Rosario Rizzuto, IV Convegno Mitocon 2014

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Rosario Rizzuto, IV Convegno Mitocon 2014

  1. 1. Department of Biomedical Sciences University of Padua Biologia e biochimica della macchina mitocondriale Rosario Rizzuto 4° Convegno Malattie Mitocondriali Tivoli, 23 maggio 2014
  2. 2. Peter D. Mitchell (1920-1992) Nobel Prize in Chemistry 1978 Il funzionamento
  3. 3. Le proteine (ed i geni) della respirazione mitocondriale 42 (7 mt) 5 11 (1) 13 (3) 14 (2)
  4. 4. 1. Una molteplicità di geni, su due genomi diversi 2. Una presentazione variabile (per organo/i coinvolti ed età di insorgenza) 3. Un ampio spettro di gravità e decorso Mitochondrial disorders are a group of heterogeneous diseases, commonly defined by a lack of cellular energy due to OXPHOS defects Zeviani_Brain_2004_review Mitochondrial Respiratory Chain MELAS (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stoke-like episodes) Leigh syndrome LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy) MERRF (Myoclonic epilepsy and ragged red fibers) NARP (Neurophaty, ataxia and retinitis pigmentosa) CPEO (Chronic progressive external ophtalmoplegia) KSS (Keans-Sayre syndrome)
  5. 5. Perché i difetti mitocondriali provocano morte cellulare e disfunzione d’organo? (Dove risiede la specificità delle diverse mutazioni?)
  6. 6. La disfunzione mitocondriale induce morte cellulare per necrosi o apoptosi Crisi energetica
  7. 7. Quali segnali ricevono i mitocondri, e come li traducono?
  8. 8. Il Ca2+ è il più comune secondo messaggero delle cellule
  9. 9. Il sistema di accumulo del Ca2+ nei mitocondri ∆Ψ = -180mV
  10. 10. I contatti RE/mitocondri: sedi previlegiate della segnalazione cellulare
  11. 11. Il Ca2+ mitocondriale stimola il rilascio di cofattori dell’apoptosi APOPTOSI Ill Ca2+ mitocondriale regola il metabolismo Il ruolo del Ca2+ nei mitocondri Rizzuto_Nature Reviews_2012
  12. 12. I mitocondri regolano l’autofagia
  13. 13. Ca2+ mitocondriale ed autofagia: Un nuovo elemento nella patogenesi delle malattie mitocondriali
  14. 14. Subject Date of birth Familiarity Complex I residual activity Affected gene Mutation Hetero- plasmy Reference Patient 13-12-1975 MELAS 60% ND5 13514A>G (D393G) 25-30% (Corona et al., 2001) MELAS (mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) Experimental model: skin primary fibroblasts derived from patient with point mutation in complex I subunit Zeviani_Brain_2004_review Mitochondrial Respiratory Chain Patient Brandt_Annu.Rev.Biochem:_2006 45 subunits, 7 encoded by mtDNA Structure of Complex I
  15. 15. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 [Ca2+]mtuM control cont… 0 5 10 15 20 25 30 35 40 [Ca2+]mtuM patient 2 patie… 0 5 10 15 20 25 30 35 40 [Ca2+]mtuM patient 1 patie… Mutazioni diverse nello stesso complesso hanno effetti diversi sui livelli di calcio mitocondriale Ca2+
  16. 16. I fibroblasti di pazienti mutati in ND5 hanno aumentata autofagia a riposo • Immunofluorescenza di LC3 Ctrl Pat BASALSTARVATION ** ** ** 0 5 10 15 20 25 30 35 voxels autophagosome volume Ctrl Pat ** ** ** 0 20 40 60 80 Averagen.objects/cell puncta per cell Ctrl Pat starvation - - ++ starvation - - ++
  17. 17. 0 CtrlPat BASALE DIGIUNO BASALE + CLOROCHINA DIGIUNO + CLOROCHINA ** ** ** ** ** ** ** 0 20 40 60 80 100 120 140 Averagen.objects/cell puncta per cell Ctrl Pat starvation - - ++ - + - + chloroquine - - -- + + + + ** ** ** ** ** ** ** 0 10 20 30 40 50 60 70 voxels autophagosome volume Ctrl Pat starvation - - ++ - + - + chloroquine - - -- + + + + L’aumento degli autofagosomi non è dovuto a blocco del flusso Chloroquine = 50 µM in DMEM or starvation’s saline for 1h LC3
  18. 18. p-AMPK β-tub AMPK starvation - - ++ Ctrl Pat ** ** 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 a.u. p-AMPK starvation - - ++ Il meccanismo dipende dalla deprivazione energetica (AMPK) p-Akt β-tub Akt p-mTOR mTOR p-S6 S6 Ctrl Pat starvation - - ++ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 a.u. p-mTOR 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 a.u. p-S6 starvation - - ++ starvation - - ++ n. exp = 3 ** P< 0.001 n. exp = 3 Starvation = serum and glucose deprivation for 4h
  19. 19. Qual’è il segnale?
  20. 20. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 [Ca2+]cytuM Histamine 10 s 0 50 100 150 200 250 300 350 400 [Ca2+]ERuM EGTA Histamine Ca2+ 5 s 0 10 20 30 40 50 60 [Ca2+]mtuM Histamine 10 s 0 50 100 150 200 250 [Ca2+]mtuM Ctrl Pat Ca2+ free Ca2+ 0.5 s I mitocondri hanno un difetto nell’accumulo di calcio 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 50 100 150 200 250 300 350 400 ** 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 ** 0 2 4 6 8 10 12 uM/s speed ** 0 50 100 150 200 250 [Ca2+]mtuM peak Citoplasma Reticolo Endoplasmatico Mitocondria Mitocondri in cellule permeabilizzate
  21. 21. Difetto di accumulo mitocondriale del Ca2+ Morfologia I contatti RE – mitocondri Il canale (MCU) I suoi regolatori MICU1 MICU2 MCUR1 EMRE ∆Ψ = -180mV Potenziale di membrana
  22. 22. Nessuna differenza nel potenziale o nella forma dei mitocondri Ctrl Pat O=oligomycin R=rotenone F=FCCP Ctrl Pat n. exp = 3 n. exp = 3 n.cells=60
  23. 23. MICU1 MCU EMRE MCUR1 MICU2 β-Tub Ctrl Pat n. exp = 3 Le proteine del complesso MCU  E’ cambiata la composizione molecolare dei sistemi di trasporto Vi è una differente espressione dei regolatori di MCU (MICU)
  24. 24. … ed una alterazione dei contatti con il RE Probe costruito da Tito Calì ** 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Averagen.puncta/cell Ctrl Pat -MFN2+MFN2 MFN - - ++ MFN1 MFN2 SigmaR1 β-Tub grp75 Ctrl Pat PACS-2
  25. 25. C’è una relazione tra l’alterazione del segnale Ca2+ nei fibroblasti di paziente e l’aumento di autofagia?
  26. 26. La correzione molecolare dell’alterazione del segnale Ca2+ riduce l’autofagia ** ** ** ** * ** 0 10 20 30 40 50 60 70 80 [Ca2+]mtuM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 [Ca2+]mtum Ctrl Ctrl STARV Ctrl + MCU Ctrl STARV + MCU Pat Pat STARV Pat + MCU Pat STARV + MCU Histamine 10 s Histamine starvation - - ++ - + - + MCU - - -- + + + + p-AMPK β-tub AMPK MCU MCU - + +- starvation - - ++ - + +- - - ++ Ctrl Pat
  27. 27. Conclusioni Gli studi cellulari su fibroblasti di pazienti rivelano differenti profili di segnalazione mitocondriale Si rilevano difetti nell’accumulo di Ca2+ in seguito a stimolazione cellulare, che possono essere attribuiti ad alterazioni del sistema di trasporto dello ione e dei contatti con il RE Queste alterazioni della segnalazione mitocondriale correlano con una stimolazione dell’autofagia La correzione molecolare (sovraespressione di MCU) ripristina i segnali Ca2+ e inibisce l’autofagia
  28. 28. Collaboratori Ildiko Szabo, Enrico Teardo (electrophysiology) Stefano Moro, Davide Sabbadin (protein modelling) Tullio Pozzan, Ilaria Drago, Marco Mongillo, Tania Zaglia, Fabio Di Lisa, Andrea Carpi (heart) Jim Surmeier, Marisa Brini (neurons) Giuseppe Zanotti, Laura Cendron (protein structure) Paolo Bonaldo, Paola Braghetta, Francesco Argenton, Enrico Moro (transgenics) Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Padova Diego De Stefani Cristina Mammucari Giorgia Pallafacchina Anna Raffaello Alessandra Braga Gaia Gherardi Veronica Granatiero Angela Paggio Marco Pacifici Maria Patron Elisa Penna Anne Picard Anna Terrin Anna Tosatto Denis Vecellio Lauren Wright Ilaria Zamparo

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