Determinaciondecarbohidratos

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Determinaciondecarbohidratos

  1. 1. QUÍMICA ANALÍTICAEs la herramienta fundamental para realizar el análisis químico de los alimentos.Puede definirse como la rama de la Química que se ocupa de la identificación ycuantificación de un componente químico en una sustancia dada.La química analítica se divide en dos campos de acción: • el análisis cualitativo: cuyo objeto es identificar cuales son los componentes que están presentes en una muestra. • el análisis cuantitativo: por medio del cual se determina cuanto hay de cada componente en la muestra evaluada.Para cumplir estos dos objetivos, la química analítica se vale del método analítico.Se define como el conjunto de operaciones físicas y químicas que permiteidentificar y/o cuantificar un componente químico, al cual se denominaanalito, en el sistema material que lo contiene, el cual se denomina matriz.
  2. 2. QUÍMICA ANALÍTICALos métodos de análisis químico pueden clasificarse en dos grandes grupos: • Métodos químicos clásicos a. Análisis volumétrico: se basa en la medida exacta del volumen de una solución que contiene suficiente reactivo para reaccionar con el analito. b. Análisis gravimétrico: la determinación del analito se realiza midiendo directa o indirectamente su masa. • Métodos instrumentales (físico-químicos) a. Métodos espectrométricos b. Métodos electroanalíticos c. Métodos cromatográficos
  3. 3. ASPECTOS GENERALESPor la diversidad de sus orígenes y la gran variabilidad en su composiciónquímica, han surgido una variedad enorme de Métodos de Análisis paraCarbohidratos.A. Métodos Físicos a. Cromatografía en papel y de capa fina b. Cromatografía de gas – líquido c. Cromatografía de intercambio iónico d. Electroforesis (gel de poliacrilamida – PAGE) e. Refractometría f. Hidrometría g. Polarimetría h. Espectroscopia de rayos infrarrojos (de Fourier FT – IR)B. Métodos Químicos Métodos Redox Métodos por formación de complejosC. Métodos Bioquímicos Métodos Enzimáticos
  4. 4. MÉTODOS FÍSICOSCromatografía La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclascomplejas. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyoobjetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar ydeterminar las cantidades de dichos componentes.Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas hay una fase móvil queconsiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra la muestra a travésde una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Loscomponentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria.De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y sevan separando. Después de que los componentes hayan pasado por la faseestacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puededepender de la concentración y del tipo de compuesto.La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas:• Separar los componentes de la mezcla para obtenerlos más puros y que puedan ser usadosposteriormente.• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, lascantidades de material empleadas son pequeñas.
  5. 5. Cromatografía líquidaDentro de esta categoría se destaca la cromatografía líquida de alta resolución (HPCL, delinglés High Performance Liquid Chromatography). Es la técnica cromatográfica másempleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa donde la faseestacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar.Terminología empleada en cromatografía:• Analito: es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.• Cromatografía analítica: se emplea para determinar la existencia y la concentración deun analito en una muestra.• Fase enlazada: es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículasde soporte o a las paredes internas de la columna.• Cromatograma: es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separaciónóptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a loscomponentes de la mezcla separada.• Muestra: es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede consistir enun simple componente o una mezcla de varios.• Soluto: es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.• Disolvente: es toda sustancia capaz de solubilizar a otra, especialmente la fase líquidamóvil en cromatografía de líquidos.• Fase estacionaria: es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de lacromatografía.
  6. 6. Cromatográfo
  7. 7. Cromatográfo
  8. 8. Cromatografía en capa finaLas capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas simplemente.Se usan dos tipos de capas: capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por medio deun agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades adherentes delpropio material, y capa suelta.Reactivos utilizados para revelar carbohidratosReactivos específicos dan manchas coloreadas con diversos azúcares, entre ellos el ftalato deanilina (en n-butanol saturado de agua) y naftoresorcinol (en acetona, agua y ácido fosfórico).Diversas técnicas se emplean en la detección de los carbohidratos después de la separacióncromatográfica. Se incluyen revelaciones con sprays o inmersiones de tiras de papel enplatos de capa fina conteniendo diversos reactivos de coloración.Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico para ladeterminación de ácidos sálicos; el orcinol-ácido sulfúrico para determinar galactosa; antronapara hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para residuos de ácidos sálicosunidos.
  9. 9. Aplicaciones de la cromatografía de capa finaEn las separaciones sobre capa fina pueden realizarse separaciones por reparto, filtraciónsobre gel, adsorción e intercambio iónico. Las propiedades particulares de lacromatografía en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo detiempo mucho menor (entre veinte y cuarenta minutos).Una razón es el tamaño tan fino de las partículas que constituyen los medios empleadosen cromatografía en capa fina, por lo que se consiguen mejores resoluciones y manchasmás compactas.Materiales y sustancias-Placa de vidrio con sílica gel-Cámara cromatográfica-Pipetas-Pera para pipetear-Regla-Estufa-Solvente de desarrollo (50 ml Butanol, 30 ml propanol, 20 ml Ac Bórico 0,5%)-Muestra (CHO #1; CHO#2)-Carbohidratos patrón (xilosa, lactosa, sacarosa, glucosa, galactosa, ribosa, fructosa).
  10. 10. ProcedimientoEn la placa de vidrio trazar una línea a 1.5 cm de la base, que servirá como punto deorigen para la aplicación de las muestras, luego aplicar las muestras y los carbohidratospatrones con un capilar, mas o menos con separaciones de unos 0,5 cm, calentar en laestufa a unos 120 ºC por unos 2 minutos, luego agregar 50 ml del solvente de desarrolloen la cámara cromatográfica.Poner la placa en la cámara cromatográfica y esperar hasta que ascienda el solvente dedesarrollo por la placa de vidrio hasta unos 7 cm de la base. Una vez ascendido elsolvente sacar la placa y tirar una raya con cuidado hasta donde llegó elsolvente, calentar en la estufa por unos minutos.Luego sacamos la placa de la estufa y con una brocha con cuidado pasamos el reactivo deMolisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa a 120 o 140 ºC de 1 a 5minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a dañar, observar de rato en ratohasta que aparezcan las manchas coloreadas.Medir la distancia desde el punto de origen hasta la mitad de la mancha, y luego desde elpunto de origen hasta el frente del solvente y calcular el RF.En el revelado se forman derivados del furfural, las hexosas van a formar hidroxi metilfurfural y las pentosas forman furfural y estas son incoloras, pero como el reactivo deMolisch tiene α naftol van a formar complejos coloreados de violeta púrpura rosado.
  11. 11. Reacción de MolischEste ensayo permite detectar la presencia de hidratos de carbonoen una muestra; se basa en la acción hidrolizante y deshidratanteque ejerce el ácido sulfúrico sobre estos compuestos. Como sesabe, los ácidos concentrados originan una deshidratación de losazúcares para rendir furfurales, que son derivados aldehídicos delfurano. Los furfurales se condensan con los fenoles para darproductos coloreados característicos, empleados frecuentemente enel análisis colorimétrico.Procedimiento experimentalEn un tubo de ensayo se depositan 10 ml de una disolución al 5% de la muestra aensayar, en un segundo tubo de ensayo se deposita la misma cantidad de una disolucióntambién al 5% de un hidrato de carbono conocido (glucosa). Se añaden unas gotas dereactivo de Molisch (α-naftol al 5% en etanol) y se mezcla el contenido. Inclínense lostubos y déjese resbalar cuidadosamente 1 ml de ácido SO4H2 concentrado a lo largo dela pared del tubo de manera que se forme una capa bajo la fase acuosa. A continuación secalientan los tubos en un baño de agua unos minutos. La reacción es positiva si se formaun anillo rojo violáceo en la interfase. Esta reacción la dan todos los azúcares por lo quedebe llevarse a cabo evitando la presencia de restos de papel de filtro o materialessimilares en los tubos de ensayo.
  12. 12.  La refracciónCuando se pone un lápiz en el agua, la punta del lápiz aparece inclinada. Luego, si se hacelo mismo pero colocando el lápiz en una solución de agua azucarada, la punta del mismoaparecerá más inclinada. Este es el fenómeno de la refracción de la luz.Los refractómetros son instrumentos de medición basados en el fenómeno de refracciónde la luz. Se basan en el principio por el cual cuando aumenta la densidad de unasustancia (por ejemplo: cuando se disuelve el azúcar en el agua), el índice de refracciónaumenta proporcionalmente.Los refractómetros fueron inventados por Dr. Ernst Abbe, científico alemán-austriaco aprincipios del siglo XX. Existen dos tipos de refractómetros en función de la deteccióndel índice de refracción: sistemas transparentes y sistemas de reflexión. Losrefractómetros portátiles y los refractómetro Abbe usan los sistemastransparentes, mientras que los refractómetros digitales usan los sistemas de reflexión.
  13. 13. Descripción del sistema transparente.En la figura de abajo la detección es hecha utilizando el fenómeno refractivo producido enel limite del prisma. Si la muestra es de baja concentración, el ángulo de refracción esgrande (vea "A") debido a la gran diferencia en el índice de refracción entre el prisma y lamuestra.Si la muestra es concentrada, el ángulo de refracción es pequeño (vea "B") debido a lapequeña diferencia en el índice de refracción entre el prisma y la muestra.
  14. 14. Descripción del sistema de reflexiónEl sistema de refracción para el refractómetro digital (sistema de reflexión). En la figuradebajo, haz de luz A, que incide desde la parte baja izquierda del prisma, no es reflejada porel limite, pero pasa a través de la muestra. El haz de luz B se refleja por la caraderecha, directamente a lo largo del límite del prisma. El haz de luz C, incide en un ángulodemasiado grande para pasar a través de la muestra, si no que es totalmente reflejado haciael lado bajo y derecho del prisma. Como resultado, la línea límite es producida dividiendo laluz y la sombra en el otro lado de la línea punteada B en la figura. El ángulo de reflexiónde esta línea es proporcional al índice de refracción, la posición de la línea límite entre laluz y los campos oscuros son captadas por un sensor y convertidas en índices refractivos.
  15. 15. Unidad de medida (Brix)La Escala de Medición (%) muestra el porcentaje de concentración de los sólidos solublescontenidos en una muestra (solución de agua). El contenido de los sólidos solubles es eltotal de todos los sólidos disueltos en el agua, incluso el azúcar, las sales, las proteínas, losácidos, etc., y la medida leída es el total de la suma de éstos.Básicamente, el porcentaje Brix (%) se calibra a la cantidad de gramos de azúcarcontenidos en 100g de solución de azúcar. Así, al medir una solución de azúcar, Brix (%)debe ser perfectamente equivalente a la concentración real.
  16. 16. MÉTODOS QUÍMICOSMétodo de Fehling-SoxhletEste método se basa en la precipitación de ácido cuproso (Cu2O)enpresencia de una sustancia reductora. Se utiliza para determinarazúcares reductores; puede ser por análisis gravimétrico ovolumétrico. Método gravimétrico de Munson y Walker.El método gravimétrico se conoce como la propuesta de Munson y Walker. Corresponde ala cantidad de cobre reducido en presencia de azúcares reductores; el peso en miligramosde Cu2O corresponden a los miligramos de azúcares analizados, por medio de las tablas deMunson y Walker que aparecen en el AOAC. Los azúcares reductores son aquellos azúcares que poseen su grupo carbonilo (grupo funcional que consiste en un átomo de carbono con un doble enlace a un átomo de oxígeno) intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar con otras moléculas.
  17. 17. •Materiales y Reactivos•Un balón aforado de 250 ml Reactivo de Fehling – Soxhlet:•Un balón aforado de 100 ml Reactivo A•Un vaso de precipitados de 500ml Disolver 69.28 g de sulfato de cobre pentahidratado•Un vaso de precipitados de 250ml (CuSO4 . 5H2O) y 1 ml de ácido sulfúrico 1M en•Un Erlenmeyer de 500ml 1L de agua. La solución puede almacenarse•Una placa de calentamiento indefinidamente.•Cinco tubos de ensayo•Dos pipetas graduadas de 5ml Reactivo B•Un embudo de vidrio Disolver 346g de tartrato de sodio y potasio•Un agitador de vidrio tetrahidratado KNaC4H4O6*4H2O (sal de Rochelle)•Una probeta de 100ml y 100g de hidróxido de sodio (NaOH) en agua y•Una probeta de 50ml aforar a 1L. La solución es estable indefinidamente•Una pipeta aforada de 25ml si es almacenada en un recipiente hermético.•Una pipeta aforada de 10ml•Un vidrio de reloj•Una propipeta•Dos aros con nuez ( uno pequeño)•Una gradilla
  18. 18. PROCEDIMIENTO1. Preparación del reactivo de Fehling-Soxhlet: mezclar volúmenes iguales de la solución de sulfato de cobre y de la solución alcalina del tartrato de sodio y de potasio.2. Preparación de la muestra – solución No.1: pesar 20 g de la muestra y disolverla en un matraz aforado de 250ml con agua destilada, si se observan partículas sólidas dejarlas decantar.3. Ensayo Previo: en cinco tubos de ensayo agregar sucesivamente a, 2, 3, 4 y 5 ml de la muestra azucarada antes preparada, añadir a cada tubo 5 ml de la solución de Fehling- Soxhlet, calentar en una baño con agua hirviendo por unos tres minutos. Dejar sedimentar el óxido cuproso y observar el color del líquido en cada tubo; notar cual tiene el tinte de color azul más ligero. Si no se observa en ninguno de los tubos una coloración azul, se debe volver a preparar la solución No.1, utilizando la mitad del peso de la muestra anterior. Para continuar con el análisis, se mide 20 veces el volumen de la solución No 1 con la que se obtuvo el color azul más ligero, y se coloca en un matraz aforado de 100ml y se completa a volumen con agua destilada (preparación de solución No.2).
  19. 19. 4. Análisis gravimétrico: en un vaso de precipitado de 250ml adicione 50ml del reactivo de Fehling-Soxhlet y 50ml de la solución No.2 azucarada, cubrir el vaso con un vidrio de reloj y calentar hasta el punto de ebullición por unos 4 a 5 minutos. Retirar de la llama y agregar inmediatamente 100cm de agua destilada fría. Luego filtrar sobre un papel de filtro previamente pesado y lavar el precipitado con una tres porciones de 20 ml de agua caliente, luego con tres porciones de 10 ml de alcohol al 70% y finalmente con dos porciones de 20 ml de éter etílico. Colocar en la estufa a 120 oC por 15 minutos, dejar enfriar en el desecador y pesar.AnálisisCalcular con el peso en miligramos del Cu2O, los miligramos de azúcares reductores comoglucosa que se están analizando por medio de las tablas de Munson y Walker (AOAC).El contenido de cobre es proporcional al azúcar presente.
  20. 20.  Método volumétrico de Lane y EynonEn el método de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cúprico con azúcarreductor en medio alcalino, formándose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojoladrillo. Este método utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vezque todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulación. Se fundamentatambién en la reacción de Fehling.Reactivos:1. Solución de Fehling A (34,639 g de CuSO4◦5H2O en 500 ml de agua)2. Solución de Fehling B (173 g de tartrato de sodio y potasio, y NaOH en 500 ml de agua)3. Azul de metileno (1%)4. Solución patrón de glucosa al 1%5. Solución diluida de glucosa (50 mg/ml), preparada a partir de la solución patrón deglucosa (1%)6. Solución de acetato básico de plomo al 30%7. Oxalato de sodio o potasio en polvo8. Solución de HCl 1:19. Solución de NaOH 6 N.
  21. 21. ProcedimientoDeterminación de azúcares reductoresTomar una alícuota de 25 ml, colocarla en un matraz aforado de 100 ml, aforar conagua, mezclar bien y colocar la solución en una bureta. Colocar en una fiola de 250 ml 5 mlde solución de Fehling A y 5 ml de solución de Fehling B. Añadir 2 o 3 gotas de soluciónde azul de metileno. Diluir con aproximadamente 20 ml de agua destilada y agregar perlasde vidrio.Llevar a ebullición la solución de Fehling y agregar lentamente la solución de glucosa sindejar de calentar, hasta que desaparezca la coloración azul. En el momento en quedesaparece el color del indicador, en los bordes del fondo del matraz se puede observarcierto tono rojizo.Nota: durante todo el tiempo en que se añade la solución de glucosa, la solución de Fehlingdebe mantenerse en ebullición.
  22. 22. PROCEDIMIENTO Fehling A y Fehling B Tubos de ensayo con Fehling A (azul) Fehling A + B y Fehling B (transparente) Disolución de la muestra en agua Adición del reactivo Fehling a Se calienta la preparación la muestra
  23. 23. Comienza a virar el color Fehling positivo (se precipita el óxido de Cu) Fehling + Fehling -
  24. 24. Determinación de fibraSe conoce como fibra o fibra dietética, al total de polisacáridos presentes en las plantas yque son resistentes a la digestión por las enzimas del tracto gastrointestinal humano. Determinación de fibra cruda o Método de Weende (1.850)Este método permite determinar el contenido de fibra en la muestra, después de serdigerida con soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinado el residuo; seefectúa una extracción secuencial de los componentes que no forman parte de la fibra, yposterior aislamiento del residuo insoluble (fibra cruda). La diferencia de pesos después dela calcinación nos indica la cantidad de fibra presente.Reactivos- Solución de ácido sulfúrico 0.255N- Solución de hidróxido de sodio 0.313N, libre de carbonato de sodio- Antiespumante (ej. alcohol octil o silicona)- Alcohol etílico al 95% (V/V)- Éter de petróleo-Solución de ácido clorhídrico al 1% (V/V)
  25. 25. Materiales y equipo•Matraz de bola fondo plano, 600 ml, cuello esmerilado•Unidad de condensación para el matraz•Matraz Kitazato de un litro•Embudo Buchner•Crisol de filtración•Conos de hule•Papel filtro Whatman No. 541•Pipeta de 500 ml•Desecador•Horno de laboratorio•MuflaPreparación dela porción de ensayo:- Para productos con contenido de grasa menor de 2%, se trabaja directamente.- Para productos con contenido de grasa mayor de 2%, desgrasar por método Soxhlet.
  26. 26. Preparación de la muestra:• Productos líquidos o pastosos: se homogeniza la muestra agitándola con varilla devidrio o agitador por 15 segundos.• Productos sólidos o semisólidos: se toman 3 porciones en puntos diferentes de lamuestra y se tritura en un mortero hasta obtener una mezcla homogénea.•Productos en fase sólida y líquida: para productos de más de 30 días de producido, sesepara la fase líquida y se agita por 15 segundos, se trabaja con esta y se desecha la fasesólida. Para productos con menos de 30 días de producido, se homogeniza la muestrahaciéndola pasar por una licuadora, retirando previamente las semillas u otras materiasque puedan interferir.• Frutas frescas: dependiendo del tipo, se pican en pequeñas porciones, se muelen olicuan.• Frutas deshidratadas y especias: se muelen 3 veces o se pasan por unalicuadora, efectuándolo de forma rápida para evitar afectaciones de la muestra.
  27. 27. Método1. Pese con aproximación de miligramos de 2 a 3 gramos de la muestra desengrasada y seca. Colóquela en el matraz y adicione 200ml de la solución de ácido sulfúrico en ebullición.2. Coloque el condensador y lleve a ebullición en un minuto; de ser necesario adiciónele antiespumante. Déjelo hervir exactamente por 30 min, manteniendo constante el volumen con agua destilada y moviendo periódicamente el matraz para remover las partículas adheridas a las paredes.3. Instale el embudo Buchner con el papel filtro y precaliéntelo con agua hirviendo. Simultáneamente y al término del tiempo de ebullición, retire el matraz, déjelo reposar por un minuto y filtre cuidadosamente usando succión; la filtración se debe realizar en menos de 10 min. Lave el papel filtro con agua hirviendo.4. Transfiera el residuo al matraz con ayuda de una pipeta conteniendo 200ml de solución de NaOH en ebullición y deje hervir por 30 min como en paso 2.5. Precaliente el crisol de filtración con agua hirviendo y filtre cuidadosamente después de dejar reposar el hidrolizado por 1 min.
  28. 28. 6. Pese rápidamente los crisoles con el residuo (no los manipule) y colóquelos en la mufla a 550°C por 3 horas, déjelos enfriar en un desecador y péselos nuevamente.7. Lave el residuo con agua hirviendo, con la solución de HCI y nuevamente con agua hirviendo, para terminar con tres lavados con éter de petróleo. Coloque el crisol en el horno a 105°C por 12 horas y enfríe en desecador.CálculosA = Peso del crisol con el residuo seco (g)B = Peso del crisol con la ceniza (g)C = Peso de la muestra (g)Contenido de fibra cruda (%)= 100((A - B)/C)
  29. 29. Determinación de Fibra por Detergente ÁcidoEste método permite tener una aproximación del grado de digestibilidad de las fibras en elalimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en ácido sulfúrico y elresiduo es considerado como la fibra no digerible.Reactivos•Solución de detergente ácido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco a poco 56 ml deácido sulfúrico concentrado, lleve la solución a un volumen final de 2 1 con agua y agregue20g de Cetil-trimetil-amonio.•Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno)•AcetonaMateriales y Equipo•Horno•Matraces Erlenmeyer de 500 ml•Mantilla de calentamiento•Condensador de dedo frío•Crisoles de filtración, porosidad 1
  30. 30. Procedimiento1. Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm.2. Tome una submuestra y séquela durante la noche en un horno a 105°C.3. Enfríe la muestra en un desecador.4. Pese con aproximación de miligramos un gramo de la muestra seca y colóquela en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.5. Adicione 100 ml de la solución de detergente ácido y 2 ml del antiespumante.6. Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado.7. Lleve rápidamente a ebullición (3 a 5 minutos) y continúe el calentamiento por 2 horas.8. Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado.9. Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre.10. Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succión débil (por vacío).11. Enjuague el residuo con acetona y seque.12. Coloque el crisol en el horno a 105°C durante 12 horas.13. Enfríe dentro de un desecador la muestra e inmediatamente después determine el peso.CálculosContenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1)DondeW1 = Peso de muestra (g)W2 = Peso del residuo (g)
  31. 31. Determinación del contendido de fibra por el método de detergente ácido.
  32. 32. Determinación de Fibra por Detergente NeutroEste método tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales solubles. Tienelimitaciones en su precisión cuando los valores de proteína son muy altos y los valores defibra son bajos.Reactivos•Solución detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg de sulfato laurilsódico USP, 18.61 g de etilendiamino tetra acetato disódico dihidrogenadodehidratado, 6.81 g de borato de sodio decahidratado y 4.56 g del reactivo fosfato ácidodisódico anhidro. Agítese hasta disolver y mantenga el pH entre 6.9 y 7.1.•Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H2O mas 10 ml de etilenglicol.•Acetona grado reactivo.•Sulfito de sodio anhidro. Se usa únicamente en análisis de subproductos animales.
  33. 33. Materiales y Equipo•Equipo de reflujo. Cualquier equipo estándar adecuado para el análisis de fibra.•Crisoles de filtración en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa defiltración de 40mm de diámetro con capacidad para 40 – 50 ml de líquido.•Cuando los crisoles se obstruyen después de un uso continuo se prepara una soluciónlimpiadora de 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasarcaliente en sentido opuesto a través del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de lasolución pues tiende a erosionar el vidrio.Procedimiento1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y deposítela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo.2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra.3. Caliente para que la solución hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullición reduzca la temperatura para evitar la formación de espuma. Ajuste la temperatura para que la solución hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir.
  34. 34. 4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para succión al vacío. Pase toda la muestra al crisol utilizando un mínimo de agua caliente (80°C) para el lavado del matraz. Afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra del filtro y seque.5. Seque los crisoles a 105°C durante 12 h y péselos en caliente (esta operación no debe durar más de 30 seg).6. El residuo de fibra recuperado se registra en términos de paredes celulares.7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100.Cálculosa. Paredes celulares (%) en “base seca” o “como se ofrece”. 100((peso del crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra.b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares.% contenido celular = 100 - % paredes celulares.
  35. 35. Determinación del contendido de fibra por el método de detergente neutro
  36. 36. MÉTODOS BIOQUÍMICOS Métodos enzimáticosEstos métodos son los más eficientes debido a que el procedimiento analítico se asemejaal proceso fisiológico de degradación de nutrientes que tienen lugar en el organismohumano, en el cual participan enzimas. De ahí que los resultados obtenidos con laaplicación de los métodos enzimáticos son más confiables y cercanos al valor real delcontenido de fibra dietética.El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posibledeterminar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad deseparar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final.b. Métodos cinéticos.
  37. 37. Algunas condiciones de incubación en los métodos gravimétricos enzimáticos.
  38. 38. Dependiendo del proceso que se siga una vez se han realizado las etapas de incubaciónenzimática, se podrá determinar el contenido de fibra dietética soluble (FDS) o fibradietética total (FDT).Al concluir la etapa de incubación enzimática, el extracto se filtra y el residuo sólido quequeda está constituido por la fibra dietética insoluble, mientras que los productos dehidrólisis de las proteínas (aminoácidos y péptidos) y del almidón (monosacáridos ydisacáridos) estarán contenidos en el filtrado conjuntamente con la fibra dietética soluble.En los métodos enzimáticos, además de eliminar la interferencia de los minerales (porincineración), se realiza una corrección adicional para eliminar también las interferenciaspor las proteínas no solubilizadas por la acción enzimática (proteínas no digeribles), lascuales no se incluyen entre los componentes de la fibra dietética.En esta corrección, se determina el contenido de proteínas (método Kjeldahl) al residuoseco obtenido de la filtración del extracto. El valor de proteínas resultante se resta alvalor de fibra calculado.
  39. 39. Esquema analítico de determinación de FDI, FDS y FDT.
  40. 40. En el método de la AOAC sugerido por Prosky y colaboradores (1.984) para la determinación de fibra dietética total, se mantiene la etapa de gelatinización inicial con amilasa termoestable (15-30 min), pero las enzimas fisiológicas son reemplazadas por una proteasa de B. subtilis (30 min) y aminoglucosidasa (30 min).Esquema analítico de determinación de FDT
  41. 41. Determinación enzimática de glucosa y sacarosa en alimentosFundamentosAunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecende especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto enanálisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para ladeterminación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específicaque cataliza la oxidación de la glucosa aβ-D- gluconolactona, sin que ningún otro azúcarnatural reaccione en extensión apreciable. GOD C6 H12 O6 + O2 C6 H10 O6 + H2 O2Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o medianteun electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacciónespectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacciónenzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por elmétodo de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que eliminael peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un coloranteadecuado según el siguiente esquema de reacción: H2 O2 +Aceptor de oxígeno Producto coloreado+ H2 O (DH2) (D)
  42. 42. MATERIAL, REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓNa. Instrumentación− Espectrofotómetro monohaz Spectronic 20 con cubetas de 1 cm de paso de luz.b. Material• 4 matraces de 100 ml• 8 matraces de 50 ml• 1 vaso de 250 ml, 2 vasos de 100 ml• 1 embudo, papel de filtro, vidrio de reloj.• Cronómetroc. ReactivosReactivo Trinder: Disolución que contiene todos los reactivos necesarios para ladeterminación de la glucosa por el método propuesto en las concentraciones que seindican a continuación:•4-aminoantipirina 0,3 mmol/L•Fenol 8,5 mmol/L• Glucosa oxidasa (GOD) obtenida de Aspergillus Niger 10 U/mL• Peroxidasa de rábano silvestre (Horseradish peroxidase, HRP) 0,3 U/mL
  43. 43. Estos reactivos, en las cantidades adecuadas, se suministran en una disolución reguladorade pH 6,6 lista para su uso. Esta disolución debe almacenarse en botellas color topacio yen el refrigerador. Si se mantiene entre 2 –8 ºC la disolución estable durante 2 meses.Disolución de invertasa 100 U/ml en tampón de citrato 0,1 M de pH 4,6. Preparar 50 mlDisolución patrón de glucosa 0,01 MDisolución Carrez I. Disolver en agua 3,6 g de ferrocianuro potásico y llevar a 100 mlDisolución Carrez II. Disolver en agua 7,2 g de acetato de zinc y llevar a 100 mlPROCEDIMIENTOSe empleará un método de tiempo fijo para la cuantificación de glucosa y sacarosa en unamuestra de zumo comercial.Para la construcción de la línea de calibrado deben prepararse cinco disoluciones deglucosa de concentraciones comprendidas entre 5×10-5 M y 5×10-4 M por dilución delpatrón de glucosa. Añadir a la cubeta del espectrofotómetro 1 mL de reactivo Trinder y250 µL de patrón, mezclar e incubar exactamente 5 minutos a temperatura ambiente.Medir a continuación la absorbancia de la mezcla de reacción a 505 nm frente a un blancode reactivos.
  44. 44. Para la determinación de glucosa y sacarosa en la muestra, esta se diluirá con agua en laproporción adecuada según el contenido de glucosa y sacarosa esperado. Las muestrasturbias deben tratarse con los reactivos Carrez y filtrarse. Para ello pipetear 2 ml demuestra en un vaso que contenga unos 30 ml de agua, añadir 2,5 ml de disoluciónCarrez I y 2,5 ml de disolución Carrez II. Filtrar, recoger cuantitativamente en unmatraz de 100 ml y llevar a volumen.Para la determinación del contenido de glucosa, se procederá con la disolución diluida dela misma manera que con los patrones de glucosa.Para determinar el contenido de sacarosa se llevará a cabo en primer lugar su hidrólisisenzimática a glucosa y fructosa (inversión) con invertasa. Para ello se toman 2 ml de ladisolución de muestra (con un contenido máximo de sacarosa de 1 g/L) y se mezclancon 8 ml de la disolución de invertasa. Se incuban 15 minutos a 55 ºC. La suspensión fríase filtra, se lava el filtro y se recoge cuantitativamente en un matraz aforado enrasandocon agua hasta la marca, realizando a continuación la determinación del contenido totalde glucosa según el procedimiento anteriormente descrito. El contenido de sacarosa seobtiene por diferencia entre las concentraciones de glucosa obtenidas antes y después dela inversión enzimática. Expresar el contenido de glucosa y sacarosa en la muestra eng/L.
  45. 45. Espectrofotómetro monohaz Spectronic

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