineralizacion-citodiferenciacion y respuesta intracelular Contienen vías intracelulares de transferencia de iones y metabolitos solubles Se presenta en la superficie de el odontoblasto Unión entre citoplasma- citoplasma La Célula; Geoffrey M. Cooper y Robert E. Hausman; 4 edición; 2008
  22. 22. Uniones celula-celula pueden ser :Uniones Desmosomicas contiene 2 proteínas ( cadeina especializada) desmocolina y desmogleína Forman placas citoplasmáticas gruesas Interactúan con filamentos intermedios Se unen a distintas fibras cito esqueléticas
  23. 23. OBJETIVO DEMOSTRAR SI LA BMP2 REGULA LATRANSCRIPCIÓN DEL GEN DSSP Y POR LO TANTO LA DIFERENCIACIÓN DEL ODONTOBLASTO
  24. 24. Preparación de animales y tejidos:Los ratones ICR fueron adquiridos por el Laboratorio Harlan deAnimales S.A. (Indianápolis, IN).Los tejidos de ratones de diferentes edades fueron recuperados ypreparados para ensayo de hibridación in situ y aislamiento RNA. Institutional Animal Care Texas Health Science Center Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martínez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  25. 25. Cultivo y Tratamiento Celular: Luego cultivadas en un medio mínimo esencial sin suero y estimulados con 100ng/ml de BMP2 humana recombinante en presencia o ausencia de cicloheximida ( Inhibidor de la biosíntesis de proteína) (CHX) (10 µg/ml) de 0 a 72 horas Los niveles expresivos de la subunidad NF-Y, de la DSP, y de las proteínas β-actinas ( Controla la expresion de genes constitutivo) utilizados como control. se analizaron por el análisis de secado Western. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  26. 26. es un método para la detección de proteínas de una muestra de un tejido homogeneizado . Implementa gel electroforesis para separar proteínas desnaturalizadas de la masa.Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  27. 27. 1. La muestra es colocada en la matriz ( gel de electroforesis)2. Se tranfiere las bandas de la electroforesis a la membrana de western blot.3. Se usan acidos con el fin de precipitar las bandas4. Se agrega anticuerpos para la inmuno identificasion de las bandas de interés. http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf
  28. 28. Western Blot transfección Después transitoria expresiónMD10- F2 Plásmido NF-Y 72 h lavadas transferidas Gel electroforesis Trans-Blot lisadas SDS-PAGE gel Detección proteínas de anticuerpos Cabra de β-actina Antiratón Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,JuanDong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  29. 29. ADN plásmido  construye p1243 ( longitud de los fragmentos) los fragmentos 5 a 3 Bgl II y Hind III, ( enzimas de restricción) entre nt ( secuencia de nucleótidos) -1.243 y +54 del promotor del gen DSPP del ratón.  El P241 a partir de un fragmento 295-BP KpnI y Hind III entre NT-241 y +54.  El p791fue igualmente generado a partir de un fragmento de entre nt-791 y +54 NT contiene XhoI y sitios Hind III.  El p97 a partir de un fragmento de 151-BP Bam HI y Hind III. entre NT -97 y + 54, y el p72 a partir de un fragmento de 126- BP Xba I y Hind III entre -72 y +54.Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong,Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  30. 30. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  31. 31.  Se creo la mutación plásmido, p97mut, este fue generado por la génesis de mutación específicamente situada en el ADN p97 que fue construido como molde. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  32. 32. Ensayo de transfección transitoria: Los plásmidos para le estudio, el plásmido mutante P97 y los básicos PGL-3( plásmidos de control) fueron transfectados en las células MD10-F2 utilizando el reactivo Lipofectamina . ( reactivo que ayuda a la trasfeccion) Dos días después de la transfección, las células fueron embebidas en suero durante 12 horas. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  33. 33.  fueron añadidos 100 ng/ml de BMP2 recombinante humano durante 12 Se retira el suero. Para inhibir el efecto de la BMP 2 se agregaron dosis de Noggin (5-20µg/ml) ( inhibidor). Apartir de la actividad de la luciferasa ( vector de plásmido) genera fluorecencia dando los resultados. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  34. 34.  Primero se separaron los extractos nucleares de la célula MD10- F2 Segundo se midió la concentración de proteínas utilizando la técnica de Bradford la cual debe realizarse rápidamente, esta utiliza la capacidad de atascamiento entre las proteínas del tinte Coomasie g-250 el cual tiene un máximo de absorbencia de 595nm. Después se empezó a realizar el EMSA el cual es un estudio de electroforesis en el que a las proteínas a estudiar se les agrega otra proteína y un anticuerpo aumentando su peso, entonces cuando esta proteína corra por el gel de agarosa va a tener un sobre corrimiento (retardo mayor), de esta forma se confirma la identidad y presencia de la proteína. “La proteína utilizada fue la [ -32P]ATP y quinasa de polinucleótido T4 y se purificaron en un 15% en gel de poliacrilamida. “ Bioquimica, Thoma M Devlin, edición: 4, editorial Reverte- 2004 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich§, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  35. 35.  Las proteinas cubiertas y libres de complejos de ADN fueron cargadas dentro del Gel de poliacrilamida nativo en el bufer 1x Tris/ácido bórico/EDTA(TBE) electroforisadas, secadas, y expuestos a la placa radiográfica. Experimentos de cambios considerables de anticuerpos fueron realizados con anticuerpos específicos para las sub unidades NF-YA, NF-YB, y NF-YC. Estos anticuerpos se añadieron a los extractos nucleares 10 minutos antes de la adición de la sonda radiactiva. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich§, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  36. 36. Es un estudio histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible.sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejocon el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  37. 37. INMUNOHISTOQUÍMICA Cultivadas MD10-F2 placas de vidrio con BMP2 100 ng/ml sin enjuagaron acetona fría PBS Fijan y enfriado por hielo metanol 10 min. expresión DSPPDetección Inmunohistoquímica DSPcuantitativa fluorescente anticuerpos NF-Y Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  38. 38. INMUNOHISTOQUÍMICA Toda la noche 1:100 disoluciónIncubación Anticuerpos 4°C primarios lavado PBS agregación Obtención imágenes cuantifico Software microscopio anticuerpos secundariosMetaMorph Olympus con Alexa fluo Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  39. 39. Identifica los vínculos entre el ADN y proteínas monitoreando la regulación de la transcripción de a través de la modificación de las histonas o interacciones de unión factor de transcripción al ADN.Este tiene la capacidad para capturar una imagen instantánea de las interacciones proteínas específicas al ADN que se presentan en un sistema y cuantificar las interacciones utilizando el (PCR). Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  40. 40. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP) EstabilizaciónPaso 1 entrecruzamiento: complejos de proteínas y ADN celulas MD10-F2 Con y sin BMP2 En vivo complejos de penetra entrecruzamientoAnálisis estabilizan proteína con y de ADN bloqueando formaldehído al 1%, Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  41. 41. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP)Paso 2: Lisis Celular AND + Proteína Extrae Agrega Reactivo NE-PER Separar Sensibilidad Núcleo de citoplasma aumenta Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  42. 42. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP) analizar Unión proteínasPaso 3: Corte de Cromatina cortar ADN extraído mecánicamente Fragmentos de Sonificacion 200-800pb. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  43. 43. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP)Paso 4: Aislar Histonas específica modificadainmunoprecipitación: Factor de transcripción Co-factor de interés agregar Anticuerpos de CHIP-validados aislar immunoprecipitar Antígeno +Anticuerpo Lo complejos de otrosanticuerpo de resina componentesvinculantes G Agarosa. con purificados nucleares Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  44. 44. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP) RevertirPaso 5: entrecruzamiento revertido y limpieza de ADN enlaces Proteínas + ADN mediante calor extenso por 5 horas a 65°C Con tratado Material 200 mm de NaCl Proteinaza K recuperado 10mg de ARNasa Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359– 19370, July 11, 2008
  45. 45. INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA (CHIP)Paso 6: Amplificación de ADN PCR 1er ciclo 95°C durante 4 minutos 2do ciclo 95°C durante 30segundos 3er ciclo 58°C durante 40segundos 4to ciclo 72°C durante 2 minutos Se repitió 32 o 36 ciclos. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  46. 46. Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción Reversa (RT-PCR)Metodo enzimatico de sintesis in vitro de multiples copias en forma de AND De una secuencia de ARN Transcriptasa reversaDenaturalization Mezcla de Agrega nucleotidos ARN Sintetiza Inhibidor de la ARNasa AND MgCl2 Complementaro Observar el gen de donde proviene la proteina PCR tiempo real Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  47. 47. Primers NF-YA, NF-YB y NF-YAAmplificar y agrega DesoxirribonucleótidosCuantificar ADN Buffer ADN polimeraza Termo estable fluoróforo (SYBR Verde) Termociclador Fluoresencia Con sensores de fluorescence mide Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  48. 48. Calentar y enfriarTermocicladorABI 7500 Ciclos Muestras Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 30 seg a 1min a 94°C 7 min a 72°C 58 y 60°C, 1 min a 72°C Reducir ruidos Separacion Alineamiento ADN Presencia Ac Nucleicos Primers polimeraza dimeros Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  49. 49. coloco teñidoADN Gel electroforesis de agarosa Bromuro de etilio 1.5% mediante Pelicula se observó fotografio luz fotografica SYBR Verde ultravioleta calculo Valores utilizando Mayor +rapida amplificacion software SDS2 expresion Menor + lenta amplificacion expresion Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  50. 50. La fosfatasa alcalina es una enzima, una proteína que ayuda a la función celular. Se encuentra en concentraciones elevadas en las células formadoras de los huesos y en el hígado, esta se encuentra elevada cuando hay crecimiento óseo y dentinogénesis. La actividad de la fosfatasa alcalina cuantitativos (ALP) de las células lisadas fue realizada utilizando fosfato ρ-nitrofenil como sustrato. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  51. 51. ANÁLISIS FOSFATASA ALCALINAConcentración determinó análisis reactivo de método de la proteína BCA colorimétrico proteínas (Pierce) unión proteína + complejo cromóforo-metal condiciones acídicas interacciona determinar Concentración Residuos proteínas Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  52. 52. La BMP2 estimula la expresión de la DSPP en las células MD10-F2 MD10-F2Preodontoblastos añadió inducir BMP2 (100ng/ml) DSPP Misma familia de ratón induce expresión sialoproteina óseaBMP2 (100ng/ml) genética (BSP) Otros estudios EN Ligamentos Las células periodontales del folículo dentalShuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  53. 53. RESULTADOS qRT-PCR Expresión RNAm de la DSPP •3.7 en 12 horas 100 ng/ml •2.7 en 24 horas •2.4 en 48 horas •1.7 en 72 horasShuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  54. 54. B- actina ciclofilina Gen constitutivo Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  55. 55. RESULTADOSInmuno fluorescencia cuantitativa Expresión de proteina DSPP en el citoplasma Acumulación de DSPP en el núcleo El máximo nivel de expresión DSSP fue a las 24 horas después de la estimulación de la BMP2Sin Ac DSPP Celulas IGG1 Grupo control negativo Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  56. 56. RESULTADOSIdentificación de un elemento de respuesta de laBMP2 en el promotor de gen DSSP en el ratón Transfección transitoria ADN plásmido, comparación con y sin BMP2 P1243. 1.6 veces la actividad transcripción P791. 1.9 veces la actividad transcripción P241. 1.8 veces la actividad transcripción p97 .3,2 veces la actividad transcripción p72 . resistente a estimulación estos resultados indican que el elemento Grupo control : de respuesta de la BMP2 reside entre NT 1 vez -97 y -72 en el promotor de la DSPP del P: < 0,05* ratón P: < 0,001 ** Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  57. 57. RESULTADOSUnión de complejos NF-Y al elemento de respuestade la BMP2 en el promotor de gen DSSP en el ratón Sonda EMSA Identificar los factores de transcripción que unen al elemento de respuesta BMP2 entre NT -97 y -72, AP-1 (FOS/jun), NF-kB,GATA, AP-3, NF-Y, el CP2, CCAAT y C/EBP Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  58. 58. RESULTADOS El resultado muestra Complejo proteína + ADN de 50 y 100 excesos molares La sonda de tipo salvaje y NF-Y compitieron indicando que si se CARRILES DE LA SONDA EMSA expresa la NF-yShuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-HsiuChuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  59. 59. RESULTADOS Se confirmo que la secuencia de ADN en el elemento de respuesta de la BMP2 contiene un sitio de unión NF-Y superposición de anticuerpos de sub Unidades NF-Y. Extractos nucleares MD10-F2 luego con sondas de tipo salvaje etiquetadasShuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  60. 60. secuencias promotoras de DSPP de nucleótidos de ratones se muestran de NT- 100 a-66. Varios posibles factores de transcripción de sitios de unión presentes en este elemento. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  61. 61. RESULTADOS Ensayos de CHIP ADN purificado fue utilizado como molde para PCR, utilizando cebadores correspondientes a la región de acompañamiento de la DSSP 5’ del ratónCebadoresespecíficos Cebadores específicos Caja de unión NF-Y Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  62. 62. RESULTADOS Producto 181-BP de la PCR se amplificó partiendo de un fragmento de ADN inmunoprecipitado por anticuerpo NF-YB Carril 2: muestra un control negativo, Carril 3: muestra el anticuerpo TFIIB ligado al sitio de unión TFIIB en la región promotora GAPDH. Control positivo Carril 4: muestra de ADN de entrada amplificada por primers de la DSPP del ratón. Carril 5: muestra los objetivos de DSPP que fueron efectivamente inmunoprecipitados por el anticuerpo NF-YB Estos resultados indican que la NF-Y físicamente se une a la caja invertida del CCAAT en el promotor in vivo de la DSPP del ratón. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  63. 63. RESULTADOS Expresión de la DSPP, la BMP2 y del NF-Y durante desarrollo del diente hibridación in situ E15 expresión RNAm de la BMP2 en la papila y no de DSPP E16 RNAm de l en odontoblastos y preodontoblastos en la fase folicular (PN) 1 expresión de DSPP y BMP2 siendo mas abundante BMP2 En PN3 y 2 semanas aun se veían expresiones De DSPP y BMP2 BMP2 era relevante a la expresión de la DSPP durante las últimas etapas de la diferenciación y maduración de odontoblastos Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  64. 64. RESULTADOS Actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) MD10-F2 BMP2 3 o 6 días tratadas o no por Mayor expresión de ALP con BMP2 BMP2 promueve la diferenciación celular MD10-F2 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  65. 65. RESULTADOS extraídoRT PCR RNA 2, 10 y 13 semanas PN midió expresión de RNAm sub unidades NF-Y utilizo cebadores específicos Las tres subunidades de NF-Y se expresaron en las células MD10-F2 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  66. 66. RESULTADOSLa BMP2 regula la expresión del NF-Y en las células MD10-F2 qRT-PCR •NF-YA mRNA alcanzo su maximo a 24 H •NF-YB mRNA alcanzo su maximo a 12 H •NF-YC mRNA alcanzo su maximo a 12 H Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  67. 67. RESULTADOSEl ensayo de Inmuno fluorescencia NF-YA Núcleo 12 horas y continuó durante 72 horas localización celular NF-YB de Punto máximo en núcleo a las 24 horas subunidad de NF-Y. NF-YC 24 y las 48 horas y disminuyo acumulación nuclear por 72 h Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  68. 68. RESULTADOS Inhibición del efecto de la BMP2 sobre inhibidor síntesis de proteínas la expresión NF-Y de la cicloheximida cicloheximida con o sin observó regulacion expresion subunidad DSPP por NF-Y la BMP2 Estos resultados sugieren que la BMP2es necesaria para la síntesis de la proteína NF-Y Disminución en ambas Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 12 a 72 horas 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  69. 69. RESULTADOSEl sitio de unión NF-Y es requerido para la actividad promotora delDSPP mediada por la BMP2 Sonda no interactúa mutada con NF Y NO Sonda interactúa mutada con NF Y Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  70. 70. RESULTADOS responde p97 No estimulación mutada de BMP2 p97Mutada No responde estimulación de BMP2 Control pGL3Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  71. 71. RESULTADOS Comparación de la DSSPP con y sin bloqueo de la BMP 2 mediante el noggin Expresión génica de la DSPP mediada por la BMP2 a través de la señalización NF-Y y el CCAAT es importante, no sólo para la unión NF- Y, sino también para la expresión de la DSPP mediada por la BMP2 en las células preodontoblastos de ratón Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, LeiChen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  72. 72. BMP2 desempeña un papelimportante en la La señalización de la BMP2diferenciación dental, así induce a la diferenciacióncomo en el desarrollo de de células mesenquimalesdientes y en el crecimiento. en odontoblastos Lindhe, 2009 Iohara, K., Zheng, 2006 En este estudio, hemos identificado un factor de transcripción del sitio de unión NF-Y en el promotor proximal de la DSPP del ratón que media la estimulación de la BMP2 sobre la expresión DSPP. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  73. 73. La expresión genética DSP aumenta DSPP se ha caracterizado como un durante la dentinogenesis y el marcador unico de la patrón del gen de la DSSP se diferenciación de odontoblasto encuentra muy restringido a los D’Souza 1997 tejidos dentales D’Souza 1997Se mostro que la BMP2es relevante para laexpresión genética de la Se mostro que las Indicando que la BMP2DSPP y para la BMP2 auto regulan la promovió ladiferenciación de expresión de la DSPP diferenciación deodontoblastos de y de los genes ALP preodontoblastos. en las células MD10- Además la DSPP se F2 acumula en el núcleo en respuesta a la BMP2 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  74. 74. Encontró el dominio DPP de laDSPP auto reguladora de huesos y Aunque siguen siendodientes, a través de los genes desconocidos los mecanismosrelacionados con la integrina / moleculares de la acumulaciónvías de señalización Smad y MAPK nuclear de la DSPP en respuesta a Jadlowiec, 2004 la BMP2 Se ha informado de que la expresión de la BM2 estimuló la BMP y los genes de osteocalcina y promovió la diferenciación de células mesenquimales a células osteoblásticas (Runx2/Smad) mediada a través de la vía de transducción de señales Ducy. Banerjee, 2001 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  75. 75. MAPK participa también enrespuesta a la BMP2 y regula laBMP y las expresiones del gen de la Se observo que hay presencia de unosteocalcina en el folículo dental y papel potencialmente importante enen las células del ligamento la regulación transcripcional deperiodontal genes DSPP. Zhao, 2002 Sin embargo, no se ha descartado que otros elementos reguladores en el promotor de la DSPP del ratón estén expuestos a responsabilidad de la BMP2 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  76. 76. Utilizando anticuerpos contra tres EMSA nos indico que el factor de subunidades NF-Y en experimentostranscripción NF-Y se une a este de anticuerpos ultra cambiantes. seelemento de respuesta de la BMP2 en el mostró que las NF-Y especialmentepromotor de la DSPP del ratón se unen a CCAAT dentro del elemento de respuesta de la BMP2la expresión de cada subunidadde NF-Y se ha visto en células Los ensayos ChIP in vivoMD10-F2 y en los tejidos del también demostraron que lasdiente del ratón en las diferentes NF-Y es enganchada a CCAATetapas de desarrollo de losdientes Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  77. 77. El NF-Y se compone de tres El NF-Y es un complejo de subunidades, NF-YA, NF-YB y NF-YC. proteínas heterotriméricas que Las subunidades A y C se asocian a se une a la figura CCAAT través de un subdominio que se une el encontrada en el promotor de ADN y se asemeja a la estructura muchos genes eucariotas helicoidal α, encontrada en las Lyons, K. M.,1990 proteínas histonas básicas Kim, I. S.,1996La actividad de transactivación delNF-Y está mediada por la asociación Se indica que el NF-Y es capaz dede los heterodímeros A/C con la modificar la estructura de lahistona acetiltransferasa P/CAF (47) y cromatina, activando su genpor la asociación de la subunidad A objetivo de expresión.con el P300. Faniello, M. C.,1999 Currie, R. A. 1998 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  78. 78. NF-Y ha sido reportado como una proteína reguladora que demostró que el suero reguló el responde a varios estímulos enlace del NF-Y a los promotores de moleculares varios ciclos genéticos celulares en las células y que activó sus Caretti, G.,2003 expresiones genéticas Sjin, R. M.,2002 Nuestro estudio muestra que la BMP2reguló los genes de expresión del NF- Y y activó la acumulación nuclear de las subunidades NF-Y incrementando lo que sugiere que la BMP2 regula la unión a la cromatina de la CCAAT la síntesis del NF-Y. en el promotor de la DSPP en las células MD10-F2 del ratón Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  79. 79. Además de la regulación de la El mecanismo por el cual los factores de expresión del NF-Y, también crecimiento como la BMP2 median la observamos que la BMP2 indujo la translocación nuclear del NF-Y sigueacumulación del NF-Y en el núcleo siendo desconocido. de las células MD10-F2 Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008
  80. 80. CONCLUSIONES Se encontró la primera evidencia de que la BMP2 activa la transcripción de genes DSPP a través de señalización NF-Y, y este patrón BMP2-NF-Y- DSPP desempeña un papel importante en la diferenciación de odontoblastos. La expresión de la DSP es de gran importancia durante la dentinogenesis por lo cual es muy importante el gen de la DSPP La DSPP se acumula en el núcleo en respuesta a la BMP2
  81. 81. CONCLUSIONESAlteraciones en el gen de DSPP pueden afectar tanto la diferenciación odontoblastica como la dentinogenesis. Podemos concluir que la BMP2 es necesaria para la síntesis de la proteína NF-Y Se confirmo que la secuencia de ADN en el elemento de respuesta de la BMP2 contiene un sitio de unión NF-Y
  82. 82. Siguen siendo desconocidos Los mecanismos moleculares de laacumulación nuclear de la DSPP en respuesta a la BMP2 por lo cual serecomienda hacer investigaciones. Se sugiere realizar investigaciones que identifiquen los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de células dentales, en particular la diferenciación de odontoblastos.
  83. 83. Se debe investigar para buscar aplicaciones clínicas de cómo utilizar elBMP2 para estimular la diferenciación de odontoblastos y por ende la producción de dentina Deben realizarse investigaciones sobre el El mecanismo por el cual los factores de crecimiento como la BMP2 median la translocación nuclear del NF-Y.

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