Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Articulos biología del movimiento dental

1,203 views

Published on

Ma. Alejandra Bueno y Ma. Fernanda Gómez

Published in: Education
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

Articulos biología del movimiento dental

  1. 1. Expresión de MyD88 en el Foliculo Dental de ratas:Implicaciones para la osteoclastogénesis y la erupción dental<br />Ma. Alejandra Bueno<br />Ma. Fernanda Gómez<br />
  2. 2. Aislamiento y cultivo de células del FD<br /> In vivo <br />Gen MyD88<br />Días de estudio<br />1, 3, 5, 7, 9, 11 Postnatales<br />Ratas<br />FD <br />6<br />Aislamiento<br />Cultivo celular<br />Cultivados después triptinización en (MEM)<br />FD de 5 a 6 días de edad <br />10% suero de becerro<br />1mM de Piruvato de Sodio<br />1% de Penicilina/Estreptomicina<br />0,2% de Fungizona<br />
  3. 3. Aislamiento del ARN<br />Determinar pureza de ARN<br />usando<br />Remover contaminación con ADN<br />Absorbancia de 260nm<br />
  4. 4. Análisis de Microselección del ADN<br />Selección del ADN<br />Determinar la expresión del MyD88 in vivo<br />Etiquetado con biotina 16-UTp<br />Generar ARN complementario<br />Kit TrueLabeling-AMP 2.o<br />ARN del FD <br />Hibridado a quimioquina de rata<br />Oligo receptor de ADN<br />Hibridización a 60º por 18 horas<br />Buffer de bloqueo por 40 min<br />Incubada con estreptavitina y fosfatasa alcalina por 10 min<br />Visualizado por incubación de sustrato quimio- luminescente<br />113 genes<br />Control interno<br />20 min después<br />Se obtuvo imagen<br />Lavado 4 veces por 5 min.<br />Radio gen MyD88<br />Analizado con software<br />Gen GAPDH<br />
  5. 5. Transcripción reserva en tiempo real- PCR <br />Incubación 10 min a 70°c <br />Transcriptasa reversa<br />A 37°c por 1 hora <br />Cebadores: MyD88<br />5’- ACCGCATCGAGGAGGACTG-3’<br />5’ CTGTGG-GACACTGCTCTCCA-3’<br />NFKβ1 <br />5’ -GCTTACGGTGGGATTGCATT-3’<br />5’ –TTATGGTGCCATGGGTGATG-3’<br />MCP-1<br />5’-CACGCTTCTGGGC-CTGTT-3’<br />5’-TGAGACAGCACGTGGATGCT-3’<br />RANKL<br />5’-TCCCA-TCGGGTTCCCATAA-3’<br />5’-GGCCCAGCCTCGATCAT-3’<br />RT-PCR<br />MCP-1 <br />MyD88<br />NFKβ-1<br />RANKL<br />Expresión <br />Células FD<br />Presentado con SYBR Green MasterMix<br />
  6. 6. Transfección in vitro de células del FD con ARN de interferencia<br />El ARN de interferencia pequeño de sustrato Dicer (siADN)<br />Integrated DNA Technologies<br />Pone en blanco el ARNm del MyD88 en nucleótidos 420-444<br />1 día después de la tranfección<br />Combinados e incubados por 25 min<br />- 1mM de piruvato de Na<br />- 10% suero de becerro<br />Opti MEM I medio de Suero reducido<br />
  7. 7. Cultivo incubado a 37° C con 5% de CO2 por 24, 48 y 72 horas<br />Células colectadas para determinar expresión de genes<br />RT-PCR en tiempo real<br />
  8. 8. Inmuno-tinción<br />Se retiró Peroxidasa Endógena<br />Controles:<br />Ag 1rio reemplazado con IgG de cabra <br />Ag 2rio IgGanticabra<br />Bloqueadas a temperatura ambiente por 1 hora <br />Ag 1rio. MyD88 antihumano policlonal de cabra<br />Seguido de contratincion con hematoxilina<br />TBS 2% suero de conejo <br />
  9. 9. Inmuno-tinción<br />
  10. 10. Tratamiento con IL-1 alfa<br />Expresión de NFKβ1<br /> MCP-1<br /> RANKL<br />Por 1-2 horas<br />
  11. 11. Análisis estadístico<br />SAS<br />Valor p < o = 0,05 <br />Gen cronológica<br />ANOVA<br />Otros experimentos<br />Valor p < o = a 0,05<br />T-test pareado<br />
  12. 12. Resultados<br />Gen MyD88<br />MyD88 – IL-1 alfa<br />> Día 3<br />Expresión 1.7, 1.4, 1.9 veces mas alto que los días 1, 5 y 7 <br />Expresión máxima de MyD88 a 6 horas de tto. con IL-1<br />Proteína MyD88<br />Inmuno-teñidos <br />MCP-1<br />NFKβ1<br /> MyD88<br />Expresión en FD, hueso alveolar y ameloblastos<br />Reducida a 48-72 horas<br />Reducida de 24-72 horas<br />No tinción en controles<br />
  13. 13. Resultados<br />IL-1 Mejora espresión<br />NFKβ1<br />MCP-1<br />RANKL<br />MyD88<br /> Actividad quimiotáctica de Cmde células de FD<br />Mejoramiento mediante IL-1alfa<br />Requerido para actividad quimiotáctica mediante IL-1 alfa<br />Contribuye a osteoclastogénesis<br />
  14. 14. Factor de Diferenciación de Osteoprotegerina y Osteoclastos en la Erupción Dental<br />
  15. 15. Materiales y Métodos<br />
  16. 16. Materiales y Métodos<br />Folículo Dental y órganos del esmalte microdiseccionados<br />Remoción de suero en MEM<br />Tripsinización<br />Cultivadas células del 5to pasaje<br /> -0.2% grasa libre de ácido<br />- Factor de crecimiento reducido de suero de albúmina bovino<br />Cultivados en PTHrP o <br />CSF-1<br />5 min, 30 min, 1hr, 3hrs, 12 hrs, 24hrs y 48 hrs<br />6 folículos de cualquier edad para realizar análisis de OPG<br />Se repitió experimento 3 veces<br />1, 10, 25, 50, 100 ng/mL de PTHrP<br />Controles incubados en MEM libre de suero<br />Para examinar efectos dependientes de las dosis<br />
  17. 17. Aislamiento de ARN y transcripción reversa/ Reacción en Cadena de Polimerasa<br />2 µg de ARN para realizar síntesis de ADNc<br />Cebador específico<br />OPG<br />(Cebador 5´ 461-480)<br />(Cebador 3´1020-1001)<br />5´TGGAGCTCG-AATTCTGCTTG-3´<br />5´CATCAAGATGCGGAGCTGCT-3´<br /><ul><li>45 segundosde desnaturalización a 94°C
  18. 18. 1 min a 60°C
  19. 19. 2 min de extensión a 72°C</li></ul>Amplificación del ADN<br />
  20. 20. Visualizado con tinción <br />Electroforesis <br />Productos de PCR<br />ID ImageAnalysis Software in a Kodak Digital ScienceElectrophoresisDocumentation and AnalysisSystem<br />Perfiles de PCR semicuantitativos y determinar intensidad de las bandas<br />Evaluación de densitometría de la data<br />Normalizada a β- actina<br />
  21. 21. Inmunolocalización de ODF<br />Localizazción de ODF<br />Anticuerpo policlonal de cabra- antiratón<br />Diluido en 20 µg/mL en PBS<br />Se siguió protocolo del sistema de tinción.<br />
  22. 22. Resultados<br />OPG IN VITRO<br />Inhibida <br />PTHrP<br /> OPG IN VIVO<br />RATA: Día 3 postnatal <br />Tiempo- 30 min.<br />RT - PCR<br />RATON: <br />Día 5 postnatal <br />MCP-1 / IL-1 <br />CSF-1 inhibe OPG<br />No inhiben expresión de OPG<br />Después de 12 horas <br />

×