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Mantenimenti e adesione
cellulare a diversi substrati
SperimEstate 2014
Marta Malavolta
Elisa Mannini
Greta Novelli ISIT B...
Obiettivo
L’obiettivo della nostra ricerca sui
mantenimenti era quello di studiare quali
fossero i substrati più adatti al...
Indice
1. Fibroblasti
2. Mantenimento cellulare
- Split e conta
- Fissazione
3. Substrati
- Polidimetilsilossano (PDMS)
- ...
Fibroblasti
• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di
sintetizzare i componenti ...
Fibroblasti
• I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di
sintetizzare i componenti ...
Mantenimento cellulare
• Il mantenimento di cellule in vitro serve
per studiare fenomeni biologici come la
crescita e l’ad...
• Quando le cellule arrivano a confluenza
(ovvero quando il numero di cellule
diventa elevato e si perdono le condizioni
i...
Fissazione
• La fissazione ha la funzione di
mantenere inalterata la
morfologia dei campioni
biologici al fine di osservar...
Substrati
• I substrati sono materiali che vengono utilizzati per l’adesione
cellulare.
• Ogni substrato presenta caratter...
PDMS
• Il PDMS è un polimero
composto da silicone e un
agente curante.
• È biocompatibile e
perfettamente trasparente
ma n...
Chitina
• La chitina è il secondo
polisaccaride più diffuso
dopo la cellulosa. È il
costituente fondamentale
di crostacei,...
Semina su substrati
• Abbiamo seminato i
fibroblasti in una multiwell
da 24 pozzetti, all’interno
della quale abbiamo inse...
Osservazione dei risultati
Gli strumenti che abbiamo utilizzato per l’osservazione dei campioni sono 3
microscopi di diver...
OSSERVAZIONE RISULTATI AL
MICROSCOPIO OTTICO
Controllo al microscopio ottico
Osservazione cellule del controllo su coverslip.
Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura.
La chitina è stata ricoperta ...
OSSERVAZIONE RISULTATI AL
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
Controllo al microscopio a fluorescenza
La presenza delle cellule esclude eventuali errori sistematici
PDMS al microscopio a
fluorescenza
Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità
(indice di mancat...
Pozzetto del PDMS al microscopio a fluorescenza
Come ulteriore verifica della corretta semina delle cellule (oltre al vetr...
CHITINA al microscopio a fluorescenza
Cellule sulla chitina non trattata per
idrolisi alcalina.
Le cellule sono poche e no...
CHITINA con FIBRINA
al microscopio a fluorescenza
Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le prote...
OSSERVAZIONE RISULTATI AL SEM
CHITINA al SEM
Chitina trattata per idrolisi alcalina a diversi ingrandimenti SEM.
Chitina tratta per idrolisi alcalina ri...
NIH-3T3 su CHITINA al SEM
330 mm 100 mm
15 mm 3 mm
Conclusioni
• Osservando (dopo 24 ore dalla semina) l’effettiva
presenza di cellule nel controllo abbiamo potuto
escludere...
JESSAMINE M. K. NG et al. "Components for integrated poly(dimethylilosane)
microfluidic system ". Electrophoresis (2002) 2...
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Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati

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SperimEstate 2014
Marta Malavolta
Elisa Mannini
Greta Novelli
ISIT BASSI BURGATTI

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Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati

  1. 1. Mantenimenti e adesione cellulare a diversi substrati SperimEstate 2014 Marta Malavolta Elisa Mannini Greta Novelli ISIT BASSI BURGATTI
  2. 2. Obiettivo L’obiettivo della nostra ricerca sui mantenimenti era quello di studiare quali fossero i substrati più adatti alla crescita di fibroblasti (NIH3T3). I substrati migliori erano quelli dove le cellule aderivano meglio e in maggior numero.
  3. 3. Indice 1. Fibroblasti 2. Mantenimento cellulare - Split e conta - Fissazione 3. Substrati - Polidimetilsilossano (PDMS) - Chitina 4. Semina su substrati 5. Osservazione dei risultati - Microscopio ottico - Microscopio a fluorescenza - Microscopio a scansione elettronica (SEM)
  4. 4. Fibroblasti • I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore. • I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza. Fibroblasto in divisione
  5. 5. Fibroblasti • I fibroblasti sono cellule presenti nei tessuti connettivi e hanno la funzione di sintetizzare i componenti della matrice extracellulare. • I fibroblasti sono cellule adese, fusiformi con prolungamenti citoplasmatici che arrivano fino a 30mm; il loro ciclo cellulare è di 12ore. • I fibroblasti da noi utilizzati sono di origine animale (NIH-3T3 mouse embryonic fibroblasts) e sono stati geneticamente modificati tramite l’inserimento del gene che codifica per la proteina GFP (GreenFluorescentProtein) in modo da poter essere osservati al microscopio a fluorescenza. Fibroblasto in divisione
  6. 6. Mantenimento cellulare • Il mantenimento di cellule in vitro serve per studiare fenomeni biologici come la crescita e l’adesione delle cellule su un determinato substrato. • Le cellule crescono all’interno di fiasche contenenti il mezzo cellulare specifico per il tipo di cellula. • Le cellule che abbiamo coltivato sono cresciute in incubatore a 37°C con una concentrazione del 5 % di CO2. • Durante la coltura cellulare sono necessarie alcune procedure atte a mantenere condizioni ottimali alla crescita cellulare, come il cambio medium e lo split. • Per quanto riguarda l’osservazione delle cellule al microscopio fluorescente o al SEM, è prima necessaria una fissazione.
  7. 7. • Quando le cellule arrivano a confluenza (ovvero quando il numero di cellule diventa elevato e si perdono le condizioni ideali per la coltura cellulare) occorre eseguire lo split. • Essendo cellule adese, è necessario rompere i contatti focali che hanno col substrato, tramite l’enzima tripsina, in modo da poter risospendere le cellule e trasferirle nella camera di conta. • Per stimare il numero di cellule presenti nel campione si esegue la conta con la camera di Burker. Split e conta Camera di Burker al microscopio ottico
  8. 8. Fissazione • La fissazione ha la funzione di mantenere inalterata la morfologia dei campioni biologici al fine di osservarli ed impedire l’avanzamento dei processi putrefattivi. • A seconda del tipo di campione e delle tecniche che si intendono utilizzare, si può ricorrere a differenti modalità di fissazione con mezzi chimici (paraformaldeide, glutaraldeide, etc.) o fisici.
  9. 9. Substrati • I substrati sono materiali che vengono utilizzati per l’adesione cellulare. • Ogni substrato presenta caratteristiche differenti che possono permettere o meno l’adesione cellulare. Quelli da noi studiati sono stati: il PDMS e la chitina. PDMS Chitina
  10. 10. PDMS • Il PDMS è un polimero composto da silicone e un agente curante. • È biocompatibile e perfettamente trasparente ma non è biodegradabile. • È facilmente lavorabile grazie alla sua flessibilità. • È utilizzato per la costruzione di chip microfluidici, come additivo alimentare e dall’industria cosmetica.
  11. 11. Chitina • La chitina è il secondo polisaccaride più diffuso dopo la cellulosa. È il costituente fondamentale di crostacei, artropodi, molluschi e funghi. • È biodegradabile e biocompatibile e per questo è molto studiata per la medicina rigenerativa e trova impiego anche nel settore cosmetico.
  12. 12. Semina su substrati • Abbiamo seminato i fibroblasti in una multiwell da 24 pozzetti, all’interno della quale abbiamo inserito i diversi substrati da analizzare: PDMS, chitina e vetro (controllo). • La funzione del controllo è quella di verificare di aver seminato correttamente le cellule, a prescindere dai risultati ottenuti con i diversi materiali.
  13. 13. Osservazione dei risultati Gli strumenti che abbiamo utilizzato per l’osservazione dei campioni sono 3 microscopi di diverso tipo: Microscopio ottico Sfrutta la radiazione luminosa nella lunghezza d’onda della luce visibile. Microscopio ottico a fluorescenza Utilizzato per osservare campioni organici o inorganici, sfruttando i fenomeni della fluorescenza o della fosforescenza indotti nel campione. Microscopio a scansione elettronica (SEM) Sfrutta un fascio di elettroni che colpisce il campione e viene catturato da un rilevatore, fornendo un immagine digitale.
  14. 14. OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO OTTICO
  15. 15. Controllo al microscopio ottico Osservazione cellule del controllo su coverslip.
  16. 16. Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare. CHITINA e FIBRINA al microscopio ottico
  17. 17. OSSERVAZIONE RISULTATI AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
  18. 18. Controllo al microscopio a fluorescenza La presenza delle cellule esclude eventuali errori sistematici
  19. 19. PDMS al microscopio a fluorescenza Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione).
  20. 20. Pozzetto del PDMS al microscopio a fluorescenza Come ulteriore verifica della corretta semina delle cellule (oltre al vetrino di controllo) abbiamo osservato anche al microscopio il pozzetto della multiwell nel quale avevamo posto il PDMS per seminare le cellule. È chiaramente visibile il segno dell’angolo di PDMS. Nel pozzetto le cellule hanno dunque aderito senza problemi.
  21. 21. CHITINA al microscopio a fluorescenza Cellule sulla chitina non trattata per idrolisi alcalina. Le cellule sono poche e non hanno aderito bene data la loro sfericità (indice di mancata adesione). Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. Il numero di cellule adese è maggiore ma ancora non siamo nelle condizioni ottimali per la crescita cellulare.
  22. 22. CHITINA con FIBRINA al microscopio a fluorescenza Cellule su chitina trattata per idrolisi alcalina per rimuovere le proteine sulla struttura. La chitina è stata ricoperta con un gel proteico a base di fibrina per aumentare l’adesione e la proliferazione cellulare. La colorazione è data dall’uso di un saggio di immunofluorescenza che permette di evidenziare le strutture citoplasmatiche, il nucleo e i contatti focali.
  23. 23. OSSERVAZIONE RISULTATI AL SEM
  24. 24. CHITINA al SEM Chitina trattata per idrolisi alcalina a diversi ingrandimenti SEM. Chitina tratta per idrolisi alcalina ricoperta con un gel proteico a base di fibrina.
  25. 25. NIH-3T3 su CHITINA al SEM 330 mm 100 mm 15 mm 3 mm
  26. 26. Conclusioni • Osservando (dopo 24 ore dalla semina) l’effettiva presenza di cellule nel controllo abbiamo potuto escludere eventuali errori sistematici. RISULTATI: - Le cellule non hanno aderito al PDMS - Sulla chitina non trattata rispetto a quella trattata, si è notato che l’adesione cellulare è sfavorita. - Per rendere la chitina favorevole per la crescita dei fibroblasti abbiamo ricoperto il substrato con un gel proteico a base di fibrina.
  27. 27. JESSAMINE M. K. NG et al. "Components for integrated poly(dimethylilosane) microfluidic system ". Electrophoresis (2002) 23:3461-3473 MORGANTI P. "Uso biomedico delle nanofibrine di chitina". Ricerca e industria clinica (2009) 4. http://www.lastampa.it/2013/02/18/scienza/benessere/medicina/ustioni-e-cicatrici- dai-crostacei-una-soluzione-efficace-per-la-cura- 9UEZNtYrgx6nrPwOjNTOoK/pagina.html http://www.elveflow.com/microfluidic-reviews-and-tutorials/the-poly-di-methyl- siloxane-pdms-and-microfluidic http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fibroblast

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