Praktikum 4 07

2,056 views

Published on

Published in: Travel, Business
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
2,056
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
42
Actions
Shares
0
Downloads
25
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Praktikum 4 07

  1. 1. Praktikum 3 dokončení
  2. 2. Spermatogeneze - viz ukázka v mikroskopu 1 – leptotene/zygoten 2 – pachyten 3 – mladší spermatidy 4 – starší spermatidy 5 – Sertoliho buňky 6 - spermatogonie
  3. 3. Preimplantační diagnostika <ul><li>Genetická, popř. jiná vyšetření vajíčka či embrya prováděná před implantací do těla matky. </li></ul><ul><li>Využíváme </li></ul><ul><ul><li>Pólové tělísko </li></ul></ul><ul><ul><li>1 – 2 buňky z 8-buněčného embrya </li></ul></ul><ul><ul><li>Větší počet buněk z blastocysty </li></ul></ul>
  4. 4. Etické problémy asistované reprodukce <ul><li>Náhradní (surogátní) matky </li></ul><ul><ul><li>Kdo je matka? </li></ul></ul><ul><li>Dárcovství spermie </li></ul><ul><ul><li>Anonymita? </li></ul></ul><ul><ul><li>Legalizovaná nevěra? </li></ul></ul><ul><li>IVF </li></ul><ul><ul><li>osud nadbytečných embryí – pokusy na lidech? </li></ul></ul><ul><ul><li>vícečetná těhotenství – fetocida </li></ul></ul>
  5. 5. Test <ul><li>5 otázek </li></ul><ul><li>10 minut </li></ul><ul><li>Nezapomeňte uvést své jméno, kruh a verzi, kterou píšete. </li></ul><ul><li>U otázek zaměřených na výběr z více alternativ je možná 1 i více správných odpovědí. Možný je i krátký doprovodný komentář. </li></ul><ul><li>U otázek zaměřených na konkrétní odpověď nepsat „romány“. </li></ul>
  6. 6. Praktikum 4 Kultivace buněk in vitro
  7. 7. Kultury <ul><li>Orgánové </li></ul><ul><li>Tkáňové </li></ul><ul><li>Buněčné </li></ul><ul><ul><li>Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se samostatně dělí – tak vzniká buněčná kultura . </li></ul></ul>Oba termíny se často zaměňují.
  8. 8. Alexis Carrel (1873 – 1944)
  9. 9. Složení média <ul><li>základní anorganické živiny </li></ul><ul><li>stopové prvky </li></ul><ul><li>stabilizátory pH (CO 3 2- /HCO 3 - , HPO 4 2- /H 2 PO 4 - ) </li></ul><ul><ul><li>pH = 7,2 – 7,4 </li></ul></ul><ul><li>glukóza </li></ul><ul><li>aminokyseliny </li></ul><ul><li>vitaminy a jiné složky různých enzymů </li></ul><ul><li>mastné kyseliny a lipidy </li></ul><ul><li>specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení </li></ul><ul><li>sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) </li></ul><ul><li>antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) </li></ul>
  10. 10. Kultivační podmínky <ul><li>Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami. </li></ul><ul><li>Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit. </li></ul><ul><li>V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý. </li></ul>
  11. 11. Práce ve sterilním boxu
  12. 12. Pasážování buněk <ul><li>Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru. </li></ul><ul><li>Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky </li></ul>
  13. 13. Buněčné kultury <ul><li>živočišných buněk </li></ul><ul><ul><li>savčích buněk (včetně lidských) </li></ul></ul><ul><li>rostlinných buněk </li></ul><ul><ul><li>explantátové kultury </li></ul></ul><ul><ul><li>význam ve šlechtitelství a genetickém inženýrství – produkce transgenních plodin </li></ul></ul>kultura makrofágů explantátová kultura – tzv. kalus
  14. 14. Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme: <ul><li>kultury epiteliálních buněk </li></ul><ul><li>k. fibroblastoidních buněk </li></ul><ul><li>k. lymfoblastoidních buněk </li></ul><ul><li>k. neuroblastoidních buněk </li></ul>
  15. 15. Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin: <ul><li>Primokultury (též primární kultury) </li></ul><ul><ul><li>obsahují buňky čerstvě izolované z organismu </li></ul></ul><ul><ul><li>existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily, převést do nového média. </li></ul></ul><ul><li>Buněčné kmeny </li></ul><ul><ul><li>vycházejí z primárních kultur </li></ul></ul><ul><ul><li>kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň jednou pasážovány </li></ul></ul><ul><ul><li>zhruba po 40-50 děleních zanikají. </li></ul></ul><ul><li>Buněčné linie (též permanentní buněčné linie) </li></ul><ul><ul><li>mají charakter nádorových buněk </li></ul></ul><ul><ul><li>neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho </li></ul></ul><ul><ul><li>vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky původně izolované z nádorů </li></ul></ul>
  16. 16. Růstová křivka buněčné kultury log N čas lag log stacionární fáze úbytek
  17. 17. Referát Nahradí experimenty s buněčnými kulturami pokusy na zvířatech?
  18. 18. Praktické úkoly viz Praktická cvičení str. 21 – 24 – Kapitola 5
  19. 19. Str. 21 – 5.4 Úkol 1: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem <ul><li>Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu. </li></ul><ul><li>Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobky s živou buněčnou kulturou a s fixovanou a obarvenou buněčnou kulturou. </li></ul>
  20. 20. Str. 21 – 5.5 Úkol 2: Počítání buněk v suspenzi ukázka – viz mikroskop u katedry
  21. 21. Str. 22 – 5.6 Úkol 3: Pozorování buněk HeLa <ul><li>Buňky v předložené Petriho misce byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří. </li></ul><ul><li>Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x. </li></ul><ul><li>Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar. </li></ul>
  22. 22. Str. 22 – 5.7 Úkol 4: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO <ul><li>Spočtěte jednotlivé chromozomy na fotografii a povšimněte si jejich utváření. </li></ul><ul><li>Zkuste vysvětlit své výsledky. </li></ul>
  23. 23. Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu karyotyp fúze buněk myší myelomová buňka lidská buňka
  24. 24. Str. 22 – 5.8 Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu <ul><li>Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X </li></ul><ul><li>Klon II: 1, 3, 7, 21, X </li></ul><ul><li>Klon III: 9, 13, 19, 21, X </li></ul><ul><li>Klon IV: 1, 4, 10, 19, X </li></ul><ul><li>Klon V: 2, 3, 13, 20, X. </li></ul><ul><ul><li>a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí. </li></ul></ul><ul><ul><li>b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech. </li></ul></ul><ul><ul><li>c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV. </li></ul></ul><ul><ul><li>d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů. </li></ul></ul>
  25. 25. Průřez semenotvorným kanálkem 1 – leptotene/zygoten 2 – pachyten 3 – mladší spermatidy 4 – starší spermatidy 5 – Sertoliho buňky 6 - spermatogonie
  26. 26. Výsledky úkolů
  27. 27. Úkol 3: Pozorování buněk HeLa Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.
  28. 28. Úkol 4: Chromozomy CHO buněk 21 chromozomů Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře. 7 6 4 4 5 6 3 7
  29. 29. Karyotyp buněk CHO 21 chromozomů Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.
  30. 30. Karyotyp normální a nádorové buňky normální buňka muže nádorová buňka Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.
  31. 31. Úkol 5: Využití buněčných kultur při mapování genomu <ul><li>Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X </li></ul><ul><li>Klon II: 1, 3, 7, 21, X </li></ul><ul><li>Klon III: 9, 13, 19, 21, X </li></ul><ul><li>Klon IV: 1, 4, 10, 19, X </li></ul><ul><li>Klon V: 2, 3, 13, 20, X. </li></ul><ul><ul><li>a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí. </li></ul></ul><ul><ul><li>b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech. </li></ul></ul><ul><ul><li>c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV. </li></ul></ul><ul><ul><li>d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů. </li></ul></ul>Gen pro enzym A leží na chromozomu 2. Gen pro enzym B leží na chromozomu X. Gen pro enzym C leží na chromozomu 19. Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených chromozomů. Praktická cvičení str. 22 – 5.8 Úkol 5
  32. 32. Význam buněčných kultur <ul><li>studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk </li></ul><ul><li>studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi nádorových chorob. </li></ul><ul><li>produkce monoklonálních protilátek. </li></ul><ul><li>testování toxicity, resp. genotoxicity </li></ul><ul><li>klinická genetika – prenatální a postnatální vyšetření </li></ul><ul><li>mapování lidského genomu </li></ul><ul><li>klonování savců </li></ul><ul><li>virologie – kultivace a izolace virů </li></ul>
  33. 33. Příští praktikum <ul><li>téma – Chromozomové vyšetření </li></ul><ul><ul><li>Praktická cvičení – kapitola 6 </li></ul></ul><ul><ul><li>Klinická cytogenetika I. – kapitola 9 </li></ul></ul><ul><li>test – dosavadní učivo z praktik </li></ul>
  34. 34. Na shledanou! Hezké jarní dny přeje E.K.

×