UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI BARI FACOLTA' DI
SCIENZE BIOTECNOLOGICHE
Corso di laurea triennale in
Biotecnologie Sanitarie e...
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INDICE
1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO........................................................2
2. SINTESI DEL CONTEST...
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1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO
I segnali mediati dal calcio (Ca2+
) citosolico controllano un'ampia gamma di funzioni...
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Figura 1: Meccanismi postulati per l’attivazione
dei SOCs da parte di STIM1 (Spassova MA et
al., 2006)
sua deplezione si...
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Inoltre, il meccanismo del SOCE è implicato nella regolazione di numerosi processi
cellulari fondamentali come la migraz...
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metastatiche del cancro. Questo apre a nuove potenziali strategie terapeutiche per il
trattamento dei tumori metastatici...
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Figura 2: Struttura dei tre membri della famiglia genica di
p53
nel mantenimento dell'integrità genomica, mentre p63 e p...
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di oligomerizzazione, che permette la formazione di oligomeri, rendendo le proteine
funzionalmente attive. Nelle isoform...
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p53 come p21 e GADD45) e le funzioni biologiche di p53 (induzione arresto ciclo
cellulare e apoptosi). È stato visto, in...
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Per verificare se le p53REs presenti nei geni STIM1 e STIM2 rispondano
all'attivazione trascrizionale da parte dei membr...
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Campione Bianco
Buffer (5X → 1X) 10 μl 10 μl
MgCl2 (25 mM → 3 mM) 6 μl 6 μl
DNTP (10 mM → 0,2 mM) 1 μl 1 μl
Primer FOR ...
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4) Centrifugare a 14000 rpm per 1 min ed eliminare l’eluato.
5) Aggiungere 700 μl di Membrane Wash Solution complementa...
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funzione di enhancer o di silencer (Figura 3).
Figura 3: Rappresentazione schematica del vettore pGL3 basic e del vetto...
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STIM2, si ricava il volume di frammento (concentrato 13,1 ng/μl) nel modo
seguente:
Quindi si è allestita la reazione d...
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agitazione a 200 rpm per consentire l’espressione dei geni necessari alla
selezione (in particolare Ampr
ovvero resiste...
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10. Ripetere il lavaggio usando 250 μl di Column Wash Solution e centrifugare a
velocità massima per 2 min.
11. Trasfer...
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rpm per 5 minuti al fine di pellettare le cellule.
6. Risospendere il pellet di cellule nel volume adeguato al numero d...
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5. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
6. Aggiungere la miscela di trasfezione ai corrispondenti pozzetti delle...
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inattivare prima LUC.
Le differenti origini evolutive di queste due luciferasi sono alla base delle differenze
di strut...
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4. RISULTATI E CONCLUSIONI
Per verificare se l'espressione dei geni STIM1 e STIM2 è regolata dai membri della
famiglia ...
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fortemente la trascrizione dalle dieci alle venti volte più del controllo (Figura 4a).
Figura 4: a) Istogramma relativo...
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p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla prima p53RE di STIM1
nel vettore pGL3 Basic. b) Isto...
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target differenti.
I saggi di luciferasi sono solo il primo passo per dimostrare la modulazione
dell’espressione di gen...
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5. BIBLIOGRAFIA
1) CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Vig M, Peinelt C, Beck ...
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Tesi di Laurea Triennale Sperimentale in Biologia Molecolare di Alessandro Renato Ferrari

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Studio del ruolo dei membri della famiglia genica dell'oncosoppressore p53 nella modulazione dell'espressione dei geni STIM1 e STIM2.

  1. 1. UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI BARI FACOLTA' DI SCIENZE BIOTECNOLOGICHE Corso di laurea triennale in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Tesi di laurea sperimentale in Biologia Molecolare Studio del ruolo dei membri della famiglia genica dell'oncosoppressore p53 nella modulazione dell'espressione dei geni STIM1 e STIM2. Relatore Chiar.ma Dott.ssa Anna Maria D'Erchia Correlatore Chiar.ma Dott.ssa Apollonia Tullo Chiar.mo Dott. Mariano Francesco Caratozzolo Laureando Alessandro Renato Ferrari Anno Accademico 2009-2010
  2. 2. 1 INDICE 1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO........................................................2 2. SINTESI DEL CONTESTO APPLICATIVO......................................................5 3. DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ SVOLTA.....................................................9 3.1 Amplificazione delle p53REs mediante PCR ....................................… 9 3.1.1 Purificazione degli amplificati da gel di agarosio............................... 10 3.1.2 Reazione di ligazione.......................................................................... 12 3.1.3 Trasformazione di cellule competenti con i vettori ricombinanti ....... 14 3.1.4 Estrazione del DNA plasmidico.......................................................... 14 3.2 Saggi di luciferasi .................................................................................... 15 3.2.1 Colture cellulari .................................................................................. 15 3.2.2 Piastramento della linea cellulare H1299 (p53 -/-)............................. 16 3.2.3 Trasfezione della linea cellulare H1299.............................................. 16 3.2.4 Saggio Reporter .................................................................................. 17 4. RISULTATI E CONCLUSIONI..........................................................................19 5. BIBLIOGRAFIA..................................................................................................23
  3. 3. 2 1. SINTESI DEL PROGETTO FORMATIVO I segnali mediati dal calcio (Ca2+ ) citosolico controllano un'ampia gamma di funzioni cellulari che vanno da risposte a breve termine, come la contrazione e la secrezione, a regolazioni a lungo termine, come la crescita cellulare e la proliferazione. Nelle cellule non eccitabili, il signaling mediato dal Ca2+ è tipicamente avviato dalla produzione (in risposta ad attivazione recettoriale) di inositol-1,4,5-tri-fosfato (IP3) che porta ad un rapido rilascio di Ca2+ immagazzinato nel reticolo endoplasmatico (RE). In seguito a questo evento, per ripristinare i livelli di Ca2+ intracellulari, principalmente nel reticolo endoplasmatico (RE), si verifica l'attivazione e quindi l'apertura dei canali del Ca2+ presenti nella membrana cellulare (PM), chiamati SOCs (store-operated channels). Tra i SOCs, il più conosciuto è il canale CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+ ). In questi canali il passaggio del Ca2+ è mediato dalla proteina CRACM1 (Ca2+ release- activated Ca2+ modulator 1) che forma un poro selettivo all'interno dei CRACs grazie a quattro segmenti transmembrana (1). L'associazione dei due processi (apertura dei canali del Ca2+ nel RE e la successiva apertura di quelli della PM), chiamata nel complesso SOCE (store-operated Ca2+ entry), è mediata dalle proteine STIM1 (Stromal Interaction Molecular gene 1) e STIM2 (Stromal Interaction Molecular gene 2), che agiscono come sensori del Ca2+ intracellulare ed in particolare dei suoi livelli nel lume del RE dove sono localizzate come proteine transmembrana (2). STIM1 e 2 hanno una similarità strutturale del 61% differendo soprattutto nella regione C-terminale; in comune hanno una coppia di domini “EF-hand” responsabili della rilevazione e del monitoraggio dei livelli di Ca2+ nel lume del RE all'interno del quale questi domini risiedono (3). In particolare, in condizioni di riposo, i domini “EF-hand” di STIM1 legano a bassa affinità il Ca2+ (Figura 1A) e in seguito a una
  4. 4. 3 Figura 1: Meccanismi postulati per l’attivazione dei SOCs da parte di STIM1 (Spassova MA et al., 2006) sua deplezione si determina un cambiamento conformazionale di STIM1, che lo porta a formare dei multimeri, che appaiono come regioni distinte del RE vicine alla membrana plasmatica (Figura 1B) (4). Sono stati postulati due meccanismi da Spassova et al. (2006) per spiegare in che modo avvenga il meccanismo del SOCE:  modello inserzionale, secondo il quale i multimeri della proteina STIM1 vengono traslocati e inseriti nella membrana plasmatica cellulare e attivano i canali SOCs, per interazione diretta (Figura 1C, Figura1D).  modello dell'influenza, secondo il quale l'aggregato di STIM1 nel RE si associa con le proteine STIM1 presenti nella membrana plasmatica cellulare e induce la formazione di un complesso tra STIM1 e i canali SOCs che porta all'attivazione di questi ultimi (Figura 1E, Figura 1F). Mentre STIM1 è coinvolto nell'attivare l'afflusso di Ca2+ in risposta alla deplezione delle scorte dello ione mediata da recettore, STIM2, di cui ancora poche informazioni sono presenti in letteratura, lo fa in risposta a più basse diminuzioni dei livelli dello ione nel RE, funzionando così da regolatore che stabilizza i livelli basali di Ca2+ citosolici e del RE (5). Il meccanismo del SOCE svolge un ruolo chiave nella risposta immunitaria di tipo T (6) e mutazioni nei geni coinvolti nel processo di regolazione delle scorte di Ca2+ portano a patologie come ad esempio l'immunodeficienza combinata grave (7).
  5. 5. 4 Inoltre, il meccanismo del SOCE è implicato nella regolazione di numerosi processi cellulari fondamentali come la migrazione, la proliferazione e il differenziamento, e un alterato signaling del Ca2+ è stato osservato in numerosi tipi di cellule tumorali. Difatti l'inibizione dell'afflusso di Ca2+ può indurre o l'arresto della crescita o la morte della cellula in molti tipi di tumore (8). Per quanto riguarda STIM1, in letteratura sono riportati dati contrastanti circa il suo coinvolgimento nel processo della cancerogenesi. Inizialmente, STIM1 era stato considerato un gene oncosoppressore poiché causa l'arresto del ciclo cellulare nelle cellule umane G401 di tumore rabdoide (un tipo di tumore renale dell'infanzia): in queste cellule, infatti, l'espressione del gene è fortemente repressa e potrebbe avere un ruolo nella patogenesi di tale neoplasia; l'effetto oncosoppressore era stato osservato solo in questo tipo di cellule (9,10). Successivamente è stato riportato che STIM1 ha un ruolo fondamentale nella migrazione cellulare e nella capacità di metastatizzare nel carcinoma mammario umano (11). Inoltre, nel carcinoma mammario canino è stata trovata una up- regolazione di STIM1, associata ad una aumentata migrazione cellulare e progressione tumorale negli organi distali (12). Un ruolo centrale nella migrazione cellulare è svolto dal turnover dell'adesione focale (adesione della cellula alla matrice extracellulare mediante le integrine cellulari): il disassemblamento delle adesioni focali nella parte posteriore della cellula e il contemporaneo assemblaggio delle stesse nella parte anteriore determinano il movimento della cellula in avanti (13,14). Si è visto che bloccando l'afflusso di Ca2+ (con siRNA contro STIM1) si ha una disregolazione del turnover delle adesioni focali che le rende più stabili e quindi fortemente aderenti, impedendo la rapida migrazione delle cellule, incluse quelle
  6. 6. 5 metastatiche del cancro. Questo apre a nuove potenziali strategie terapeutiche per il trattamento dei tumori metastatici che vadano a bloccare i SOCs (15). Tuttavia, altri lavori recenti sembrerebbero confermare il ruolo di STIM1 come oncosoppressore, come inizialmente ipotizzato. Infatti, nel carcinoma polmonare derivato da metastasi del melanoma umano, la soppressione di STIM1 ha portato ad una accelerata motilità delle cellule (11). Anche nel tumore di Wilms, nonostante possa metastatizzare, manca l'attività di ripristino delle riserve di Ca2+ dovuta ad una riduzione di STIM1 poiché c'è una notevole up-regolazione del gene WT1 che sembra inibire direttamente l'espressione di STIM1 (16). Pertanto anche se si è capito il meccanismo molecolare alla base del SOCE, si sa ancora poco circa la regolazione trascrizionale dei geni STIM1 e STIM2. 2. SINTESI DEL CONTESTO APPLICATIVO Il lavoro oggetto di tesi, svolta presso l’Istituto di Tecnologie Biomediche (ITB) – CNR di Bari, ha avuto come obiettivo lo studio della regolazione dell’espressione dei geni STIM1 e STIM2 da parte dei diversi membri della famiglia genica dell’oncosoppressore p53. Il nostro progetto è partito da uno studio in silico. Infatti, abbiamo interrogato il database p53FamTAG (17) per verificare la presenza nelle sequenze regolatorie dei geni STIM1 e STIM2 di elementi suscettibili al controllo trascrizionale da parte dei membri della famiglia genica di p53, chiamati p53 Responsive Element (p53RE). La famiglia genica di p53 comprende tre membri (p53, p63 e p73), fattori di trascrizione coinvolti in processi cellulari fondamentali: nello specifico p53 è un oncosoppressore che svolge un ruolo critico nella risposta cellulare a diversi stress e
  7. 7. 6 Figura 2: Struttura dei tre membri della famiglia genica di p53 nel mantenimento dell'integrità genomica, mentre p63 e p73 sono principalmente coinvolti nel differenziamento e nello sviluppo (18). Ogni membro della famiglia ha diverse isoforme che portano ad un maggiore grado di complessità, necessaria nel contesto della regolazione delle funzioni indicate. Il primo grado di diversificazione è costituito dal promotore: oltre a quello che precede il primo esone e che porta alla produzione delle isoforme TA (ovvero con dominio di trans-attivazione), la trascrizione può iniziare a partire da promotori alternativi che si trovano nell'introne tre per p73 e p63 e nell'introne quattro per p53; da questi promotori alternativi si originano le isoforme ΔN che sono prive del dominio di trans-attivazione N-terminale. Comunque esse possono attivare direttamente geni target specifici grazie alla presenza di dominii di transattivazione secondari, localizzati a valle (19). Le isoforme ΔN sono in grado di esercitare un effetto dominante-negativo sull'attività delle isoforme TA e hanno un potenziale anti- apoptotico e proliferativo. Un ulteriore livello di diversificazione è dato dallo splicing alternativo a livello delle estremità C-terminali. Pertanto globalmente sono state descritte finora nove isoforme per p53, ventinove per p73 e dieci per p63 (20). Le isoforme α sono le più lunghe poiché presentano tutti gli esoni. Le tre proteine della famiglia genica hanno tre domini funzionali in comune: il dominio N-terminale di transattivazione (TA), che recluta i fattori di inizio della trascrizione sui promotori dei geni target; il dominio di legame al DNA e il dominio
  8. 8. 7 di oligomerizzazione, che permette la formazione di oligomeri, rendendo le proteine funzionalmente attive. Nelle isoforme α di p63 e p73 è presente anche il dominio SAM (Sterile α Motif) seguito dal dominio inibitore TI che permette l'auto- inibizione dell'attività trascrizionale delle isoforme TA. Sebbene ci sia conservazione a livello strutturale, sarebbe un errore considerare ridondanti le funzioni dei tre membri della famiglia. Studi condotti su topi knockout per ciascuno dei tre geni hanno dimostrato che p53, p63 e p73 hanno funzioni specifiche. Infatti, topi transgenici che esprimono una forma mutata di p53 o che ne sono del tutto privi (p53 -/-) nascono normalmente, ma sviluppano spontaneamente dei tumori maligni e ciò indica che p53 non partecipa direttamente ai processi di sviluppo, ma è indispensabile per la protezione dell’organismo dalla trasformazione tumorigenica delle cellule. Al contrario, topi knock-out per p63 (p63 -/-) mostrano notevoli alterazioni dello sviluppo, gli arti e la pelle sono fortemente affetti, mancano di uno strato epidermico pluristratificato a ricoprire il corpo e muoiono nel giro di pochi giorni dalla nascita per disidratazione. Infine, topi knock-out per tutte le isoforme di p73 esibiscono profondi difetti, che includono la disgenesia dell’ippocampo, idrocefalo, infezioni croniche e processi infiammatori, così come anormalità nel pathway di percezione dei ferormoni, però non mostrano un’aumentata suscettibilità al cancro. Sono state evidenziate funzioni di p73 sia peculiari come il ruolo nella neurogenesi di particolari strutture neuronali (le isoforme ΔN in particolare neutralizzano la morte delle cellule neuronali mediata da p53) e il mantenimento del fluido cerebrospinale sia funzioni simili a quelle di p53: l'overespressione ectopica di p73α e p73β mima strettamente l'attività trascrizionale (espressione di target specifici di
  9. 9. 8 p53 come p21 e GADD45) e le funzioni biologiche di p53 (induzione arresto ciclo cellulare e apoptosi). È stato visto, infatti, come p73 (e in particolare p73β) sia in grado di indurre apoptosi in linee cellulari tumorali, indipendentemente dallo stato di p53. Oltre al conclamato ruolo delle mutazioni di p53 nei tumori umani ultimamente è stato dimostrato un coinvolgimento anche degli altri due membri della famiglia genica. p63 e p73 raramente si ritrovano mutati e l’alterazione più comune evidenziata nel cancro umano è la loro iper-espressione piuttosto che una perdita di espressione come ad esempio nel carcinoma primario a cellule squamose della testa e del collo dove l'isoforma ΔNp63α è iper-espressa. È stato quindi suggerito che questa forma sia richiesta per mantenere uno stato di staminalità, permettendo una continua proliferazione e promuovendo la crescita tumorale. Il contributo diretto di p63 e p73 (e in particolare delle isoforme α sia TA che ΔN) alla proliferazione cellulare è stato dimostrato verificando come queste proteine attivino la trascrizione di specifici sottoinsiemi di geni coinvolti nella progressione della crescita e specificatamente nella transizione G1-S del ciclo cellulare come ADA (Adenosine Deaminase) e FASN (Fatty Acid Synthase), che possiedono p53REs nella sequenze geniche. La soppressione delle isoforme TA e ΔN di p63 e p73 porta ad una riduzione del tasso di proliferazione rispetto ai controlli. Viceversa l'espressione ectopica delle isoforme TA e ΔN di p73α e p63α, ma non di p53, aumenta il tasso di proliferazione cellulare dimostrando come le isoforme di p63 e p73 abbiano ruoli opposti a quelli di p53 nel ciclo cellulare in condizioni fisiologiche (21). Il nostro studio in silico, attraverso l'interrogazione del database p53FamTAG ci ha permesso di individuare cinque p53REs nei primi introni del gene STIM1 e una p53RE nel primo introne del gene STIM2.
  10. 10. 9 Per verificare se le p53REs presenti nei geni STIM1 e STIM2 rispondano all'attivazione trascrizionale da parte dei membri della famiglia genica dell'oncosoppressore p53, abbiamo clonato le due p53REs di STIM1 più vicine al sito di inizio della trascrizione e l'unico p53RE presente nel gene STIM2 in un vettore reporter per poter effettuare dei saggi di luciferasi. 3. DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ SVOLTA 3.1 Amplificazione delle p53REs mediante PCR L’analisi in silico ha evidenziato la presenza di un’unica p53RE presente nell’introne uno del gene STIM2 e cinque diverse p53REs presenti nei primi introni del gene STIM1. Per compiere il nostro studio sono stati scelti il target presente nel gene STIM2 (chiamato STIM2 p53RE) e i primi due target presenti nel gene STIM1 (chiamati STIM1.1 e STIM1.2, corrispondenti alle due sequenze più vicine al sito di inizio della trascrizione del gene). Le regioni fiancheggianti le p53REs oggetto di studio sono state amplificate, a partire da DNA genomico, utilizzando coppie di primers specifici per ogni sequenza da analizzare. Per favorire le fasi successive del clonaggio dei tre frammenti nei vettori reporter, al 5’ dei primers forward è stata aggiunta una sequenza contenente il sito di restrizione per l’enzima NheI, mentre al 5’ dei primers reverse è stata aggiunta una sequenza contenente il sito di restrizione per l’enzima BglII. Dimensioni STIM2 p53RE 297 bp STIM1.1 p53RE 244 bp STIM1.2 p53RE 252 bp Tabella 1: Dimensioni degli amplificati Per ogni p53RE sono state effettuate due reazioni di PCR (campione da amplificare e, in parallelo, bianco, usato come controllo negativo, a cui non è stato aggiunto il DNA stampo) allestite seguendo lo schema riportato qui di seguito:
  11. 11. 10 Campione Bianco Buffer (5X → 1X) 10 μl 10 μl MgCl2 (25 mM → 3 mM) 6 μl 6 μl DNTP (10 mM → 0,2 mM) 1 μl 1 μl Primer FOR (10 pmol/μl → 0,4 pmol/μl) 2 μl 2 μl Primer REV (10 pmol/μl → 0,4 pmol/μl) 2 μl 2 μl TAq DNA Pol (5 U → 2,5 U) 2 μl 2 μl DNA stampo 3 μl - H2O 25,5 μl 28,5 μl Volume finale 50 μl 50 μl Una volta miscelati i vari componenti della reazione, il termociclatore è stato programmato secondo il seguente schema di reazione: Temperatura Tempo N° di cicli Denaturazione iniziale 95°C 5' 1 Denaturazione 95°C 30'' Annealing 64°C 30'' 30 cicli Estensione 72°C 30'' Estensione finale 4° ∞ 1 3.1.1 Purificazione degli amplificati da gel di agarosio I prodotti di PCR sono stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di agarosio all'1,4% e la banda corrispondente al prodotto amplificato, per ogni campione, è stata tagliata dal gel ad un transilluminatore U.V. e inserita in una provetta da 1,5 ml. L'eluizione da gel è stata fatta utilizzando il “Wizard® SV Gel and PCR Clean – Up System” della Promega, secondo il seguente protocollo: 1) Aggiungere, 10 μl per ogni 10 mg di gel, di Membrane Binding Solution. 2) Incubare la sospensione per 10 min a 65°C e agitare al vortex ogni 2-3 min, in modo che l’agarosio si dissolva rilasciando il DNA. 3) Inserire una colonnina SV con filtro nel Collection Tube; trasferire l’intero contenuto della eppendorf nella colonnina e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
  12. 12. 11 4) Centrifugare a 14000 rpm per 1 min ed eliminare l’eluato. 5) Aggiungere 700 μl di Membrane Wash Solution complementata con EtOH al 95% (al fine di permettere la formazione di un aggregato di DNA che precipitando rimane legato al filtro) e centrifugare a 14000 rpm per 5 min; eliminare l’eluato. 6) Ripetere il lavaggio con 500 μl di Membrane Wash Solution e centrifugare a 14000 rpm per 5 min; eliminare l’eluato. 7) Centrifugare a 14000 rpm per 1 min per allontanare eventuali tracce di EtOH; 8) Trasferire la colonnina in una eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 50 μl di H2O Nuclease-Free direttamente nel centro della colonnina, facendo attenzione a non toccare il filtro. Incubare per 1 min a temperatura ambiente e centrifugare a 14000 rpm per 1 min. Dosare i campioni eluiti su gel di agarosio all’1,4%, mediante confronto con marker di 100 bp (0,5 μg/μl). Successivamente, gli amplificati purificati sono stati sottoposti a digestione con gli enzimi di restrizione: - NheI (1 U/μg di frammento di DNA) e BglII (1 U/μg di frammento di DNA) a 37° o.n., per le p53REs chiamate STIM2 e i due target di STIM1. 3.1.2 Reazione di ligazione Le tre p53REs oggette dello studio sono state clonate nei vettori reporter pGL3 Basic e pGL3 Promoter. Nei vettori pGL3 Basic, la sequenza viene clonata esclusivamente a monte del gene reporter della luciferasi (LUC) e permette di valutare se tale sequenza abbia o meno funzione di promotore; nei vettori pGL3 Promoter è presente un promotore minimo di SV40 che ha un'attività basale di trascrizione e ciò ci permette di valutare se la sequenza oggetto di studio abbia
  13. 13. 12 funzione di enhancer o di silencer (Figura 3). Figura 3: Rappresentazione schematica del vettore pGL3 basic e del vettore pGL3 promoter. I vettori pGL3 Basic e pGL3 Promoter (5 μg) sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione BglII (1 U/μg DNA) e NheI (1 U/μg DNA) a 37°C O.N.. Successivamente, i vettori sono stati defosforilati alle estremità 5’ mediante trattamento con fosfatasi alcalina per 30 min a 37°C, in modo da impedire, durante la ligazione, la ri-circolarizzazione delle molecole di vettore, eventualmente digerite da uno solo degli enzimi di restrizione utilizzati, ed avere così una bassa efficienza di ligazione. Infine il vettore digerito e defosforilato è stato purificato mediante estrazione fenolica, seguita da precipitazione alcolica. Una volta terminate tutte queste operazioni, si è proceduto alle reazioni di ligazione vettori-inserti. Per facilitare l'incontro tra inserti e vettore, normalmente si aggiunge una quantità di inserto da 3 a 8 volte maggiore rispetto al vettore (favorendo la formazione di legami inter-molecolari piuttosto che intra-molecolari) e cioè:         3 *  bp bpng ng Vettore InsertoVettore =Inserto Utilizzando la formula, abbiamo effettuato i calcoli considerando le dimensioni degli inserti riportate in Tabella 1. Date le concentrazioni dei vari frammenti e dividendo i valori ottenuti dalla formula 2 con queste si otterrà il volume da prelevare. Ad esempio per la reazione di ligazione tra vettore pGL3 Basic e la p53RE di
  14. 14. 13 STIM2, si ricava il volume di frammento (concentrato 13,1 ng/μl) nel modo seguente: Quindi si è allestita la reazione di ligazione come segue: STIM1.1 pGL3 Basic STIM1.2 pGL3 Basic STIM2 pGL3 Basic STIM1.1 pGL3 Promoter STIM1.2 pGL3 Promoter STIM2 pGL3 Promoter Buffer di diluizione (5X) 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl 4 μl Buffer di ligazione (2X) 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl T4 ligasi (1/μl) 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Vettore (25 ng/μl) 2 μl 2 μl 3,33 μl 2 μl 2 μl 2,08 μl Frammento 1,04 μl 1,04 μl 0,71 μl 1,04 μl 1,04 μl 0,7 μl H2O 1,96 μl 1,96 μl 0,96 μl 1,96 μl 1,96 μl 2,21 μl Volume finale 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl La reazione di ligazione è stata condotta per 20 min a temperatura ambiente. 3.1.3 Trasformazione di cellule competenti con i vettori ricombinanti La trasformazione è stata condotta utilizzando il ceppo super-competente di E. Coli XL-1 blu (capace di inglobare il DNA con altissima efficienza), secondo il seguente protocollo: 1. Aliquotare 50 μl di cellule batteriche XL-1 blu competenti in tubi da 15 ml e aggiungere l'intero volume (20 μl) di ligato. 2. Incubare 30 min in ghiaccio ed effettuare lo shock termico a 42°C per 50 sec per facilitare l'apertura di pori nella parete cellulare attraverso i quali, il vettore adsorbito alla parete cellulare possa entrare in cellula. 3. Trasferire immediatamente in ghiaccio per 2 min per favorire la ri-chiusura dei pori. 4. Aggiungere 900 μl di terreno Luria-Bertani (LB) ed incubare a 37°C per 1 h in μl= ng/µl bp bpng =STIM2μl 0,71 13,1 3 4818 30050   μl= ng/µl bp bpng =STIM2μl 0,71 13,1 3 4818 30050  
  15. 15. 14 agitazione a 200 rpm per consentire l’espressione dei geni necessari alla selezione (in particolare Ampr ovvero resistenza all'ampicillina). 5. Dividere ciascun campione in due aliquote (1/10 e 9/10) e piastrare su un terreno solido di LB/agar contenente ampicillina (che serve a permettere la crescita selettiva di quei batteri che hanno inglobato il vettore chiuso). 6. Incubare le piastre a 37°C O.N. per permettere la crescita delle colonie ricombinanti. 3.1.4 Estrazione del DNA plasmidico Le colonie batteriche isolate, inoculate e fatte crescere o.n. a 37°C a 200 rpm in LB (addizionato di ampicillina) sono sottoposte a protocollo di estrazione del DNA plasmidico ricombinante, utilizzando il kit “Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System” della Promega. Il protocollo applicato prevede: 1. Trasferire la coltura batterica in eppendorf da 1,5 ml. 2. Centrifugare a 10000g per 5 min ed eliminare il sovranatante. 3. Aggiungere 250 μl di Cell Resuspension Solution e miscelare al vortex per risospendere il pellet. 4. Aggiungere 250 μl di Cell Lysis Buffer, invertire 10 volte, per miscelare la soluzione, e incubare per 5 min a temperatura ambiente. 5. Aggiugere 10 μl di Alkaline Protease Solution, invertire 4 volte e incubare per 5 min a temperatura ambiente. 6. Aggiungere 350 μl di Neutralization Solution e invertire 4 volte; centrifugare a 14000g per 10 min. 7. Inserire la colonnina con il filtro nel Collection Tube e trasferire il sovranatante; centrifugare a velocità massima per 1 min ed eliminare l’eluato. 8. Aggiungere 750 μl di Column Wash Solution (complementata con EtOH al 95%). 9. Centrifugare a velocità massima per 1 min ed eliminare l’eluato.
  16. 16. 15 10. Ripetere il lavaggio usando 250 μl di Column Wash Solution e centrifugare a velocità massima per 2 min. 11. Trasferire la colonnina in una eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 50 μl di Nuclease Free Water direttamente al centro della colonnina. 12. Centrifugare a velocità massima per 1 min. 13. Rimuovere la colonnina e dosare il DNA eluito. I cloni sono stati poi sottoposti a sequenziamento automatico, per controllare la sequenza del frammento clonato e verificare che non siano state introdotte mutazioni che potrebbero alterare l’attività della sequenza clonata. 3.2 Saggi di luciferasi 3.2.1 Colture cellulari Per i nostri saggi reporter sono state utilizzate cellule di carcinoma polmonare H1299 (prive di p53) cresciute in terreno di coltura D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) complementato con siero fetale bovino (10%), penicillina/streptomicina (100 U/ml), L-glutammina (2 mM). L'incubazione è avvenuta a 37°C in presenza del 5% di CO2. 3.2.2 Piastramento della linea cellulare H1299 (p53 -/-) Circa 24h prima della trasfezione, sono piastrate circa 1.8 * 105 cellule in 2 ml di terreno D-MEM complementato per ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Il protocollo utilizzato per recuperare le cellule dalle flasca è il seguente: 1. Eliminare il terreno dalla flasca. 2. Lavare 2 volte con PBS freddo. 3. Aggiungere 2 ml di tripsina e farla agire per qulche minuto in modo da favorire il distacco delle cellule. 4. Aggiungere 4 ml di terreno complementato con siero che inibisce la tripsina. 5. Raccogliere il contenuto della flasca in un tubo falcon e centrifugare a 1200
  17. 17. 16 rpm per 5 minuti al fine di pellettare le cellule. 6. Risospendere il pellet di cellule nel volume adeguato al numero di cellule necessarie per ogni pozzetto. Le piastre sono incubate a 37°C in un incubatore al 5% di CO2. 3.2.3 Trasfezione della linea cellulare H1299 Le cellule H1299 sono state trasfettate, al 70-80% di confluenza, utilizzando il seguente protocollo: 1. Preparare una serie di provette pari al numero di trasfezioni da effettuare e in ciascuna di queste aggiungere 50 µl di terreno D-MEM non complementato e 2 μl, per ogni μg di DNA da trasfettare, di Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent (reagente a base lipidica in grado di complessare il DNA e mediarne l’ingresso nelle cellule), 2. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. 3. Preparare un’altra serie di provette in cui aggiungere 50 µl di terreno D-MEM non complementato e i DNA plasmidici ricombinanti, secondo il seguente schema: 4. Al termine dell’incubazione, aggiungere la miscela D-MEM/Mirus a quella contenente i vettori plasmidici ricombinanti e miscelare delicatamente. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Vettore pGL3 pCDNA3 150 ng - - - - - - - - - - - - - - - p53wt - 150 ng - - - - - - - - - - - - - - ΔNp53wt - - 150 ng - - - - - - - - - - - - - p53H175 - - - 150 ng - - - - - - - - - - - - p73α - - - - 150 ng - - - - - - - - - - - p73αV156A - - - - - 150 ng - - - - - - - - - - p73β - - - - - - 150 ng - - - - - - - - - ΔNp73α - - - - - - - 150 ng - - - - - - - - TAp63α - - - - - - - - 150 ng - - - - - - - TAp63αR279Q - - - - - - - - - 150 ng - - - - - - ΔNp63α - - - - - - - - - - 150 ng - - - - - ΔNp63αR279Q - - - - - - - - - - - 150 ng - - - - TAp63β - - - - - - - - - - - - 150 ng - - - ΔNp63β - - - - - - - - - - - - - 150 ng - - TAp63γ - - - - - - - - - - - - - - 150 ng - ΔNp63γ - - - - - - - - - - - - - - - 150 ng 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg 1 μg
  18. 18. 17 5. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. 6. Aggiungere la miscela di trasfezione ai corrispondenti pozzetti delle piastre. 7. Incubare a 37°C in un incubatore al 5% di CO2 per circa 40 ore prima di effettuare il saggio reporter. 3.2.4 Saggio Reporter Il saggio reporter prevede l’utilizzo di due vettori di espressione, uno di questi contiene, per esempio, il cDNA codificante per un fattore di trascrizione, come nel nostro caso uno dei membri della famiglia di p53, e l’altro contenente un cDNA codificante per una proteina reporter (nel nostro caso la luciferasi-LUC di lucciola), a monte del quale è stata clonata una determinata sequenza di cui si vuole valutare la capacità di avere funzione di promotore e/o enhancer per il fattore di trascrizione in esame. Questi vettori vengono introdotti in cellule ospiti all’interno delle quali avviene contemporaneamente la loro espressione, e successivamente si misura l’attività della proteina reporter (LUC). Se l’espressione della luciferasi del vettore reporter ricombinante risulta maggiore, rispetto a un controllo negativo, quando viene over-espresso uno dei fattori di trascrizione, vuol dire che la sequenza clonata nel vettore reporter funziona da promotore e/o da enhancer; se i livelli di espressione diminuiscono, allora la sequenza funziona da silencer. L’attività della LUC dipende anche dall’efficienza di trasfezione e/o dalla vitalità cellulare, ma anche da fonti di variabilità più comuni come differenze nei volumi pipettati, nell'efficienza di lisi e del saggio stesso. Per normalizzare eventuali differenze dovute a questi fattori esterni, un terzo vettore, contenente il gene per la luciferasi di renilla (pRL SV40), che viene espressa in maniera costitutiva, viene cotrasfettato insieme agli altri due vettori fungendo da calibratore. Sebbene questa proteina abbia un'intensità luminosa minore, rispetto alla luciferasi di lucciola, le due attività possono essere misurate parallelamente andando però ad
  19. 19. 18 inattivare prima LUC. Le differenti origini evolutive di queste due luciferasi sono alla base delle differenze di struttura e attività enzimatica, che permettono di discriminare selettivamente le loro reazioni bioluminescenti. Per effettuare il saggio, è stato utilizzato il kit Dual-Luciferase Assay System della Promega e il protocollo utilizzato è il seguente:  A circa 40 ore dalla trasfezione, lavare le cellule con 2 ml di PBS freddo per due volte.  Aggiungere in ciascun pozzetto 1 ml di PLB (Passive Lysis Buffer 5X) ed incubare per 20' a temperatura ambiente per lisare le cellule.  Raccogliere i lisati in eppendorf da 1,5 ml e metterli subito in ghiaccio per evitare la degradazione ad opera delle endopeptidasi cellulari.  Aggiungere 47 μl di LAR II (Luciferase Assay Reagent, contenente il substrato e i cofattori necessari per la reazione catalizzata dalla LUC) nelle cuvette per il luminometro.  Trasferire 5 μl di lisato cellulare nel tubo contenente la LAR II e miscelare con cura pipettando 2 o 3 volte.  Inserire la cuvetta nel luminometro e condurre la prima misura.  Aggiungere 47 μl di Stop & Glo® Reagent (il quale possiede i componenti necessari per la reazione catalizzata dalla REN e permette un rapido smorzamento del segnale di LUC, il quale altrimenti interferirebbe con la seconda misurazione).  Miscelare ed effettuare la seconda misurazione.
  20. 20. 19 4. RISULTATI E CONCLUSIONI Per verificare se l'espressione dei geni STIM1 e STIM2 è regolata dai membri della famiglia genica di p53, le due p53REs identificate mediante analisi in silico più vicine al sito di inizio della trascrizione di STIM1 e l'unica p53RE presente in STIM2 sono state amplificate e clonate nei vettori reporter pGL3 Basic e pGL3 Promoter. Quindi i cDNA di p53, ΔNp53, p73α, p73β, ΔNp73α, TAp63α, TAp63β, ΔNp63α ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ clonati nel vettore di espressione pcDNA3, sono stati cotrasfettati insieme ai vettori reporter ricombinanti, in cellule di carcinoma polmonare H1299 (p53 null). La linea cellulare è stata inoltre co-trasfettata con un plasmide di espressione vuoto (pcDNA3), che funge da controllo negativo: queste cellule non produrranno il fattore di trascrizione in esame e pertanto si monitorerà una minore attività del gene reporter (fornisce il livello basale di trascrizione della LUC) confermando la specificità della reazione e che la sequenza clonata nel vettore reporter funziona da promotore o da enhancer. Sono stati condotti tre esperimenti indipendenti dei quali si è calcolata la deviazione standard. I risultati degli esperimenti effettuati dimostrano che p53 è poco implicato nell'attivazione trascrizionale dei p53REs sia di STIM1 che di STIM2 in entrambi i tipi di vettore (Figure 4, 5, 6). Al contrario, l'isoforma TA p73α e le isoforme ΔN di p73α, p63α e p63β sono in grado di transattivare in maniera significativa tutti i p53RE analizzati, aumentando di molto i livelli della trascrizione rispetto al vettore vuoto. In particolare, per quanto riguarda STIM2 le isoforme ΔN di p73α, p63α e β attivano
  21. 21. 20 fortemente la trascrizione dalle dieci alle venti volte più del controllo (Figura 4a). Figura 4: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla p53RE di STIM2 nel vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α, TAp63α, ΔNp63α sulla p53RE di STIM2 nel vettore pGL3 Basic. Le due p53REs presenti in STIM1 sono suscettibili a una attivazione trascrizionale da parte delle stesse isoforme sebbene con diversa efficienza (Figura 5a e Figura 6a). Figura 5: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53wt ΔNp53wt p73α p73β ΔNp73α TAp63α ΔNp63α TAp63β ΔNp63β TAp63γ ΔNp63γ fold a pGL3 Basic STIM 2 isoforme wt 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53H175 p73αV156A TAp63αR279Q ΔNp63αR279Q fold b pGL3 Basic STIM 2 isoforme mutate 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53wt ΔNp53wt p73α p73β ΔNp73α TAp63α ΔNp63α TAp63β ΔNp63β TAp63γ ΔNp63γ fold a pGL3 Basic STIM 1.1 isoforme wt 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53H175 p73αV156A TAp63αR279Q ΔNp63αR279Q fold b pGL3 Basic STIM 1.1 isoforme mutate
  22. 22. 21 p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla prima p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α, TAp63α, ΔNp63α sulla prima p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic. Figura 6: a) Istogramma relativo all'attività del vettore vuoto (pCDNA3), p53wt, ΔNp53wt, p73α p73β, ΔNp73α, TAp63α, ΔNp63α, TAp63β, ΔNp63β, TAp63γ, ΔNp63γ sulla seconda p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic. b) Istogramma relativo all'attività delle isoforme mutate di p53, p73α, TAp63α, ΔNp63α sulla seconda p53RE di STIM1 nel vettore pGL3 Basic. Risultati simili li abbiamo ottenuti anche negli esperimenti reporter in cui sono state utilizzate le p53REs di STIM1 e STIM2 clonate nel vettore pGL3 Promoter (dati non mostrati in questa tesi). Al fine di valutare la specificità di legame di p53, p63 e p73 a questi responsive elements, abbiamo anche co-trasfettato con vettori di espressione contenenti i cDNA di alcune isoforme di p53, p63 e p73 mutate nella regione di binding e come si può osservare nelle Figure 4b, 5b, 6b queste non hanno transattivato il gene reporter. In conclusione, dai risultati ottenuti, è evidente come p53 sembra non essere implicato nell'attivazione trascrizionale delle proteine STIM e come, viceversa, p63 e p73, pur con diversa efficienza, siano in grado di attivarne la trascrizione. Questo conferma sempre più come i diversi membri della famiglia genica di p53 abbiano 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53H175 p73αV156A TAp63αR279Q ΔNp63αR279Q fold b pGL3 Basic STIM 1.2 isoforme mutate 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 pCDNA3 p53wt ΔNp53wt p73α p73β ΔNp73α TAp63α ΔNp63α TAp63β ΔNp63β TAp63γ ΔNp63γ fold a pGL3 Basic STIM 1.2 isoforme wt
  23. 23. 22 target differenti. I saggi di luciferasi sono solo il primo passo per dimostrare la modulazione dell’espressione di geni da parte di fattori di trascrizione: certamente, a questo tipo di esperimenti vanno aggiunti esperimenti in grado di misurare i livelli endogeni di STIM1 e STIM2, in relazione alle proteine della famiglia genica di p53. Pertanto, in prospettiva futura si andrà a valutare, mediante esperimenti di Real- Time PCR, in quali condizioni fisio-patologiche l’espressione di STIM1 e STIM2 possa essere modulata e capire il reale coinvolgimento dei membri della famiglia genica di p53 nella regolazione dell'espressione di questi geni. Inoltre si andranno a valutare i livelli proteici di STIM1 e STIM2 in seguito a over- espressione dei membri della famiglia genica di p53 per rivelare eventuali meccanismi regolatori traduzionali o post-traduzionali.
  24. 24. 23 5. BIBLIOGRAFIA 1) CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Vig M, Peinelt C, Beck A, Koomoa DL, Rabah D, Koblan-Huberson M, Kraft S, Turner H, Fleig A, Penner R, Kinet JP. Science. 2006 May 26;312(5777):1220-3. Epub 2006 Apr 27. 2) Capacitative calcium entry: sensing the calcium stores. Putney JW Jr. J Cell Biol. 2005 May 9;169(3):381-2. Epub 2005 May 2. Review. 3) STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Liou J, Kim ML, Heo WD, Jones JT, Myers JW, Ferrell JE Jr, Meyer T. Curr Biol. 2005 Jul 12;15(13):1235-41. 4) The functional network of ion channels in T lymphocytes. Cahalan MD, Chandy KG. Immunol Rev. 2009 Sep;231(1):59-87. Review. 5) STIM2 is a feedback regulator that stabilizes basal cytosolic and endoplasmic reticulum Ca2+ levels. Brandman O, Liou J, Park WS, Meyer T. Cell. 2007 Dec 28;131(7):1327-39. 6) Dual functions for the endoplasmic reticulum calcium sensors STIM1 and STIM2 in T cell activation and tolerance. Oh-Hora M, Yamashita M, Hogan PG, Sharma S, Lamperti E, Chung W, Prakriya M, Feske S, Rao A. Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):432-43. Epub 2008 Mar 9. 7) A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Feske S, Gwack Y, Prakriya M, Srikanth S, Puppel SH, Tanasa B, Hogan PG, Lewis RS, Daly M, Rao A. Nature. 2006 May 11;441(7090):179-85. Epub 2006 Apr 2. 8) Stim1 and Orai1 mediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for endothelial cell proliferation. Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M, Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak M. Circ Res. 2008 Nov 21;103(11):1289-99. Epub 2008 Oct 9. 9) Exon structure and promoter identification of STIM1 (alias GOK), a human gene causing growth arrest of the human tumor cell lines G401 and RD. Sabbioni S, Veronese A, Trubia M, Taramelli R, Barbanti-Brodano G, Croce CM, Negrini M. Cytogenet Cell Genet. 1999;86(3-4):214-8. 10) STIM1: a novel phosphoprotein located at the cell surface. Manji SS, Parker NJ, Williams RT, van Stekelenburg L, Pearson RB, Dziadek M, Smith PJ. Biochim Biophys Acta. 2000 Aug 31;1481(1):147-55. 11) Orai1 and STIM1 are critical for breast tumor cell migration and metastasis. Yang S, Zhang JJ, Huang XY. Cancer Cell. 2009 Feb 3;15(2):124-34. 12) Transcriptomic "portraits" of canine mammary cancer cell lines with various phenotypes. Król M, Pawłowski KM, Skierski J, Turowski P, Majewska A, Polańska J, Ugorski M, Morty RE, Motyl T. J Appl Genet. 2010;51(2):169-83. 13) STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. Darbellay B, Arnaudeau S, König S, Jousset H, Bader C, Demaurex N, Bernheim L. J Biol Chem. 2009 Feb 20;284(8):5370-80. Epub 2008 Dec 16. 14) Calcium-mediated signal transduction: biology, biochemistry, and therapy. Cole K, Kohn E. Cancer Metastasis Rev. 1994 Mar;13(1):31-44. Review. 15) FAK-Src signalling through paxillin, ERK and MLCK regulates adhesion disassembly. Webb DJ et al., 2002. Nat Cell Biol. 2004 Feb;6(2):154-61. Epub 2004 Jan 25. 16) Wilms tumor suppressor 1 (WT1) and early growth response 1 (EGR1) are regulators of STIM1 expression. Ritchie MF, Yue C, Zhou Y, Houghton PJ, Soboloff J. J Biol Chem. 2010 Apr 2;285(14):10591-6. Epub 2010 Feb 1. 17) p53FamTaG: a database resource of human p53, p63 and p73 direct target genes combining in silico prediction and microarray data. Sbisà E, Catalano D, Grillo G, Licciulli F, Turi A, Liuni S, Pesole G, De Grassi A, Caratozzolo MF, D'Erchia AM, Navarro B, Tullo A, Saccone C, Gisel A. BMC Bioinformatics. 2007 Mar 8;8 Suppl 1:S20. 18) The p53 gene family: control of cell proliferation and developmental programs. Morgunkova AA. Biochemistry (Mosc). 2005 Sep;70(9):955-71. Review. 19) p53/p63/p73 isoforms: an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress. Murray-Zmijewski F, Lane DP, Bourdon JC. Cell Death Differ. 2006 Jun;13(6):962-72. Review. 20) Identification and functional characterization of two new transcriptional variants of the human p63 gene. Mangiulli M, Valletti A, Caratozzolo MF, Tullo A, Sbisà E, Pesole G, D'Erchia AM. Nucleic Acids Res. 2009 Oct;37(18):6092-104. Epub 2009 Aug 21. 21) p73 and p63 sustain cellular growth by transcriptional activation of cell cycle progression genes. Lefkimmiatis K, Caratozzolo MF, Merlo P, D'Erchia AM, Navarro B, Levrero M, Sbisa' E, Tullo A. Cancer Res. 2009 Nov 15;69(22):8563-71. Epub 2009 Oct 27.

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