Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

EAP παρουσίαση πτυχιακής εργασίας

2,561 views

Published on

H παρουσίαση της εργασίας μου στα πλαίσια του μεταπτυχιακού μου στο ΕΑΠ

Published in: Science
  • Be the first to comment

EAP παρουσίαση πτυχιακής εργασίας

  1. 1. Ρυθμιστικοί ρόλοι των μορίων RNA. Μηχανισμοί, εφαρμογές και σύγχρονες εξελίξεις. ΜΙΧΑΗΛ Ι. ΣΚΡΙΜΠΑΣ     Επιβλέπων καθηγητής: ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ    ΑΘΗΝΑ ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ,2013
  2. 2. Ο κόσμος του RNA Coding messenger RNA (mRNA)  Μεταφέρει την γενετική πληροφορία  Λάθη στην επεξεργασία του, οδηγούν σε σοβαρές παθήσεις Non-coding • Ribosomal RNA (rRNA) • Transfer RNA (tRNA) • Small nuclear RNA (snRNA) • Small nucleolar RNA (snoRNA) • Interference RNA (RNAi) • Short interfering RNA (siRNA) • Micro RNA (miRNA) Ribonucleic acid - Ριβονουκλεϊκό οξύ Σπουδαιότητα: Καταλύει την μεταγραφή του DNA. Μόριο RNA είναι εκείνο που «εκφράζεται» σε πρωτεϊνες. Ρυθμίζει διάφορες λειτουργίες του κυττάρου. Αντιμετώπιση γονιδιακών ανωμαλιών που οδηγούν σε ασθένειες όπως ο καρκίνος. Μόρια RNA
  3. 3. Μηνυματοφόρο RNA – messenger RNA  RNA πολυμεράσες μεταγράφουν το δίκλωνο DNA σε μονόκλωνο RNA.  Τροποποίηση των άκρων του pre- mRNA ώστε να εξέλθει από τον πυρήνα και να αποκτήσει σταθερότητα (capping και poly-A ουρά).  Ειδικά μικρά RNAs αποκόπτουν τα εσώνια και δημιουργούν το ώριμο, προς μετάφραση, mRNA.  Το ώριμο mRNA μεταφράζεται στο κυτταρόπλασμα από το ριβόσωμα.  Το εναλλακτικό μάτισμα δημιουργεί διαφορετικά mRNA οπότε και παραγωγή διαφορετικών πρωτεϊνών.
  4. 4. Μη κωδικά RNA – non coding RNA • Συμμετέχουν στην ενδονουκλεοτιδική διάσπαση και σύνθεση RNAs. • Έχουν ενζυμική δράση. • Επεξεργάζονται και τροποποιούν άλλα RNAs. • Συμμετέχουν στην μεθυλίωση του DNA. • Συνθέτουν τελομερή του DNA. • Συμμετέχουν στην γονιδιακή ρύθμιση.
  5. 5. Μικρά πυρηνισκικά RNA -snoRNAs •Μέγεθος <100nt, διαχωρίζονται σε: C/D box και H/ACA box. •Τροποποιούν άλλα μόρια RNA κυρίως rRNA, tRNA και snRNA. •Συμπλοκοποιούνται με πρωτεΐνες σε snoRNP τέμνοντας το pre-mRNA. •Δείκτες θετικής διάγνωσης μη μικροκυτταρικού καρκίνου αλλά και του καρκίνου του εγκεφάλου. Μικρά πυρηνικά RNA -snRNAs •Πλούσια σε ουρακίλη - δρουν στο πυρηνόπλασμα έχοντας συντεθεί από την pol-II. •Ομάδα Sm με αλληλουχία U ανάμεσα σε δύο δομές διχάλας και ομάδα LSM με την αλληλουχία U στο 3΄ άκρο. • Αποτελούν τον πυρήνα του σπλισεοσώματος εκτός του U7 που συμμετέχει στην επεξεργασία των ιστόνων του pre-mRNA. •Ρόλος σε γενετικές ανωμαλίες που προκαλούν την νωτιαία μυική ατροφία αλλά και tauopathies.
  6. 6. RNAs σωματιδίων Cajal - scaRNAs •Βρίσκονται στα σωματίδια Cajal και περιέχουν και την C/D και την H/ACA ομάδα. •Τροποποιούν snRNAs με μεθυλίωση και με σύνθεση ψευδοουρίνης. •Έχουν σημαντικό ρόλο, μέσω των snRNAs, στην εμφάνιση της Νωτιαίας Μυϊκής Ατροφίας. RNA υπομονάδα τελομεράσης • Ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο που επιμηκύνει τα τελομερή. • Αποτελείται από την TERT και την TERC. • Συνεργάζεται με πρωτεϊνες και μεταλλάξεις της οδηγούν σε νόσους όπως η συγγενής δυσκεράτωση (πρόωρη γήρανση). • «Τελομεριδιακή θεωρία της γήρανσης».
  7. 7. Οδηγοί RNA - guide RNAs •Απαραίτητα στην ωρίμανση και σωστή λειτουργία των περισσοτέρων πρωτεϊνών του μιτοχονδριακού mRNA. •Προσθέτουν κατάλοιπα ουρακίλης σε συγκεκριμένες θέσεις του mRNA. •Προκαλούν σίγηση ή ενίσχυση της παραγωγής συγκεκριμένης πρωτεΐνης. •Χρήση στην αντιμετώπιση πολλών μορφών καρκίνου. Σωμάτιο αναγνώρισης σήματος - SRP RNA •Αποτελείται από RNA και πρωτεϊνες και προσκολλάται σε υποδοχείς στο ER. •Αναγνωρίζει συγκεκριμένη αλληλουχία αμινοξέων στο άκρο πρωτεϊνών, βοηθά την μετακίνηση τους. •Aλληλουχίες Alu που ανιχνεύονται σε πολλές γενετικές ανωμαλίες. • Το 7SL SRP RNA περιέχεται στο πακέτο ρετροϊών.
  8. 8. Αντινοηματικά RNAs - antisense RNAs •Έχουν συμπληρωματική αλληλουχία ως προς την περιοχή-στόχο του mRNA. •H ένωση asRNA-mRNA στον πυρήνα, εμποδίζει την επεξεργασία και την μεταφορά στο κυτταρόπλασμα ενώ ένωση στο κυτταρόπλασμα εμποδίζει την μετάφραση. •Αναστολή έκφρασης γονιδίου “gene knock down”, αντιμετώπιση μεταλλάξεων “gain of function” αλλά και υπερέκφρασης πρωτό-ογκογονιδίων. RNAs εξαρτώμενα από PiWi πρωτεΐνες - piRNA • Έλεγχος της δράσης των μεταθετών στοιχείων (transposable elements TEs), που έχουν ως αποτέλεσμα την αλλοίωση και την μετάλλαξη της γονιδιακής αλληλουχίας. • Το σύμπλοκο piRISC, αναγνωρίζει και απενεργοποιεί την δράση των Tes. • Δυσλειτουργίες σε δύο μέλη των PIWI πρωτεϊνών σε ποντίκια, οδηγούν σε αντιμεταθέσεις της ανδρικής γαμετικής σειράς προκαλώντας στειρότητα.
  9. 9. • Προέρχονται από την επεξεργασία του 5’ ή 3’ άκρου του tRNA. • Τρεις ομάδες, ανάλογα με την περιοχή του tRNA από την οποία προήλθαν. Η πρώτη προήλθε από το 5΄ άκρο ώριμο ή πρώιμου tRNA, η δεύτερη από το 3΄ άκρο που περιλαμβάνει και την CCA αλληλουχία και η τρίτη ομάδα προήλθε από το 3΄ άκρο πρώιμου tRNA ή pre-tRNA, ονομάζονται 3΄ ακόλουθοι (trailers). • Η έκφραση τους συνδέεται με την εμφάνιση καρκίνου, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την στοχευμένη γονιδιακή αποσιώπηση. Θραύσματα tRNA - tRFs
  10. 10. Ριβοένζυμα • RNA με καταλυτικές ιδιότητες, ανατρέπουν την άποψη πως μόνο οι πρωτεΐνες μπορεί να αποτελούν ένζυμα καθώς και την θεωρία της εξέλιξης. (Πως έγινε η σύνθεση DNA χωρίς ένζυμα ή αντίστροφα πως έγινε η σύνθεση ενζύμων χωρίς DNA;) • Καταλύουν χημικές αντιδράσεις και δεσμούς σε άλλα μόρια αλλά και στον εαυτό τους. • Εκτός άλλων, περιλαμβάνουν το ριβοένζυμο της ηπατίτιδας D, το ριβοένζυμο “φουρκέτα” και το σφυροκέφαλα ένζυμα εμπλέκονται στην διαδικασία της RNA αντιγραφής διαχωρίζοντας και ενώνοντας νουκλεοτίδια. • Το ριβόσωμα περιέχει ριβοένζυμα διότι παραμένει ενεργό ακόμη και μετά την απομάκρυνση των συνεργαζόμενων με αυτό πρωτεϊνών. Η πεπτιδυλοτρανσφεράση δεν περιέχει πρωτεϊνικά στοιχεία. • Καταλυτικά RNAs είναι και οι ριβοδιακόπτες (Glms σε βάκιλους).
  11. 11. microRNAs•Ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση!!! •RNA μόρια μεγέθους περίπου 22nt που προσδένονται στο mRNA και καταστέλλουν την πρωτεϊνοσύνθεση. •Βιοσυντίθενται από το πρόδρομο microRNA με την βοήθεια των ενδοριβονουκλεασών Drosha και Dicer. •Είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του οργανισμού αλλά και στην κυτταρική διαφοροποίηση. •Σχετίζονται με διάφορους τύπους καρκίνου ως προς την ανίχνευση τους αλλά και στην ύπαρξη μετάσταση τους.
  12. 12. microRNAs • Το πρώιμο-miRNA μεταγράφεται στον πυρήνα και έχει συνήθως μεγάλο μέγεθος, ενώ περιλαμβάνει 5’ κάλυμμα και poly-A ουρά. • “Κόβεται” από το ένζυμο Drosha σε ένα μετάγραφο μεγέθους 70nt με δομή φουρκέτας (pre-miRNA). • Μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα από την Exportin 5. • “Κόβεται” από το ένζυμο Dicer (της οικογένειας της RNase III) σε δίκλωνα μετάγραφα μήκους 19-22nt. • Ενώνεται με το σύμπλοκο RiSC και οδηγείται στην 3’ UTR περιοχή του mRNA στόχου, του οποίου ρυθμίζει την έκφραση.
  13. 13. • Έχουν μέγεθος 20-25nt και συμμετέχουν στην τεχνική της παρεμβολής RNA (RNA interference) αλλά και στην μεταγραφική γονιδιακή ρύθμιση (TGS). • Αποτελούν εργαλείο για τους επιστήμονες ως προς την σίγηση και την υπερέκφραση γονιδίων και υπάρχουν πολλοί τρόποι να εισαχθούν στο κύτταρο. • Δίκλωνο RNA κόπτεται από την DICER σε μικρά κομμάτια siRNAs τα οποία ενώνονται με το RiSC και κατευθύνονται στο mRNA στόχο. Μικρά παρεμβαλόμενα RNAs - siRNAs
  14. 14. siRNAs Μπορούν να δημιουργηθούν και να εισαχθούν στα κύτταρα από/με: • Χημικές ή ενζυμικές διεργασίες. • Από την δράση RNaseIII/Dicer σε μεγάλα dsRNAs. • Με πλασμίδια ή ιϊκά πακέτα,επείτα από μελέτες έκφρασης in vivo.
  15. 15. Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης • Μεταγραφικοί μηχανισμοί – Είδη ενισχυτών και RNA πολυμεράση – Έλεγχος της μεταγραφής – Μεταγραφικοί παράγοντες • Μεταφραστικοί παράγοντες – Micro RNAs (miRNAs) • Έλεγχος μετάφρασης • αποδόμηση mRNA – επεμβατικά RNAs (siRNAs & RISC complexes) που αποσιωπούν γονίδια • Επιγενετικοί μηχανισμοί – Έλεγχος της δομής της χρωματίνης – Τροποποιήσεις των ιστόνων (ακετυλίωση, φωσφορυλίωση κ.α.) – Μεθυλίωση DNA
  16. 16. Η σημασία της ανακάλυψης του μηχανισμού RNA interference • Ο μηχανισμός RNA interference προστατεύει έναντι των ιϊκών μολύνσεων. (αποσιώπηση της έκφρασης των ιικών γονιδίων) • Το RNAi διασφαλίζει την σταθερότητα του γονιδιώματος με το να διατηρεί αποσιωπημένα διάφορα μεταθετά στοιχεία (transposons elements). Με την RNAi μπορούμε να τα εξαλείψουμε ή να τα απενεργοποιήσουμε. • Καταστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης και ρύθμιση της ανάπτυξης των οργανισμών. • Διατήρηση της χρωματίνης σε συμπυκνωμένη κατάσταση και παρεμπόδιση της μεταγραφής. • Ο RNAi μηχανισμός αποτελεί ένα νέο πειραματικό εργαλείο για ειδική γονιδιακή καταστολή. • Ο RNAi μηχανισμός μπορεί να αποτελέσει μια χρήσιμη προσέγγιση για μελλοντική γονιδιακή θεραπεία Παρεμβολή RNA – RNA interference
  17. 17. Παρεμβολή RNA – Μηχανισμός 1) Το dsRNA μέσω της Dicer δίνει μικρά siRNA. 2) Το siRNA συνδέεται με το RISC. 3) Τα siRNA θα γίνουν μονόκλωνα με αλληλουχία συμπληρωματική προς εκείνη του mRNA στόχου. 4) Το μονόκλωνο siRNA συνδέεται με το συμπληρωματικό mRNA και το mRNA θα κοπεί μέσω της Slicer.
  18. 18. RNAi – TGS - PTGS • Το σύμπλοκο RISC (RNA-induced silencing complex-RISC) που αποτελείται από πρωτεΐνες που ανήκουν στην ομάδα Argonaute. • Η Dicer είναι ριβονουκλεάση της ομάδας ΙΙΙ και ονομάζεται ένζυμο διασπαστής το οποίο καταλύει τη διάσπαση μεγάλων δίκλωνων μορίων RNA σε μικρότερα των 20-25 νουκλεοτιδίων. • Τα siRNAs έχουν τέλεια συμπληρωματικότητα ως προς την αλληλουχία στόχο ενώ τα miRNAs,όχι. Επίσης τα miRNAs έχουν ενδογενή «καταγωγή» ως προς το κύτταρο ενώ τα siRNAs συνήθως εισάγονται στο κύτταρο. • Η τεχνική RNAi θέλουμε να επεκταθεί ώστε να εφαρμόζεται σε περισσότερα του ενός γονίδια κάθε φορά και αυτό μελετάται με τις γονιδιακές σαρώσεις. • Η «μεταγραφική γονιδιακή σίγηση» συνήθως αφορά την μεθυλίωση του DNA άρα κληρονομείται. • Η RNAi στα φυτά ονομάζεται μετα-μεταφραστική αποσιώπηση (PTGS).
  19. 19. RNAi και έλεγχος της χρωματίνης • siRNA ή piRNAs μεθυλιώνουν τις ιστόνες προκαλώντας σίγηση του γονιδίου (μεθυλίωση της λυσίνης της ιστόνης H3) • RNA-induced transcriptional silencing (RITS), πρωτεϊνικό σύμπλοκο που ενώνεται με τα siRNAS και αλληλεπιδρά με κατάλοιπα λυσίνης.
  20. 20. Εφαρμογές μεθόδου RNAi • Καρκίνος – Η οικογένεια miR-17-92 σε συνδυασμό με την myc, συμβάλει στην ανάπτυξη όγκων. Άρα miRNAs δρουν ως ογκογονίδια. – Υποέκφραση των miRNAs οδηγεί σε καρκινογένεση (πχ. miR-15a στην χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία) . – Η p53 ρυθμίζει την έκφραση τριών miRNAs και αυτό οδηγεί σε αναστολή της έκφρασης μιας ομάδας γονιδίων-στόχων που φυσιολογικά υποστηρίζουν την ανάπτυξη του όγκου. – Παρεμβολή RNA με στόχο την αποσιώπηση της έκφρασης της myc είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ογκογένεσης σε ποντίκια.
  21. 21. Εφαρμογές μεθόδου RNAi • Καρκίνος – Όταν απορρυθμίζονται τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs τότε δρούν ως ογκογονίδια ή ως ογκοκαταστολείς. – Η θεραπευτική RNAi τεχνολογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάνοντας εισαγωγή in vitro συντεθειμένου μικρού RNA (small interfering RNA, siRNA). – Συνήθως ως φορείς χρησιμοποιούνται ιοί λόγω της εξειδίκευσης που παρουσιάζουν ως προς συγκεκριμένα κύτταρα αλλά και της αποτελεσματικής εισόδου τους στα κύτταρα. – Χρειάζεται να ανιχνευτούν καλύτεροι τρόποι εισαγωγής των μορίων στα κύτταρα αλλά και τρόποι αντιμετώπισης της ανοσοαπόκρισης του οργανισμού στο μόριο – «εισβολέα». – Αποδοτικός σχεδιασμός του siRNA ώστε να επιτευχθεί η σύνδεση του στο mRNA στόχο.
  22. 22. Εφαρμογές μεθόδου RNAi
  23. 23. Εφαρμογές μεθόδου RNAi • Λοιμώδεις νόσοι Εισαγωγή στο μολυσμένο κύτταρο dsRNA συμπληρωματικό στο mRNA του ιού. Η μεταξύ τους σύνδεση σταματά την παραγωγή των πρωτεϊνών που χρειάζεται ο ιός. (πχ HIV ιός) • Νευροεκφυλιστικές διαταραχές Οφείλονται σε γενετικές μεταλλάξεις και στόχος της παρέμβασης είναι η καταστολή της έκφρασης των μεταλλαγμένων γονιδίων. Για παράδειγμα στην χορεία Huntington, siRNAs καταστέλλουν την έκφραση της τοξικής μεταλλαγμένης htt πρωτεΐνης. • Καρδιαγγειακές νόσοι Η αρτηριοσκλήρυνση οφείλεται στην τοπική παραγωγή κυτοκινών που οδηγεί στην απόπτωση λείων μυϊκών κυττάρων. Παρέμβαση με siRNAs που θα είχαν ως στόχο συγκεκριμένη αλληλουχία του mRNA θα παρεμπόδιζε την παραγωγή των κυτοκινών.
  24. 24. Προοπτικές • Η αποσαφήνιση του ρόλου των γονιδίων και ο έλεγχος της λειτουργίας μπορεί να οδηγήσει στην θεραπεία σημαντικών ασθενειών • Με την μεθυλίωση των ιστόνων και τον έλεγχο της μορφής της χρωματίνης μπορούμε να παρεμποδίσουμε την έκφραση μη επιθυμητών χαρακτηριστικών. • Με την παρεμβολή RNA μπορούμε να δημιουργήσουμε πιο αποτελεσματικά θεραπευτικά πρωτόκολλα. • Προκλήσεις που μένουν να αντιμετωπιστούν. α) Η αποτελεσματική σύνθεση siRNAs και η δημιουργία «βιβλιοθήκης» RNAi. β) Η ενίσχυση της επιθυμητής και αποτροπή της λανθασμένης σύνδεσης των μορίων της RNAi σε off-target αλληλουχίες. γ) Ο έλεγχος της ανοσοαπόκρισης του οργανισμού.
  25. 25. Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας Μιχάλης Ι. Σκρίμπας

×