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Vacunas de dna[1]......

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Vacunas generalidades...

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Vacunas de dna[1]......

  1. 1. PRESENTADO POR: Andrea Milena Castro Daniela Sánchez Vera Yohanna Díaz Lee Mario Alejandro Umaña
  2. 2. La vacunación es una de las metodologías con mas impacto en la salud del ser humano. Los avances en microbiología y en técnicas de cultivo in vitro se logro la creación de las primeras vacunas atenuadas. En la actualidad se hacen avances en biología molecular y virología para la nueva generación de vacunas basadas en el DNA. Las vacunas de DNA consisten en vectores plasmídicos a los que se les ha codificado una proteína de algún microorganismo patógeno del cual se quiere proteger.
  3. 3. La expresión genética se lleva a cabo bajo la influencia de un promotor Esta nueva generación de vacunas ha mostrado su eficacia en modelos animales Vacunas de DNA es que constituyen un estímulo potente en la generación de respuestas celulares.
  4. 4. Las vacunas son efectivas para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Se ha logrado un gran avance en el conocimiento tanto de los microorganismos que causan infección ene lo organismo el sistema inmune que lo combate. Las vacunas de DNA estimulan tanto la respuesta humoral como la celular y se utiliza de manera repelida. Para la fabricación de estas vacuna se utilizan plasmídicos, que modifiquen la ubicación final del antígeno en la célula.
  5. 5. Las secuencias de DNA pueden ser modificadas por: Mutación dirigida. Que consiste en el cambio de los aminoácidos individuales que permiten potenciar la respuesta inmune o eliminar determinantes antigénicos. Optimización de codones. Se cambian los tripletes de las secuencias virales, procurando no alterar la estructura primaria de la proteína Las ventajas es la estabilidad de los vectores plasmidicos a diferencia de temperaturas. Por lo que no se invierte mucho en elaboración trasporte y administración
  6. 6. Los inicios de la vacunación con DNA plasmidico Jon A. Wolff, Utilizo DNA plasmidico como control negativo en la trasferencia genética en ratones Se demostró que las células musculares son capaces de expresar genes como consecuencia de la inyección de DNA plasmidicos “desnudo”. Concluyo que la transferencia de genética de DNA plasmidico podría ser utilizada en el desarrollo de vacunas
  7. 7. Se reportaron también anticuerpos contra dos proteínas, la hormona de crecimiento humano y la α 1-antitripsina, mediante la inoculación de DNA codificante para ambas. La vacunación con DNA quedó demostró que la inyección de vectores codificantes para proteínas del virus de la influenza protegían a animales ante un reto mortal con el virus. A partir de estos estudios se han desarrollado vacunas hacia una cantidad de enfermedades virales, bacterianas y parasitarias y dirigidas también al tratamiento de cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas.
  8. 8. Las vacunas de DNA están compuestas por un plásmido bacteriano o vector en el cual se ha insertado una secuencia de cDNA ( complementario) que codifica el antígeno de interés o proteína transgénica. Los plásmidos bacterianos son básicamente los mismos que se utilizan en experimentos que involucran la expresión de proteínas en cultivos celulares
  9. 9. De manera funcional se emplea el DNA en vacunas Segundo componente Función adyuvante interno Unidad transfusionales promotor, intron. (cDNA) codifica ag. Facilita la inserción del gen Sitio de clonación múltiple . Esqueleto plasmidico origen replicación. CpG (regiones del ADN que forman el 40% de los promotores) en secuencia inmunoestimulador a Gen resistente a antibióticos
  10. 10. Representación de la estructura de un vector plasmídico empleado como vacuna de DNA.
  11. 11.  Promotor. la mayoría de las vacunas de DNA contienen el promotor de la región inmediata temprana de Citomegalovirus , el cual permite altos niveles de transcripción de manera constitutiva en una gran variedad de células eucarióticas.  La inclusión de la secuencia del intrón A del citomegacalcivirus (CMV-IA) ha permitido una mejoría en la expresión de DNA complementarios microbianos.
  12. 12. PROMOTORES •Otros promotores virales comunmente utilizados, aunque de expresión más débil, son los del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano viral SV40 SV40 •SV40 es unas 40 veces menos potente que el de CMV, sin embargo funciona de manera óptima en vacunas con inmunógenos como la glicoproteína del virus de la rabia, la cual no genera una buena respuesta inmune cuando se encuentra bajo la influencia del promotor citomegacalcivirus por la posible toxicidad causada a la célula que lo expresa No necesariamente se genera una respuesta inmune más potente con los promotores fuertes, por lo que es necesario elegir el promotor apropiado para el antígeno que se desea emplear.
  13. 13. Es posible lograr una buena respuesta inmune al utilizar promotores no virales como aquellos que participan en la expresión (MHC) de clase I y II. En algunos modelos, los primeros han generado una respuesta inmune más fuerte, mientras que los de clase II propician una respuesta menor Otros promotores, como el de la creatina cinasa muscular que solamente se expresa en músculo esquelético diferenciado han sido empleados en vacunas miogénicas de DNA ofreciendo protección contra la infección del virus Herpes Simplex tipo 2 (HSV-2)
  14. 14. Secuencias que determinan la transcripción Estas se conocen como regiones 3' y la mayor parte de los vectores emplean secuencias provenientes del virus SV40, como el vector Psg5 (actuando como vector). La terminación de la transcripción en las vacunas de DNA se realiza mediante secuencias de terminación y poliadeni lación ubicada en la región 3' del DNA que codifica para el antígeno. Las secuencias de terminación/poliadenilació n dan estabilidad a la molécula de mRNA y están formadas por una secuencia ubicua AATAAA seguida de una secuencia rica en GT o en T, los cuales bajo condiciones óptimas se encuentran separados por 22 ó 23 nucleótidos . .
  15. 15. Las diversas secuencias de terminación provocan variación en los niveles de expresión de las proteínas, ya que se ha mostrado que la sustitución de aquellas provenientes de SV40 provoca un incremento en la expresión de genes como la lucíferasa (enzima oxidativa ).
  16. 16. ORIGEN DE REPLICACION (ORI) Origen de replicación depende del antígeno T y del virus SV4O Se usan en vacunas de DNA 20 Copias de DNA por célula Obtenidas grandes cantidades de DNA plasmidico
  17. 17. SITIO DE CLONACION MULTIPLE Derivo gran numero de vectores usados en la clonación actual Posee sitios de clonación sintéticos Se pueden clonar secuencias de ADN Codificando Ac de genes obtenidos por PCR Mediante medios de restricción de otros plásmidos
  18. 18. Gen de resistencia a antibióticos: Los vectores plasmídicos utilizados como vacunas de DNA se obtienen mediante transformación de bacterias competentes como E. Coli cepa DH5α previamente tratadas con una mezcla de cationes divalentes que las hacen permeables temporalmente a pequeñas moléculas de DNA.
  19. 19.  Consiste en mezclar vacunas de ADN con otros sistemas de administración de genes.  Se administra un ADN codificador de un antígeno como inductor, seguido de otro sistema vectorial basado en genes codificador del mismo antígeno.  Con este sistema hay una mejor respuesta del sistema inmune.
  20. 20. Rutas de inoculación: Mediante diferentes rutas de inoculación, incluyendo intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, epidérmica mediante escarificación de la piel, oral, intranasal y vaginal. Inoculación de DNA encapsulado en microesferas y bacterias atenuadas de los géneros Salmonella, Shigella y Vibrio. Estos últimos ofrecen la posibilidad de generar una respuesta inmune que proteja las mucosas del tracto respiratorio y digestivo, que son el principal sitio de entrada de patógenos. http://revistamedicadelcaribe.files .wordpress.com/2011/05/vacuna- de-perros.jpg http://www.wired.com/wired/archive/10.0 9/images/MF.GeneVaccine_f.jpg
  21. 21. Método a emplear:  la cantidad de DNA a inocular y las características de la respuesta inmune que se desea obtener.  La administración de vacunas mediante agujas requiere de 100 a 1000 veces más DNA que el bombardeo de partículas para inducir una respuesta inmune.  Las cantidades de DNA necesario van de 10 a 100 μg de DNA en inyecciones intramusculares en ratones y hasta 1 mg en primates no humanos para para inducir la aparición de anticuerpos y linfocitos citotóxicos
  22. 22. Método a emplear:  Las dosis empleadas mediante bombardeo de partículas van de 0.1 a 10 μg en ratones y de 0.1 a 100 μg en primates.  Una misma vacuna de DNA puede generar respuestas cooperadoras de tipo Th1 o Th2 al alterar el método y la ruta de inoculación.
  23. 23. bombardeo de partículas inyecciones intramusculares inducir una respuesta T cooperadora de tipo Th2 caracterizada por la producción de las interleucinas (IL) IL-4, IL- 5, IL-6 e IL-10; inmunoglobulinas de la clase IgE y subclases IgG1 que no se unen al complemento y que en conjunto combaten infecciones parasitarias y en mucosas. respuesta cooperadora hacia Th1 en la que se activan células mediadoras de la respuesta inmune celular, se generan anticuerpos que pueden unirse al complemento como IgG2a e IgG2b, y citocinas como IL-2 e interferón gamma (IFN-γ), lo cual en conjunto permite el control infecciones bacterianas intracelulares y virales. Método a emplear:
  24. 24. Mecanismos principales del proceso del antígeno  Transfección de células presentadoras de antígeno :  se encuentran presentes en pequeñas cantidades en músculo y que constituyen un potente estímulo para el sistema inmune. Adicionalmente, se conoce que pueden ser transfectadas in vivo por DNA para generar una fuerte respuesta por linfocitos T citotóxicos http://www.attendbio.com/img/transfeccion.png
  25. 25.  Activación de la respuesta inmune por transfección de células carentes de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II: El papel que éstas células desempeñan lo hacen a través de la síntesis y secreción de proteínas que aumenta la magnitud de la respuesta inmune http://www.monografias.com/trabajos29/piel-estrias/Image928.gif
  26. 26.  Activación cruzada: Durante la activación cruzada, las APCs introducen péptidos o proteínas sintetizados por otras células, y los presentan a linfocitos a través del MHC clases I y II. Esto permite que las células somáticas actúen como reservorios de antígeno, contribuyendo a aumentar la respuesta inmune hacia la proteína transgénica. La activación del sistema inmune por la inyección de un vector plasmídico es un proceso lento, en el que se detectan anticuerpos a las dos semanas de vacunación y se alcanza un máximo en la respuesta alrededor de la semana 10 http://www.profesorenlinea.cl/imagenciencias/linfocitoT0 01.jpg
  27. 27. TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS VACUNAS EMPLEADAS EN LA ACTUALIDAD Y SU COMPARACIÓN CON LAS VACUNAS DE DNA
  28. 28. TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS VACUNAS EMPLEADAS EN LA ACTUALIDAD Y SU COMPARACIÓN CON LAS VACUNAS DE DNA
  29. 29.  las vacunas de DNA inducen una respuesta duradera con una inoculación. Las vacunas vivas y de DNA son unos de los estímulos más potentes para la generación de linfocitos citotóxicos presentados a través del MHC tipo I y por lo tanto no inducen respuestas por linfocitos citotóxicos necesarias para combatir microorganismos intracelulares
  30. 30.  Las vacunas de DNA se consideran seguras, debido a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo (Rabinovich et al., 1994).
  31. 31.  Seguridad. no deben producir efectos secundarios o causar enfermedad alguna. Las vacunas de DNA carecen de este riesgo, y tal vez la principal preocupación en términos de seguridad sea la posibilidad de integración del DNA al genoma del individuo, provocando la activación de proto-oncogenes o inactivación de genes supresores de tumores. Hasta la fecha, se ha observado que el DNA permanece en forma episomal, descartando la posibilidad de integración genómica (Nichols et al., 1995).
  32. 32. Métodos de inoculación. El método de aplicación de ésta no debe de presentar riesgo alguno a los individuos que la reciben o que la aplican. La inmunización con DNA ha sido realizada con éxito mediante administración oral, asi como mediante pistolas genéticas, las cuales se consideran también seguras.
  33. 33.  Memoria inmunológica. generación de una respuesta inmune duradera las vacunas de DNA generan respuestas capaces de durar toda la vida cuando se han probado en ratonesse ha observado en la respuesta humoral basada en anticuerpos, en la generación de linfocitos T cooperadores y de células T citotóxicas, para las cuales las vacunas de DNA se consideran el más potente estímulo.
  34. 34.  Costos. La elaboración de vacunas tradicionales requieren de una infraestructura costosa, por lo que las formas alternativas que puedan reducir este precio son siempre deseables Las técnicas empleadas para clonación de genes en nuevos vectores para vacunación con DNA son bastante simples, rápidas. son estables a temperatura ambiente lo cual contribuye a la disminución significativa de los costos de producción
  35. 35.  Las vacunas de DNA han sido probadas en diferentes patologías incluyendo las vacunas tradicionales, es decir infecciones virales y bacterianas. Y se incluyen dentro del repertorio de la vacunación con DNA las parasitarias, micosis y enfermedades por priones.  su aplicación sea principalmente hacia infecciones virales y por bacterias intracelulares, incluso como tratamiento de enfermedades en las que la vacunación no formaba parte del repertorio empleado para el tratamiento como cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas (Kowalczyk y Ertl, 1999).
  36. 36.  Hasta la fecha, se han utilizado inmumerables modelos animales como ratones, conejos, cobayos, gallinas, gatos, primates no humanos, etc. mostrando diferentes grados de eficiencia en ellos.  Las infecciones contra las que se han utilizado vacunas de DNA en ensayos clínicos en humanos inluyen al Virus de la Inmunodeficiencia Humana (MacGregor et al., 1998) y malaria (Wang et al., 1998), entre otros.
  37. 37.  resultados que se han obtenido en modelos animales son prometedores, sin embargo, los resultados en humanos han sido desalentadores.  estudios recientes demuestran en primates no humanos que las vacunas de DNA contribuyen en gran medida a la generación de una respuesta protectora cuando se utilizan en combinación con virus recombinantes.
  38. 38.  Vacunas: prevención de enfermedades y protección de la salud. Ciro A. de Quadros. Pan American Health Org, 2004  Arturo Reyes Sandoval1 , Aguinaldo R. Pinto2  1Programa Institucional de Biomedicina Molecular Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía,Instituto Politécnico Nacional  Guillermo Massieu Helguera 239, Colonia La Ecalera 07320, México, D.F. 1Instituto Adolpho Lutz,Av. Dr. Arnaldo, 355, São Paulo – SP,01046-902 ,Brasil

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