Preparación de tejidos

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Preparación de tejidos

  1. 1. Introducción a la Histología Definir que es un tejido celular. Enumerar los diferentes tipos de tejidos y su clasificación. Describir los diferentes pasos del procesamiento histológico para microscopía óptica y electrónica. Identificar el colorante y técnica apropiados para la demostración de un tejido o estructura celular específicos. Identificar, a partir de imágenes, secciones teñidas con tinciones topográficas, histoquímicas, inmunocitoquímicas, inmunofluorescencia, micrografías electrónicas de transmisión y de barrido. Concepto de Tejido • Los tejidos son agrupaciones funcionales de células • Conjunto de células ordenadas en una formación regular. • Entramado, fisiológicamente útil al organismo, constituido por células especializadas morfológica y funcionalmente. • .... 1Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  2. 2. Concepto de Histología • Término procedende del griego "histos" que significa tejido de telar y "logos" que significa estudio o aprendizaje. Histología puede definirse como el estudio de los tejidos • Histología: Ciencia que estudia la estructura, la organización, la función y la capacidad de respuesta de los tejidos • Histología: Ciencia que estudia los entramados celulares, fisiológicamente útiles para el organismo, que están constitudos por células especializades morfológica y funcionalmente • Histología general: Rama de la Histología que comprende la Citología y el estudio de los tejido báicos. • Histología especial: Rama de la Histología que comprende el estudio microscópico de órganos y sistemas. Tejidos fundamentales Clasificación • Tejidos epiteliales – epitelios de revestimiento – epitelios glandulares • Tejidos conectivos – conjuntivo – sanguíneo – adiposo – cartilaginoso – óseo • Tejidos musculares – muscular liso – muscular esquelético – muscular cardiaco • Tejido nervioso 2Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  3. 3. Tejidos fundamentales Clasificación • Tejidos epiteliales – epitelios de revestimiento – epitelios glandulares • Tejidos conectivos – conjuntivo – sanguíneo – adiposo – cartilaginoso – óseo • Tejidos musculares – muscular liso – muscular esquelético – muscular cardiaco • Tejido nervioso Tejidos fundamentales Clasificación • Tejidos epiteliales – epitelios de revestimiento – epitelios glandulares • Tejidos conectivos – conjuntivo – sanguíneo – adiposo – cartilaginoso – óseo • Tejidos musculares – muscular liso – muscular esquelético – muscular cardiaco • Tejido nervioso 3Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  4. 4. Tejidos fundamentales Clasificación • Tejidos epiteliales – epitelios de revestimiento – epitelios glandulares • Tejidos conectivos – conjuntivo – sanguíneo – adiposo – cartilaginoso – óseo • Tejidos musculares – muscular liso – muscular esquelético – muscular cardiaco • Tejido nervioso Tejidos fundamentales Clasificación • Tejidos epiteliales – epitelios de revestimiento – epitelios glandulares • Tejidos conectivos – conjuntivo – sanguíneo – adiposo – cartilaginoso – óseo • Tejidos musculares – muscular liso – muscular esquelético – muscular cardiaco • Tejido nervioso 4Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  5. 5. Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías Fijación • Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc... • Endurecer el tejido para permetir su manipulación y evitar alteraciones morfológicas. • Mantenimiento de la citoarquitectura y ultraestructura. • Mantenimiento in situ de las moléculas (Importante para determinaciones histoenzimáticas e inmunocitoquímicas) Fijadores: aldehidos, alcohol, mercurio, ácido pícrico Formol: formaldehido + metanol Parafolmadehido + tampón fosfato Bouin: ácido pícrico + formol + ácido acético http://www.bris.ac.uk/depts/PathAndMicro/tutorials/sam/samples.html 5Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  6. 6. Métodos de Fijación Fijación por inmersión 10 volúmenes de fijador Tiempo: 4-24 horas Fijación por perfusión Perfusión: 10 minutos Postfijación por inmersión: 4-24 horas Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías 6Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  7. 7. Inclusión en parafina Inclusión en parafina Infiltración 7Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  8. 8. Inclusión en parafina Confección de bloques Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías 8Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  9. 9. Microtomo de parafina Microtomo de parafina 9Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  10. 10. Microtomo de parafina Microtomo de parafina 10Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  11. 11. Microtomo de parafina Microtomo de parafina 11Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  12. 12. Microtomo de parafina Microtomo de parafina 12Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  13. 13. Obtención de secciones o cortes histológicos • Cortes de parafina 5–10 µm (Microtomo de parafina) • Cortes por congelación: 5-30 µm (Criostato) • Cortes vibratomicos 30-50 µm (Vibratomo) • Cortes semifinos: 1-2 µm (Ultramicrotomo) • Cortes ultrafinos: 300-700 Å (Ultramicrotomo) Grosor de los cortes 13Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  14. 14. Grosor de los cortes Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías 14Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  15. 15. Tinciones histológicas • Técnicas topográficas • Técnicas específicas • Técnicas histoquímicas • Técnicas inmunocitoquímicas Tinciones • Tinciones topográficas: basadas en la interacción de sustancias colorantes con las estructuras celulares y tisulares. – Colorantes iónicos ácidos: Tienen afinidad por estructuras tisulares con carga positiva – Colorantes iónicos básics: Tienen afinidad por estructuras tisulares con carga negativa Ejemplo: Tinción Hematoxilina-Eosina 15Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  16. 16. Tinción de Hematoxilina-Eosina • Hematoxilina – Colorante iónico básico (carga positiva) Tiñe estructuras con carga negativa Núcleos de color azul (basófilos) • Eosina – Colorante iónico ácido (carga negativa) Tiñe estructuras con carga positiva Citoplasmas de color rosado (esosinófilos) Técnica de tinción 16Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  17. 17. Tinciones. Método Tinciones. Método 17Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  18. 18. Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías Montaje de las preparaciones • Para observar con el microscopio óptico los cortes teñidos se procede a montar las preparaciones utilizando una sustancia cementante (medio de montaje) y un cubreobjetos. • El medio de montaje facilita la observación y si se trata de un medio de montaje permanente estabiliza la coloración histológica durante mucho tiempo. 18Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  19. 19. Procesamiento histológico para microscopía óptica • Fijación • Inclusión • Obtención de cortes • Tinción • Montaje permanente • Observación al microscopio • Obtención de microfotografías Observación al microscopio Obtención de microfotografías 19Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  20. 20. Tinciones histológicas • Técnicas topográficas • Técnicas específicas • Técnicas histoquímicas • Técnicas inmunocitoquímicas Técnicas histológicas específicas • Técnicas para el tejido conjuntivo: tricrómico de Masson, van Gieson • Glucógeno: carmin de Best • Mucinas: azul alcian, mucicarmín • Lípidos: oil red O, negro sudán B, OsO4 • Ácidos nucleicos: naranja de acridina, verde de metilo-pironina 20Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  21. 21. Técnicas histológicas específicas Tejido conjuntivo Tricrómico de Masson Van Gieson Técnicas histológicas específicas Mucinas Azul Alcián Mucicarmin 21Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  22. 22. Técnicas histológicas específicas Lípidos Oil red O Oil red O Oil red O Técnicas histológicas específicas Ácidos nucleicos Verde de metilo - pironina Naranja de acridina 22Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  23. 23. Tinciones histológicas • Técnicas topográficas • Técnicas específicas • Técnicas histoquímicas • Técnicas inmunocitoquímicas Técnicas histoquímicas Implican una reacción química: transformación de un producto en otro diferente con características diferenciables • PAS (ácido periódico de Shiff): detección de carbohidratos – Ácido periodico que actúa sobre los carbohidratos produciendo la formación de grupos aldehidos que son los que reaccionan con el colorante • Lectinas: detección de residuos glucosilados – Lectinas biotinadas. Tripsina o neuraminidasa para exponer los residuos escondidos. Avidina peroxidasa. Revelado con DAB • Reacción de Feulgen: detección de ADN – Hidrólisis de la unión purina-deoxirribosa con HCl para formar aldheidos que reaccionan con el colorante • Técnicas histoenzimáticas: detección de proteínas enzimáticas 23Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  24. 24. Detección histoquímica de carbohidratos Azul Alcian / PAS PAS Detección histoquímica de ADN Feulgen Feulgen 24Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  25. 25. Detección histoquímica de residuos glucosilados Lectina de tomate Revelado de la peroxidasa H2O2 H2O + 1/2 O2 DAB DAB-O 25Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  26. 26. Técnicas histoenzimáticas • Detección de una fosfatasa: NDPasa NDPasa ADP P + AMP Nitrato Pb Fosfato de Pb Sulfuro amonio Sulfuro de Pb NDPasa Tinciones histológicas • Técnicas topográficas • Técnicas específicas • Técnicas histoquímicas • Técnicas inmunocitoquímicas 26Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  27. 27. Técnicas inmunocitoquímicas • Se basan en el empleo de anticuerpos dirigidos hacia epitopos (grupos con características antigénicas) concretos de moléculas • Los anticuerpos son proteinas séricas (inmunoglobulinas) sintetizadas por las células plasmáticas, derivadas de los linfocitos B activados tras reconocer un antígeno extraño (inmunógeno). Usualmente se utilizan IgG o IgM •Anticuerpos policlonales: conjunto de anticuerpos específicos para un inmunógeno (diferentes epitopos) •Anticuerpos monoclonales: específicos de un epitopo único de un inmunógeno Anticuerpos Policlonales Monoclonales 27Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  28. 28. Detección inmunocitoquímica de GFAP Peroxidasa Astrocitos Avidina Biotina Ab2 Ab1 Golgi GFAP Antigeno GFAP: Glial fibrilar acidic protein Tinciones inmunocitoquímicas Nódulo linfoide, Ki-67 Páncreas, insulina TNF-alfa macrófagos Melanoma, TGF-alfa 28Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  29. 29. Tinciones inmunocitoquímicas Dobles mardados BL6 nuclear PNA citoplasmatico Inmunofluorescencia Molécula fluorescente GFAP 29Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  30. 30. Microscopio de Fluorescencia Filtro barrera Espejo dicroico Filtro excitación Preparación Inmunofluorescencia: dobles marcados GFAP HSP47 30Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  31. 31. Tinciones inmunocitoquímicas por inmunofluorescencia Tinciones inmunocitoquímicas por inmunofluorescencia Cultivo de células renales Cultivo de células Hella Cultivo células musculares lisas Aparato de Golgi Tubulina A-SM Actina Microtúbulos Actina b-NM Actina Núcleo Núcleo 31Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  32. 32. Microscopía Electrónica de Transmisión • Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxido de osmio • Deshidratación • Inclusión en resinas epoxi • Ultramicrotomía: secciones ultrafinas • Montaje sobre rejillas • Contraste de las rejillas con metales pesados (citrato de plomo) • Observación al microscopio Microscopía Electrónica de Transmisión 32Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006
  33. 33. Microscopía Electrónica de barrido (Scanning) • Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxido de osmio • Deshidratación • Desecación por unto crítico • Sombreado con oro • Observación al microscopio http://www.mos.org/sln/sem/seminfo.html 33Bernardo Castellano. Histologia Médica. UAB. 2006

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