Articulos biología del movimiento dental

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Ma. Alejandra Bueno y Ma. Fernanda Gómez

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Articulos biología del movimiento dental

  1. 1. Expresión de MyD88 en el Foliculo Dental de ratas:Implicaciones para la osteoclastogénesis y la erupción dental<br />Ma. Alejandra Bueno<br />Ma. Fernanda Gómez<br />
  2. 2. Aislamiento y cultivo de células del FD<br /> In vivo <br />Gen MyD88<br />Días de estudio<br />1, 3, 5, 7, 9, 11 Postnatales<br />Ratas<br />FD <br />6<br />Aislamiento<br />Cultivo celular<br />Cultivados después triptinización en (MEM)<br />FD de 5 a 6 días de edad <br />10% suero de becerro<br />1mM de Piruvato de Sodio<br />1% de Penicilina/Estreptomicina<br />0,2% de Fungizona<br />
  3. 3. Aislamiento del ARN<br />Determinar pureza de ARN<br />usando<br />Remover contaminación con ADN<br />Absorbancia de 260nm<br />
  4. 4. Análisis de Microselección del ADN<br />Selección del ADN<br />Determinar la expresión del MyD88 in vivo<br />Etiquetado con biotina 16-UTp<br />Generar ARN complementario<br />Kit TrueLabeling-AMP 2.o<br />ARN del FD <br />Hibridado a quimioquina de rata<br />Oligo receptor de ADN<br />Hibridización a 60º por 18 horas<br />Buffer de bloqueo por 40 min<br />Incubada con estreptavitina y fosfatasa alcalina por 10 min<br />Visualizado por incubación de sustrato quimio- luminescente<br />113 genes<br />Control interno<br />20 min después<br />Se obtuvo imagen<br />Lavado 4 veces por 5 min.<br />Radio gen MyD88<br />Analizado con software<br />Gen GAPDH<br />
  5. 5. Transcripción reserva en tiempo real- PCR <br />Incubación 10 min a 70°c <br />Transcriptasa reversa<br />A 37°c por 1 hora <br />Cebadores: MyD88<br />5’- ACCGCATCGAGGAGGACTG-3’<br />5’ CTGTGG-GACACTGCTCTCCA-3’<br />NFKβ1 <br />5’ -GCTTACGGTGGGATTGCATT-3’<br />5’ –TTATGGTGCCATGGGTGATG-3’<br />MCP-1<br />5’-CACGCTTCTGGGC-CTGTT-3’<br />5’-TGAGACAGCACGTGGATGCT-3’<br />RANKL<br />5’-TCCCA-TCGGGTTCCCATAA-3’<br />5’-GGCCCAGCCTCGATCAT-3’<br />RT-PCR<br />MCP-1 <br />MyD88<br />NFKβ-1<br />RANKL<br />Expresión <br />Células FD<br />Presentado con SYBR Green MasterMix<br />
  6. 6. Transfección in vitro de células del FD con ARN de interferencia<br />El ARN de interferencia pequeño de sustrato Dicer (siADN)<br />Integrated DNA Technologies<br />Pone en blanco el ARNm del MyD88 en nucleótidos 420-444<br />1 día después de la tranfección<br />Combinados e incubados por 25 min<br />- 1mM de piruvato de Na<br />- 10% suero de becerro<br />Opti MEM I medio de Suero reducido<br />
  7. 7. Cultivo incubado a 37° C con 5% de CO2 por 24, 48 y 72 horas<br />Células colectadas para determinar expresión de genes<br />RT-PCR en tiempo real<br />
  8. 8. Inmuno-tinción<br />Se retiró Peroxidasa Endógena<br />Controles:<br />Ag 1rio reemplazado con IgG de cabra <br />Ag 2rio IgGanticabra<br />Bloqueadas a temperatura ambiente por 1 hora <br />Ag 1rio. MyD88 antihumano policlonal de cabra<br />Seguido de contratincion con hematoxilina<br />TBS 2% suero de conejo <br />
  9. 9. Inmuno-tinción<br />
  10. 10. Tratamiento con IL-1 alfa<br />Expresión de NFKβ1<br /> MCP-1<br /> RANKL<br />Por 1-2 horas<br />
  11. 11. Análisis estadístico<br />SAS<br />Valor p < o = 0,05 <br />Gen cronológica<br />ANOVA<br />Otros experimentos<br />Valor p < o = a 0,05<br />T-test pareado<br />
  12. 12. Resultados<br />Gen MyD88<br />MyD88 – IL-1 alfa<br />> Día 3<br />Expresión 1.7, 1.4, 1.9 veces mas alto que los días 1, 5 y 7 <br />Expresión máxima de MyD88 a 6 horas de tto. con IL-1<br />Proteína MyD88<br />Inmuno-teñidos <br />MCP-1<br />NFKβ1<br /> MyD88<br />Expresión en FD, hueso alveolar y ameloblastos<br />Reducida a 48-72 horas<br />Reducida de 24-72 horas<br />No tinción en controles<br />
  13. 13. Resultados<br />IL-1 Mejora espresión<br />NFKβ1<br />MCP-1<br />RANKL<br />MyD88<br /> Actividad quimiotáctica de Cmde células de FD<br />Mejoramiento mediante IL-1alfa<br />Requerido para actividad quimiotáctica mediante IL-1 alfa<br />Contribuye a osteoclastogénesis<br />
  14. 14. Factor de Diferenciación de Osteoprotegerina y Osteoclastos en la Erupción Dental<br />
  15. 15. Materiales y Métodos<br />
  16. 16. Materiales y Métodos<br />Folículo Dental y órganos del esmalte microdiseccionados<br />Remoción de suero en MEM<br />Tripsinización<br />Cultivadas células del 5to pasaje<br /> -0.2% grasa libre de ácido<br />- Factor de crecimiento reducido de suero de albúmina bovino<br />Cultivados en PTHrP o <br />CSF-1<br />5 min, 30 min, 1hr, 3hrs, 12 hrs, 24hrs y 48 hrs<br />6 folículos de cualquier edad para realizar análisis de OPG<br />Se repitió experimento 3 veces<br />1, 10, 25, 50, 100 ng/mL de PTHrP<br />Controles incubados en MEM libre de suero<br />Para examinar efectos dependientes de las dosis<br />
  17. 17. Aislamiento de ARN y transcripción reversa/ Reacción en Cadena de Polimerasa<br />2 µg de ARN para realizar síntesis de ADNc<br />Cebador específico<br />OPG<br />(Cebador 5´ 461-480)<br />(Cebador 3´1020-1001)<br />5´TGGAGCTCG-AATTCTGCTTG-3´<br />5´CATCAAGATGCGGAGCTGCT-3´<br /><ul><li>45 segundosde desnaturalización a 94°C
  18. 18. 1 min a 60°C
  19. 19. 2 min de extensión a 72°C</li></ul>Amplificación del ADN<br />
  20. 20. Visualizado con tinción <br />Electroforesis <br />Productos de PCR<br />ID ImageAnalysis Software in a Kodak Digital ScienceElectrophoresisDocumentation and AnalysisSystem<br />Perfiles de PCR semicuantitativos y determinar intensidad de las bandas<br />Evaluación de densitometría de la data<br />Normalizada a β- actina<br />
  21. 21. Inmunolocalización de ODF<br />Localizazción de ODF<br />Anticuerpo policlonal de cabra- antiratón<br />Diluido en 20 µg/mL en PBS<br />Se siguió protocolo del sistema de tinción.<br />
  22. 22. Resultados<br />OPG IN VITRO<br />Inhibida <br />PTHrP<br /> OPG IN VIVO<br />RATA: Día 3 postnatal <br />Tiempo- 30 min.<br />RT - PCR<br />RATON: <br />Día 5 postnatal <br />MCP-1 / IL-1 <br />CSF-1 inhibe OPG<br />No inhiben expresión de OPG<br />Después de 12 horas <br />

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