Métodos de estudio en histología

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Métodos de estudio en histología

  1. 1. MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍAM.C.D. Ma. De Lourdes Urquizo RuvalcabaEsp. Patología y Medicina Bucal
  2. 2. MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA HISTOLOGÍA  Estudia la microanatomía de las células, los tejidos y los órganos y correlaciona su función. HISTOTECNOLOGÍA  Conjunto de técnicas que se llevan acabo para la preservación y preparación de los tejidos y células, para su estudio con microscopio de luz y sus variantes
  3. 3. MÉTODOS DE ESTUDIO EN HISTOLOGÍA OBJETIVOS DE LA HISTOTECNOLOGÍA Preservación optima y funcional de los diferentes materiales tisularesy celulares que llegan al laboratorio. Conocer los principios de las técnicas rutinarias y especiales, así como sus indicaciones precisas para el estudio de los tejidos
  4. 4. TÉCNICA HISTOLÓGICA Comprende la preparación de tejidos para su estudio microscópico. Se logra sometiéndolos a una serie de procesos:  Obtención del tejido a estudiar  Fijación  Deshidratación  Aclaramiento  Inclusión  Corte  Montaje  Observación (Diagnóstico)
  5. 5. TÉCNICA HISTOLÓGICA OBTENCIÓN DEL TEJIDO A ESTUDIAR BIOPSIAS  Incisional  Excisional NECROPSIA O AUTOPSIA CITOLOGÍA EXFOLIATIVA FROTIS
  6. 6. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJACIÓN Se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades: Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc. Conserva la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo (citoarquitectura y ultraestructura) Aumenta la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste. Y permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima
  7. 7. TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan autólisis, desintegración, etc.) Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo
  8. 8. TÉCNICA HISTOLÓGICA: CUALIDADES DE UN FIJADOR Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.) No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
  9. 9. TÉCNICA HISTOLÓGICA: ¿Cómo actúan los fijadores? Varía con la composición o naturaleza Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor) Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas y originando un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favorece la coloración ulterior de los tejidos.
  10. 10. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOS Son los más utilizados Pueden ser: Fijadores simples  constituidos por una sola sustancia química Fijadores compuestos  cuando varias fijadores simples intervienen en su constitución  racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus efectos
  11. 11. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOSFIJADORES SIMPLES Form al 10% ol  e s e l m á s us a d o .  Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.  Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. Alcohol etílico absoluto o de 96%  Se usa generalmente en microquímica.  Preserva el glucógeno.  Causa distorsión del detalle nuclear y comprime el citoplasma.
  12. 12. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOSFIJADORES SIMPLES Alcohol metílico.  Se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.)  Ácido ósm al 1 ó 2% ico  Es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.
  13. 13. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOSFIJADORES SIMPLES Bicrom de potasio al 3-5%. ato  Fija el citoplasma y no se precipita.  Nunca se usa solo.  Después de la fijación loes especímenes deben ser lavados exhaustivamente para remover el oxido que se forma
  14. 14. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES QUÍMICOSFIJADORES COMPUESTOS Líquido de F ing, m e z c la c ro m o -o s m io - lem a c é tic a . Líquido de Zenker, m e z c la bic ro m a to -s ublim a d o - a c é tic a . Líquido de H elly, m e z c la Ze nke r-fo rm o l. Líquido de B ouin, m e z c la p ic ro -fo rm o s -a c é tic a . Liquido de Duboscq-B rasil, o Bo uina lc o hó lic o
  15. 15. TÉCNICA HISTOLÓGICA: FIJADORES FÍSICOS Desecación. Calor seco.  Coagulación de las proteínas  No es buena ya que las células se destruyen. Calor húmedo. Frío y Congelación .  Se congela el tejido con dióxido de carbono o N liquido  Es mejor que el calor pero se pueden formar cristales.
  16. 16. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALI. FIJACIÓN Fijación en formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.II. DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA Y CORTE Se describe forma, color, textura, superficie, consistencia al corte y se mide. Se le da el tamaño deseado a la pieza Enjuaga durante 15 min.
  17. 17. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALIII. DESHIDRATACIÓN Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante. Se debe deshidratar el tejido, ya que la parafina nos es hidrosoluble  Alcohol 70º, 1h30.  Alcohol 96º, 1h30.  Alcohol 100º (l), 1h30.  Alcohol 100º (ll), 1h30.  Toluol O Xilol , entre 1h30 y 3hs. (Aclaramiento) NOTA: si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
  18. 18. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALACLARAMIENTO Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión (PARAFINA) a utilizar. Se sustituye el alcohol por un líquido intermediario normalmente el hidrocarburo bencénico (xilol, benceno, toluol). Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
  19. 19. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALIV. INCLUSIÓN A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme.  gelatina y parafina. El objeto de la inclusión es:  Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.  Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.  La parafina penetra en los vasos, en los espacios intercelulares y en el interior de las células embebiendo el tejido y haciendo más fácil la obtención de cortes en el microtomo.
  20. 20. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALIV. INCLUSIÓN Infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. 1.Secado de la muestra con gasa. 2) Parafina 56º (l), 1h30. 3) Parafina 56º (ll), 1h30. 4) Formación de la barra. 5) 30 de frezzer. 6) Fractura del tacoNOTA: Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por el son ahora ocupados por la parafina
  21. 21. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALV. CORTE El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros (5μ) MICROTOMO.
  22. 22. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIÓN Y MONTAJE Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color. Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo. La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% y agua.
  23. 23. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIÓN Y MONTAJE Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA. Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar).
  24. 24. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALVI. COLORACIÓN Y MONTAJE 1.Xilol o toluol(I), 15 en estufa. 2. Xilol o toluol(II), 2. 3. Alcohol 100º, 30". 4. Alcohol 96º, 30". 5. Alcohol 70º, 30". 6. Alcohol 50º, 30". 7.Agua destilada, 30". 8. Hematoxilina, 1´30". 9. Agua corriente, 2´. 10. Alcohol 50º, 15". 11. Eosina, 30". 12. Alcohol 96º, 10". 13. Alcohol 100º, 10". 14. Xilol, 1´ por lo menos. 15. Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.
  25. 25. VI. COLORACIÓN Y MONTAJELos colorantes pueden agruparse en 3 clases: Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula. Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular. Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos
  26. 26. HEMATOXILINA Y EOSINA
  27. 27. Tinción PAS (ácido peryódico-reactivo de Schiff) Es uno de los métodos químicos más empleados en histología. Tiñe carbohidratos y macromoléculas ricas en carbohidratos. Se usa para detectar :  glucógeno en las células  Moco en diversos tipos celulares  Membrana basal subyacente a los epitelios  Fibras reticulares del tejido conectivo Los anillos de las hexosas (carbohidratos) poseen carbonos adyacentes, cada uno con un grupo hidroxilo El ac, peryódico rompe la unión entre estos átomos de carbono adyacentes y forma grupos aldehído. Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff para dar un color púrpura intenso (rojo luminoso)
  28. 28. Tinción PAS(ácido peryódico-reactivo de Schiff)
  29. 29. Tinción PAS(ácido peryódico-reactivo de Schiff)
  30. 30. Tricromico de Masson Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan tres colores distintos: Núcleos: Negro Músculo, citoplasma y queratina: rojo Colágeno: azul o verde
  31. 31. COLORACION DE WRIGHT
  32. 32. TEJIDO CONECTIVO LÍQUIDO: SANGRE
  33. 33. NEGRO SUDÁNLos colorantes Sudán tiñen fuertemente los TRIGLICÉRIDOS, como por ejemplo: Rojo de sudán o sudán III, en la coloración de células adiposas. El negro de sudán o sudán IV, se emplea en la coloración de las vainas mielínicas de las fibras nerviosas compuestas por lipoproteínas.
  34. 34. TINCION ARGÉNTICA
  35. 35. TÉCNICA HISTOLÓGICA: INMUNICITOQUÍMICA
  36. 36. INMUNICITOQUÍMICA DIRECTA
  37. 37. INMUNICITOQUÍMICA INDIRECTA
  38. 38. AUTORRADIOGRAFIA
  39. 39. CRIOFRACTURA
  40. 40. CRIOFRACTURA
  41. 41. TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)
  42. 42. TÉCNICA HISTOLÓGICAVII. OBSERVACIÓN(DIAGNÓSTICO)
  43. 43. TÉCNICA HISTOLÓGICA: PROTOCOLO GENERALVII. OBSERVACIÓN (DIAGNÓSTICO) MICROSCOPIO

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