Trabajo II Pharmacogenética Doctor en Salud Pública versión iv e 4

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Este trabajo es le segundo trabajo para el Programa de PhD en Salud Pública Desarrollado en Coordinación con la Atlantic International Univeresity, Miami Florida. Y comprende el estudio de la influencia que ejercen los fármacos en nuestros genes

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Trabajo II Pharmacogenética Doctor en Salud Pública versión iv e 4

  1. 1. IDENTIFICACIÓN DEL ESTUDIANTE ID: UD10435BMN17417 LUIS ENRIQUE MEDINA MEDINA TITLE: PHARMACOGENÉTICS Grade / Program: PhD in PUBLIC HEALTH major: Epidemiology School of Social and Human Studies Murcia, Spain October of 2011ATLANTIC INTERNATIONAL UNIVERSITY HONOLULU, HAWAII SUMMER 2011
  2. 2. INDICE GENERAL Pág.I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………6II. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………...7III.- DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO………………………………………………………………….8 3.1.-Conceptos Generales y Métodos de Estudio en Farmacogenética…………………………………8 3.2.-Farmacogenética y Farmacogenómica…………………………………………………………..9 3.3.-Historia de la Farmacogenética…………………………………………………………………..9 3.3.1.- Conceptos Básicos de Genética: Polimorfismo Genético…………………………………………..11 3.3.2.- Variabilidad en la Respuesta de Medicamentos……………………………………………………..13 3.4.-Tipos de variaciones genéticas de importancia en Farmacogenética……………………………14 3.4.1.-Single Nnucleotide Polymorphisms o SNP……………………………………………………………16 3.4.2.-Inserciones/Deleciones (INDEL)……………………………………………………………………….16 3.4.3.-Variación en Número de Copias (CNV)……………………………………………………………….16 3.5.-Conceptos Importantes en Farmacogenética……………………………………………………..17 3.5.1.-el proyecto hapmap………………………………………………………………………………………17 3.5.2.-Definición de términos en farmacogenética…………………………………………………………..18 3.5.3,.-Proteínas transportadoras de fármacos………………………………………………………………19 3.5.4.-Métodos moleculares de estudio en farmacogenética……………………………………………....22 A.-Tecnología de los microarrays de ADN…………………………………………………………..20 B-Análisis de la Expresión Génica……………………………………………………………………24 C.-Analisis del Genotipo………………………………………………………………………………..30 3.6.- Clasificación de los Estudios Farmacogenéticos…………………………………………………31 3.6.1.-Estudios de Comprobación de Hipótesis………………………………………………………………32 3.6.2.-Estudios de Generación de Nuevas Hipótesis………………………………………………………...33 3.7.-Estudios Mixtos…………………………………………………………………………………….34 3.7.1.-Estudios de Generación de Nuevas Hipótesis………………………………………………………...35 3.7.2.-Proyecto del Genoma Humano : Secuenciación del genoma completo…………………………..35 3.8.-Aplicaciones Farmacogenéticas actuales……………………………………………….................35 3.8.1.-Farmacogenética del Tratamiento Antirretroviral……………………………………………………37 3.9.-Variaciones Genéticas en Proteínas tTansportadoras……………………………………….....…38 3.10.-Variaciones genéticas en enzimas metabólicas………………………………………….............39 3.10.1-Reguladores de las Proteínas Transportadoras y de las enzimas metabólicas………………….41 3.10.2.-Variaciones genéticas en la 1-glucoproteína ácida…………………………………………………41 PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 2
  3. 3. 3.11.-Influencia de Factores Genéticos en la Respuesta Virológica e inmunológica……………...433.12.-Participación de Pacientes de Ensayos Clínicos en Estudios de Farmacogenética……………44 3.12.1.-Material y Método……………………………………………………………………………………45 3.12.2.-Resultados del Estudio……………………………………………………………………………473.13.-Farmacogenética en Oncología………………………………………………………………48 3.13.1.-Antecedentes……………………………………………………………………………….49 3.13.2.-tipos de alteraciones genéticas…………………………………………………………….503.14.-Farmacogenética de las Enzimas Metabolizadoras de Agentes Quimioterápicos………............51 A.-UDP-Glucuronosiltransferasa (UGT)……………………………………………………........51 B.-Tiopurina S-Metiltransferasa (TPMT)………………………………………………………..53 C.-5,10-Metilentetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)……………………………………… …..543.15.-Farmacogenética del tratamiento antirretroviral 2008: ¿hacia un tratamiento personalizado?........................................................................................................................563.16.- Reacciones de Hipersensibilidad………………………………………………………………....573.17.-Interacciones farmacocinéticas entre metadona y antirretrovirales en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana…………………………………………………….58 3.17.1.-Metadona……………………………………………………………………………………………….59 3.17.2.-¿Que son los Antirretrovirales?…………………………………………………………….............60 3.17.3.-interacción metadona-antirretrovirales……………………………………………………............61 3.17.4.-Relación de Análogos no nucleósidos inhibidores de la transcriptasa inversa-metadona.. 64. 3.18.-Estudios farmacogenéticos: guía de evaluación para Comités Éticos de Investigación Clínica…………………………………………………………………………………………70 3.18.1.-Fundamentos científicos y marco legal (I)…………………………………………………….70 3.19.-Farmacogenómica………………………………………………………………………………72 3.19.1.-Transcriptómica y Proteómica…………………………………………………………………...72 3.19.2.-Entorno Legislativo………………………………………………………………………………..72 3.19.3.-Normativa sobre investigación biomédica en seres humanos…………………………….........73 3.19.4.-Normativa sobre Protección de datos de carácter personal …………………………………74 3.20.- Evaluación Económica en la era de la Farmacogenética y Farmacogenómica: ¿un rayo de luz en la oscuridad?............................................................................................................................773.21.- Polimorfismo Genético en el Paciente Crítico. Parte II: Aplicaciones especiales de los Polimorfismos Genéticos. Farmacogenética y terapia génica………………………………..83 3.21.1.- Genética y Coagulación………………………………………………………………………….85 3.21.2.- Neurogenética del Paciente crítico………………………………………………………………85 3.21.3.-Genética en el Síndrome de Distrés Respiratorio………………………………………………87PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 3
  4. 4. 3.22.-Genética en la Cirugía Cardíaca………………………………………………………………88 3.23.-Terapia Génica…………………………………………………………………………………90 3.24.- Terapia Génica en la Neumonía……………………………………………………………..90 3.25.- Terapia Génica en la Sepsis……………………………………………………………………..91 3.26.- Terapia Génica y Hemodinámica……………………………………………………………….92 3.27.-Genética y Respuesta Terapéutica……………………………………………………………….92 3.28.-Factores Determinantes, de la variabilidad entre la población en la respuesta a los fármacos.93 A.-FactoreS Genéticos……………………………………………………………………………….93 B.-Factores no Genéticos…………………………………………………………………………….93 3.29.-Terapia Personalizada de la Farmacogenética…………………………………………………94 3.30.-Reacciones de Fase II (conjugación): acetilación, glucuronización, sulfatación y mutilación……………………………………………………………………………………………95 3.30.1.-Receptores de Fármacos……………..……………………………………………………………….96 3.30.2.-Proteínas Con Efecto Indirecto sobre la respuesta al tratamiento……………………………..96 3.30.3.-Otros Aspectos de la Farmacogenética……………………………………………………............97 3.30.4.-Proteínas transportadoras de fármacos……………………………………………………………97 3.31.- Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y aspectos éticos……..98 3.31.1.- Resecuenciación Génica……………………………………………………………………………..99 3.31.2.- Farmacogenética y bioinformática………………………………………………………………...99 3.31.3.- Farmacogenética y Aspectos Éticos………………………………………………………………100 3.32.-Análisis farmacogenético de la cinética de absorción de ciclosporina en una población española de pacientes trasplantados cardíacos…………………………………………………102 3.33.-Estudio farmacocinético…………………………………………………………………………105 3.34.-Aspectos Éticos…………………………………………………………………………………..106 3.35.-Análisis de los Datos……………………………………………………………………………..107 3.36.-Metabolismo y Farmacogenética del Tratamiento Antihipertensivo a través de las enzimas CYP 3.36.1.-Beta-Bloqueantes………………………………………………………………………………………109 3.36.2.-Bloqueantes de los Canales de Calcio………………………………………………………………113 3.36.3.-Inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina………………………………………...113 3.36.4.-Antagonistas de los receptores de Angiotensina II………………………………………………..113 3.36.5.-Bloqueantes Alfa-Adrenérgicos……………………………………………………………………...114 3.37.- Impacto estratégico de la Medicina individualizada Implicaciones en la clínica de la Farmacogenética………………………………………………………………………………..117 3.38.- Variabilidad en la Eficacia del tratamiento……………………………………………………118IV.- Análisis General…………………………………………………………………………………119 4.1.-La farmacogenética y la farmacia de hospital…………………………………………………......119 4.2.-Los Farmacéuticos y la Farmacogenética…………………………………………………………..119 4.3.-Planteamiento del Problema de la Farmacogenética……………………………………………..120 4.4.-Impacto de los Efectos Adversos………………………………………………………………124 PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 4
  5. 5. VI.- Análisis y Discusiones……………………………………………………………………................128 6.1.-Perspectivas y Limitaciones……………………………………………………………………………...130 6.2.-Recomendaciones Sobre Estudios Genético……………………………………………………………131VII.-Conclusiones…………………………………………………………………………………………131VIII.-Bibliografía………………………………………………………………………………………….133 PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 5
  6. 6. I.-INTRODUCCIÓN La farmacogenómica es la disciplina científica orientada al estudio de losaspectos genéticos relacionados con la variabilidad de la respuesta a losmedicamentos en individuos o poblaciones EMEA/CPMP/3070/01 El genoma humano está formado por una secuencia de aproximadamente3.000 millones de nucleótidos, situados en el 99,9% de las posiciones deidéntica manera en cualquier par de personas que se comparen. Este dato avalanuestra identidad como especie biológica independiente. La farmacogenéticasólo analiza una información genética muy concreta –la relacionada con laeficacia y seguridad de los medicamentos con una finalidad muy específica:mejorar los criterios científicos para su selección y uso. Tampoco se pretendeestablecer el riesgo genético de padecer enfermedades, aunque en ocasionespuede revelar esta información u otras colaterales (p. ej., confirmación depaternidad, pronóstico de una enfermedad por su respuesta al tratamiento). Entendiendo cómo un determinado polimorfismo genético afecta almetabolismo y la acción de los medicamentos será posible predecir, para cadapaciente, qué medicamento es el que ofrece mayor beneficio terapéutico y/o quéprobabilidad existe de desarrollar una reacción adversa en función de sudotación genética. La farmacogenética constituye uno de los pilares de ladenominada «medicina personalizada» (Marshall A, Roses AD., et al. 1997,2000) 39-43. Adicionalmente, la mejor caracterización de las bases genéticas ymoleculares de las enfermedades ayudará a mejorar su diagnóstico,diferenciando entre entidades con síntomas parecidos pero con distintas causasy/o mecanismos de desarrollo o progresión clínica y que, consecuentemente,son tributarias de tratamientos diferentes. Muchos de los fármacos que tienenpotencial terapéutico nunca llegan a comercializarse por la presencia dereacciones adversas en algunos individuos observadas durante los ensayosclínicos. Por otra parte, existen fármacos utilizados comúnmente que sólo sonefectivos en una parte de la población. Estas diferenciasinterindividualesreferidas a eficacia y toxicidad dependen de muchos factorescomo pueden ser, sexo, edad, factores ambientales y factores genéticos. En losaños 50 se utiliza por primera vez el término farmacogenética para describir losestudios sobre la base genética de la farmacoterapia. Los estudios farmacogenéticos están dirigidos a identificar variantes alélicasde los genes involucrados en el metabolismo de los fármacos o de susreceptores. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 6
  7. 7. La farmacogenética pretende explicar la influencia de la variabilidad genéticaen la respuesta a los medicamentos e intenta conocer cómo un determinadopolimorfismo genético puede afectar al metabolismo y a la acción de losmedicamentos en cada sujeto, lo que va a permitir optimizar la respuestaterapéutica del paciente al aumentar la eficacia del medicamento administrado,reducir sus efectos adversos y mejorar el cumplimiento terapéutico. Los estudios farmacogenéticos están sujetos, por un lado, a la normativasobre investigación biomédica en seres humanos (de la que los ensayos conmedicamentos son sólo una parte) y, por otro, a la legislación sobre protecciónde datos personales. Además, y aunque no tengan carácter normativo deobligado cumplimiento, existen varios documentos emitidos por organismospúblicos y privados, nacionales e internacionales, sobre investigación genética. La consecuencia práctica más directa de este nuevo paradigma podría ser laobtención de mejores resultados clínicos, con una disminución de lamorbimortalidad de los pacientes y una importante reducción de la necesidad deadministrar distintos y sucesivos medicamentos hasta encontrar el más eficaz yseguro para cada uno, lo que incrementará notablemente la calidad de vida delos pacientes y elevará la calidad asistencial del Sistema Nacional de Salud. La farmacogenómica evalúa la respuesta conjunta de múltiples genes frente aun medicamento y la influencia de las variaciones del ADN en los efectos de losfármacos. Asimismo, intenta identificar qué elementos genéticos son importantesen el desarrollo y evolución de una enfermedad y conocer cómo se alteran einteraccionan entre sí. De esta manera, se podrán definir nuevas y potencialesdianas, plantear nuevas estrategias de evaluación y desarrollo de los fármacos,así como diseñar medicamentos más específicos dirigidos a un grupo deindividuos que compartan ciertas secuencias del ADN, lo que incrementará sueficacia y minimizará sus efectos adversos.II. OBJETIVOS:1º.-Deternminar la Relevancia clínica en farmacogenética para optimización delos tratamiento de las enfermedad en la Salud Pública.2º.-Crear documentos de consenso accesibles sobre la aplicación clínica a nivelde consenso entre los especialistas con el fin de determinar el ahorro que podríasignificar para el paciente, la familia en la implementación de la medicinapersonalizada3º.-Analizar el impacto epidemiológico social de las enfermedades masrelevantes.4º.-Revisar los protocolos de feno y genotipación5º.-Evaluar las implicaciones Clínicas en el uso de fármacos6º.-Revisión y discusión del potencial y la eficacia de los medicamentos y suimplicancia en la etiopatogenia PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 7
  8. 8. 7º.-.Los objetivos que se plantean en los estudios farmacogenéticos songeneralmente 3: a) identificación y caracterización de polimorfismos o de determinados genes b) correlación de los mismos con los resultados del tratamiento, c) desarrollo de tests genéticos que permitan predecir la respuesta, el fármaco o la dosis más adecuados para un paciente concreto, en definitiva, un tratamiento ajustado a cada perfil genético individual. Sin duda, el objetivo principal de la Farmacogenética es «optimizar eltratamiento de las enfermedades a nivel individual», ir hacia una «terapiapersonalizada más segura y eficiente». La Farmacogenética puede cambiar laforma de prescribir en la práctica clínica diaria. En lugar de seguir el métodoactual de «ensayo y error», de manera que los pacientes prueban diferentesdosis de un mismo fármaco y/o diferentes opciones terapéuticas, lafarmacogenética permite ayudar al clínico a la hora de:A. Seleccionar a aquellos pacientes que podrían responder bien o mal a unfármaco determinado antes de que sea prescrito (con el tiempo estarándisponibles perfiles farmacogenéticos para seleccionar a aquellos pacientes quetengan una gran posibilidad de responder positivamente y a aquellos que tenganbajo riesgo de presentar efectos adversos graves).B. Seleccionar la medicación más adecuada para un determinado paciente.C. Seleccionar la dosis más adecuada de un fármaco para un determinadopaciente (las pruebas de genotipado y fenotipado para predecir losrequerimientos de dosis están siendo introducidas cada vez más en el desarrollopreclínico de los medicamentos y en la rutina clínica).III.- DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO3.1.-CONCEPTOS GENERALES Y MÉTODOS DE ESTUDIO EN FARMACOGENÉTICA La farmacogenética, la ciencia que permite identificar las bases genéticas delas diferencias interindividuales en la respuesta a los fármacos, es un tema degran interés. Los resultados de los diferentes tipos de estudios farmacogenéticosen diferentes campos de la medicina pueden servir para que en un futuro sepueda ofrecer una verdadera medicina personalizada. En este capítulo definimoslos conceptos más relevantes de esta disciplina, así como los métodos deestudio utilizados actualmente PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 8
  9. 9. Existe una gran variabilidad interindividual en la respuesta al tratamientofarmacológico. El reconocimiento de que parte de esta variabilidad es inherentea la persona ha creado la disciplina de la farmacogenética, con el objetivo depoder ofrecer en un futuro una medicina personalizada que nos aporte elmáximo beneficio terapéutico con la mínima toxicidad. En este capítulo, sedefinen los conceptos más relevantes de esta disciplina, así como los métodosde estudio utilizados actualmente.3.2.-FARMACOGENÉTICA Y FARMACOGENÓMICA Estos 2 términos se usan con frecuencia intercambiados, pero tienendiferentes connotaciones. El término «farma-cogenética» es más restrictivo y serefiere al estudio de la variación genética de ciertos genes y a su efecto en larespuesta farmacológica. El término «farmacogenómica» es mucho más amplioy se refiere al estudio de todo el espectro de genes farmacológicamenterelevantes, sus variaciones genéticas, cómo estas variantes interaccionan ycómo afectan a la respuesta farmacológica (Altman RB, et al. 2002)1.3.3.-HISTORIA DE LA FARMACOGENÉTICA La observación de que existen diferencias individuales en la respuesta altratamiento farmacológico no es un concepto nuevo. A principios del siglo XX(1902-1909) el médico británico Sir Archibald Garrod desarrolló el concepto dechemical individuality para describir que ciertos individuos presentaban toxicidadcon una dosis de fármaco que era inocua para la mayoría. La primeraobservación escrita relacionada con la Farmacogenética se remonta al año 510a.C. cuando Pitágoras observó que la ingesta de habas producía en algunosindividuos una reacción potencialmente fatal. Con el tiempo se reconoció que setrataba de una anemia hemolítica que aparecía en individuos con deficiencia enla enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), siendo el primer informede la farmacogenética moderna el publicado a principios de 1930 por Snydersobre la incapacidad para saborear la feniltiourea que presentaba una herenciaautonómica recesiva. El concepto de «farmacogenética » se originó en los años 1950 con los 2primeros ejemplos de cómo variaciones genéticas en genes que codificanenzimas metabólicas causan reacciones adversas graves a determinadosfármacos: anemia hemolítica causada por fármacos antimaláricos debido adeficiencias de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y relajaciónmuscular prolongada después de la administración de succinilcolina debido adeficiencias de la enzima seudocolinesterasa. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 9
  10. 10. Fue Motulsky en 1957 quien primero documentó el concepto de que losdefectos heredados en el metabolismo de fármacos podían explicar lasdiferencias individuales en la respuesta a medicamentos16. El que primeropropuso el término «farmacogenética» fue Friedrich Vogel en 1959, y en 1962Kalow escribió la primera monografía sobre el tema Tabarés B, et al 20004 14. El campo de la Farmacogenética fue estimulado en los años 1970 con hechoscomo la descripción que Robert Smith hizo en 1977 de la deficiencia en elmetabolismo de la debrisoquina, cuando personalmente experimentó unaimportante hipotensión ortostática tras tomar el medicamento17. Actualmente seconoce que el defecto correspondiente es debido a la deficiencia de la enzimacitocromo P450 2D6. O cuando Vesell et al demostraron que las vidas mediasplasmáticas de muchos fármacos eran menos divergentes entre parejas degemelos monocigotos que entre parejas de gemelos dicigotos Vesell ES, et al1989 8. Concluyeron que la herencia multifactorial podía determinar elmetabolismo farmacológico individual (herencia multigénica). En el transcurso de los años posteriores se fueron añadiendo ejemplos derespuestas exageradas, desconocidas, o ausencia de efectividad de fármacoscomo manifestación de patrones hereditarios individuales. Más recientemente, han recibido mucha atención los polimorfismos genéticoscomunes del metabolismo de fármacos clínicamente útiles y que involucran a unnúmero considerable de pacientes. Un ejemplo en el orden farmacodinámico esel conocimiento reciente de los receptores farmacológicos, como el beta 2-adrenorreceptor, o los transportadores farmacológicos, como el MDR1,responsable del gen de resistencia a fármacos, que también están sujetos avariación genética. Las bases genéticas moleculares de estos patrones hereditarios se hanempezado a dilucidar a finales de los años 1980 con la clonación ycaracterización de numerosos genes humanos incluyendo enzimasmetabolizadoras de fármacos, receptores y varios sistemas de transporte.En la actualidad la Farmacogenética tiene un gran potencial y está generandograndes expectativas médicas, sociales y financieras. La farmacogenética se encarga del estudio de la variabilidad individual derespuesta a los fármacos en función de diferencias genéticas. De esta manera,el genotipo del paciente no sólo puede determinar la evolución y el pronóstico dela enfermedad, sino que también puede influir en la respuesta al tratamiento, lacapacidad de metabolizar los fármacos administrados y, en cierto modo, preverla aparición de efectos adversos (fig. 1). No existe situación alguna en medicinael la que el clínico pueda predecir la respuesta individual al tratamiento. Esevidente que muchos factores determinan la respuesta a los fármacos (edad, PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 10
  11. 11. sexo, etnia, enfermedades concomitantes y disfunción de los órganossecretores). No obstante, si estas variables se estandarizan, es evidente quepersiste una respuesta individual. Se ha evidenciado en los últimos años que factores genéticos modifican demanera significativa la absorción, disposición, metabolismo y excreción deFármacos (Kalow W, et al. 1997) 297. Uno de los objetivos más importantes de lafarmacogenética es la disminución de efectos secundarios. Cada fármaco interacciona con numerosas proteínas (transportadoras,enzimas, etc.). Un elevado número de enzimas son genéticamente variables 32. El PG de los genes que codifican estas enzimas condiciona la aparición de 3tipos de sujetos: normales, metabolizadores lentos (predispuestos a lasreacciones adversas) y metabolizadores rápidos (sujetos que no responderán alas dosis habituales, dada la extremadamente rápida eliminación del fármaco). La mayoría de las enzimas implicadas en el metabolimo y la eliminación defármacos son miembros de la familia del citocromo P-450, que incluye más de 30isoformas (Abernethy DR, et al. 2000) 299.El reconocimiento temprano de una respuesta adecuada al tratamiento o laprobabilidad elevada de desarrollar efectos secundarios significa que puedeayudar a desarrollar estrategias terapéuticas alternativasEn 1959, el Dr.Vogel acuñó el término «farmacogenética» y el reconocimiento deesta nueva disciplina se extendió rápidamente (Meyer UA., et al. 2004) 2. 3.3.1.-CONCEPTOS BÁSICOS DE GENÉTICA: POLIMORFISMO GENÉTICO El genoma humano está formado por una secuencia de aproximadamente3.000 millones de nucleótidos, situados en el 99,9% de las posiciones deidéntica manera en cualquier par de personas que se comparen. Este dato avalanuestra identidad como especie biológica independiente. No obstante, el 0,1% de variabilidad, o polimorfismo genético, también esbiológicamente importante (Kalow W., . Nebert DW., et al, 1997) 206,207 y está enla raíz de dos problemas médicos muy relevantes: la propensión dispar apadecer enfermedades y la respuesta heterogénea a los medicamentos, tanto eneficacia como en seguridad. El estudio de los polimorfismos geneticos del citocromo P450 se ha centradoen las isoenzimas CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 y CYP3A por ser estas las quemetabolizan la mayoría de farmacos. Los individuos con determinadas varianteso alelos en los genes que codifican para estas enzimas pueden experimentar un PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 11
  12. 12. descenso en la eficacia de determinados farmacos o bien un aumento de sutoxicidad . De este modo se establecen tres tipos distintos de fenotipos demetabolización (metabolizadores normales, metabolizadores lentos [PM] yultrarrapidos [UM]) asociados a distintas variaciones geneticas. Asi, los alelosmejor caracterizados para CYP2C19 son el CYP2C19*1 o tipo silvestre y losresponsables del fenotipo PM que son CYP2C19*2 y CYP2C19*3. El desarrollo de la farmacogenética para reducir esta variabilidad en laeficacia ya está dando sus primeros frutos, pero será uno de los principalescambios de la práctica de la Medicina en los próximos 10-20 años. Una de lasprimeras aplicaciones farmacogenómicas aprobadas para uso clínico estrastuzumab (Herceptin®). Se trata de un anticuerpo humanizado contra elreceptor HER2 en el cáncer de mama.Va dirigido sólo a los pacientes quesobreexpresan HER2 (20-35% de los sujetos con cáncer de mama). Sudesarrollo clínico ha sido muy rápido y requirió menos de 1.000 pacientes deestas características:sólo fueron necesarios dos ensayos clínicos de fase III, unoen monoterapia (222 pacientes) y otro en combinación con quimioterapia (469pacientes), y así se autorizó la comercialización para el tratamiento de lospacientes con cáncer de mama avanzado que sobreexpresa HER2. Es decir, elfármaco sólo va dirigido a la población de pacientes que tiene una altaprobabilidad de obtener un beneficio del tratamiento. De ahí que el polimorfismo genético sea uno de los temas centrales de lainvestigación biomédica actual (Gusella JF., Taylor JG., et al. 1986, 2001)208, 212. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 12
  13. 13. La mayor parte (90%) de la variabilidad genética humana se debe apolimorfismos de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism, SNP),variaciones concretas de un solo nucleótido, en el contexto de una secuenciagenética (Schork NJ., Brookes AJ., et al. 1999, 2000) 213,214. Su identificación, mapeo y análisis funcional se consideran elementosesenciales para la farmacogenética y la farmacogenómica (Stephens JC,Syvänen AC, t et al. 1999, 2001) 215, 219. El 10% restante corresponde sobre todoa polimorfismos de longitud, de los cuales los microsatélites son su modalidadmás importante Epplen C., Wren JD., et al. 1997, 2000) 220, 221. La farmacogenética se basa en la obtención y el análisis de informacióngenética pero, a diferencia de otras disciplinas como la terapia génica, laingeniería genética o la clonación, no implica la modificación de la dotacióngenética del paciente ni la transferencia de material genético de unos seres vivosa otros. Esta consideración es esencial para evaluar correctamente lasimplicaciones de carácter ético, legal y social de un proyecto de investigación detipo farmacogenético. La farmacogenética sólo analiza una información genética muy concreta –larelacionada con la eficacia y seguridad de los medicamentos con una finalidadmuy específica: mejorar los criterios científicos para su selección y uso.Tampoco se pretende establecer el riesgo genético de padecer enfermedades,aunque en ocasiones puede revelar esta información u otras colaterales (p. ej.,confirmación de paternidad, pronóstico de una enfermedad por su respuesta altratamiento). Por ello,el perfil de respuesta al medicamento que persigue lafarmacogenética debe distinguirse de otros tipos de análisis genéticos como losencaminados a establecer el diagnóstico de una enfermedad (p. ej., fibrosisquística), el establecimiento de la condición de portador (el caso de la hemofiliaA) o la susceptibilidad genética a padecer una determinada enfermedad (p. ej., elcáncer familiar o la diabetes mellitus)(Roses AD., Human Genetics Commission(HGC, et al. 2002) 226, 228. Uno de los problemas médicos actuales es que los medicamentos noalcanzan el objetivo terapéutico deseado en muchos de los pacientes. Lafarmacogenética hará posible mejorar la eficacia de los tratamientosadministrados, seleccionando el compuesto más eficaz y/o ajustandoindividualmente la posología (Spear BB, Ingelman-Sundberg M, et al. 2001) 229,230 . 3.3.2.-VARIABILIDAD EN LA RESPUESTA DE MEDICAMENTOS Además, permitirá investigar las causas y mecanismos patogénicos de lasreacciones adversas y prevenir su aparición futura con ese fármaco y, PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 13
  14. 14. probablemente, con otros similares (Roses AD, Meyer UA, . Brazell C, et al.2000, 2002) 227,231,233. La variabilidad de la respuesta a los medicamentos podríaatribuirse a diferencias genéticas en tres planos (Roden DM, et al. 2002) 234:a) los mecanismos moleculares implicados en la patogenia de la enfermedad(véase «Farmacogenómica»)b) el metabolismo (absorción, distribución, metabolismo, eliminación) delmedicamento en el organismo del paciente (farmacocinética)c) la diana terapéutica sobre la que actúa el compuesto farmacológico(farmacodinámica). Estos tres elementos pueden actuar de forma simultánea. Además, múltiplesfactores exógenos, como otros fármacos, la dieta, los productos tóxicos (p. ej.,alcohol, tabaco, cafeína) y funcionales (edad, estado hormonal, situaciónfuncional de diversos sistemas orgánicos), pueden influir de forma relevantesobre el tratamiento, a veces incluso más que la dotación genética, si bien suefecto está mediado por elementos controlados genéticamente. 3.4.-TIPOS DE VARIACIONES GENÉTICAS DE IMPORTANCIA EN FARMACOGENÉTICA 3.4.1.-SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS O SNP Los single nucleotide polymorphisms o SNP (pronunciado esnips) son el tipode variación genética más común; actualmente se estima que hay alrededor de10 millones de SNP en el genoma humano 3. Son el resultado de la variación deun solo nucleótido (adenina [A], timina [T], citosina [C] o guanina [G]) en lasecuencia de ADN entre miembros de una misma especie. Los SNP puedenclasificarse en SNP no sinónimos, cuando cambian el aminoácido que formará laproteína, y SNP sinónimos, cuando no cambian el aminoácido dentro de unaproteína.OBJETIVOS DEL ESTUDIO DE LOS POLIMORFISMOSEl estudio de los polimorfismos tiene como objetivos:1. Determinar marcadores genéticos de susceptibilidad a una enfermedad. El análisis de polimorfismos permite determinar la predisposición de unindividuo a padecer una enfermedad. Se pueden encontrar el gen o grupo degenes «candidatos» que contribuyen a padecer la enfermedad. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 14
  15. 15. 2. Determinar la predisposición de un individuo a un determinado subtipodentro de una enfermedad.Para enfermedades con clínica muy heterogénea, como la psoriasis, donde lacarga genética puede ser parcialmente responsable de tal variabilidad clínica.3. Estudiar el desarrollo de tumores y su progresión. Se ha podidocomprobar cómo los polimorfismos tipo SNP intervienen en la biología tumoral.4. Identificar dianas terapéuticas. Al igual que sucede con los análisis deexpresión génica, el estudio del genotipo también contribuye a lafarmacogenómica.5. Predecir la respuesta terapéutica a un fármaco. La variabilidad en larespuesta farmacológica genéticamente determinada tiene mucho que ver conpolimorfismos en genes específicos. Según diferentes estudios, algunos SNP sehan relacionado con cambios en el metabolismo, proteínas transportadoras yreceptores de fármacos, grado de respuesta de algunos fármacos y porcentajede toxicidad. De hecho, algunos SNP ya se están utilizando para predecir la respuestaclínica a los fármacos (McLeod HL y Evans WE, et al 2001) 11-14. Los individuosportadores de un determinado alelo probablemente lo son también de variantesespecíficas con varios marcadores de SNP. Por ello, para predecir la respuestaa un medicamento no será necesario identificar los verdaderos genes y alelosimplicados, sino que sería suficiente con detectar los SNP. En un futuro los avances tecnológicos asociados con la robótica y lasreacciones múltiples reducirán significativamente el coste del análisis de varioscientos de miles de SNP por paciente en ensayos clínicos. Los patronesbioinformáticos permitirán la rápida comparación de estos patrones de SNPentre los pacientes que presenten diferencias fenotípicas en la respuesta a unfármaco, de tal manera que cuando la información de las diferencias en larespuesta farmacológica sea ostensible, los perfiles de los SNP podrán serrelacionados con los actuales chips diagnósticos, y así determinar o anticipar larespuesta a un fármaco en un paciente determinado. Los SNP también pueden clasificarse en funcionales, cuando alteran laexpresión del gen o la función de la proteína y los no funcionales cuando notienen ningún efecto (fig. 1). Hasta ahora, los estudios farmacogenéticos se hanrealizado son: PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 15
  16. 16. 3.4.2.-INSERCIONES/DELECIONES (INDEL) Normalmente incluyen 1-30 pb siendo las más frecuentes las que implican unsolo nucleótido4. Son de gran importancia cuando se encuentran en regionescodantes porque pueden causar disrupciones de la secuencia de lectura o en elpromotor porque pueden alterar la transcripción del gen (fig. 1). Un ejemplo deINDEL de importancia en farmacogenética lo encontramos con la variación delnúmero de nucleótidos timina y adenina (TA) en el promotor del gen UDP-glucurunosil transferasa 1A1(UGT1A1) que define el alelo UGT1A1*28 y surelación con la toxicidad asociada al tratamiento con irinotecán (RamchandaniRP, et al. 2007) 5. centrado principalmente en este tipo de variaciones genéticas Figura 1. Tipos de variaciones genéticas de importancia en farmacogenética. 3.4.3.-VARIACIÓN EN NÚMERO DE COPIAS (CNV) PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 16
  17. 17. Son vastas regiones en el código genético de un individuo determinado queestán duplicadas o suprimidas. Debido a limitaciones técnicas para poderidentificarlas este tipo de variaciones fue considerado de menor importancia. Sin embargo, estudios recientes señalan su importante contribución a lavariación genética entre individuos (Ifrate AJ., Estivill X., et al 2004, 2007) 6-8. LasCNV no se limitan a regiones intrónicas o intergénicas, sino que también puedencomprender toda la secuencia de uno o varios genes (fig. 1). Ejemplos de CNVde importancia en farmacogenética son el caso de las duplicaciones/delecionesde los genes que codifican para diferentes miembros del grupo de enzimascitocromo P450 (CYP) como CYP2D6, CYP2A6 y, más recientemente,CYP2B69- 11.3.5.-CONCEPTOS IMPORTANTES EN FARMACOGENÉTICALos conceptos más importantes en farmacogenética se resumen en la tabla 1. 3.5.1.-EL PROYECTO HAPMAP El proyecto HapMap se creó en el año 2002 con el objetivo de desarrollar unmapa haplotípico del genoma humano en el que se describieran las pautas másfrecuentes de variación genética en diferentes poblaciones. Para ello, se incluyóa 270 individuos de 4 grupos étnicos diferentes: 30 tríos de etnia caucásica conorígenes del norte y oeste de Europa; 30 tríos de etnia yoruba procedentes deNigeria; 45 individuos de etnia china procedentes de Pekín, y 45 individuos deetnia japonesa procedentes de Tokio (International HapMap Consortium, 2003)12 . Este proyecto está identificando la mayor parte de la variación genética delser humano que, como mencionamos anteriormente, son los SNP. Es importanteseñalar que es la variación genética común (frecuencia alélica 5%) y no toda lavariación genética la que identificamos. La importancia de este proyecto radicaen que permite seleccionar el número mínimo de SNP, los llamados «tag» SNP(tSNP) (tabla 1), representativos del total de la variación genética comúnpresente en el genoma humano. El número de tSNP necesarios paracaracterizar un individuo se ha estimado entre 300.000 (caucasianos) y1.000.000 (negros africanos); un número pequeño si lo comparamos con los 10millones de SNP descritos (International HapMap Consortium, 2005) 13. El proyecto HapMap se dividió en 2 fases. La fase 1, cuyos resultados sepublicaron en 2005, comprendía el genotipado de alrededor de 1,3 millones deSNP(International HapMap Consortium, 2005) 13. En la fase 2, cuyos resultadosse han publicado en octubre de 2007, se han genotipado 2.1 millones de SNPadicionales (International HapMap Consortium, 2007) 14.Todos los datos generados por este proyecto son de acceso PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 17
  18. 18. 3.5.2.-Definición de Términos en farmacogenéticaa.-Haplotipo: conjunto de single nucleotide polymorphisms (SNP) de un mismocromosoma que se encuentran siempre asociadosa.-Alelo: es cada una de las formas posibles de un gen determinado. Los sereshumanos posen 2 copias de cada gen, es decir, 2 alelos. El alelo que posee la secuencia de referencia y, salvo excepciones, el queencontramos con mayor frecuencia en la población general se llama alelocomún. Los alelos que difieren de la secuencia de referencia se llaman alelosraros.b.-Frecuencia alélica: es una medida de la frecuencia relativa de un alelo enuna población determinadac.-Genotipo: es el conjunto de alelos que posee un individuo concreto y quedeterminarán el fenotipod.-Fenotipo: es la manifestación del genotipo; se refiere a cualquiercaracterística detectable en un individuo determinado, entre otros factores, porsu genotipoe.-Desequilibrio de ligamiento (DL): término que indica la asociación de SNPde manera predeterminada en el mismo cromosoma.Esto explica porque ciertas combinaciones de SNP se encuentran de maneramás o menos frecuente en una población de la que cabria esperar si estos SNPse asociasen de manera aleatoriaf.-Tag SNP (tSNP): se llaman así porque «marcan» otros SNP. Es un SNPrepresentativo de una región cromosómica para la que existe un elevado nivel dedesequilibrio de ligamiento. Genotipando estos SNP podemos identificar lavariación genética de una región cromosómica determinada sin necesidad degenotipar todos los SNP presentes g.-Epistasis: se refiere a la interacción entre diferentes genes. El efecto de ungen determinado puede ser modificado por el efecto de otros genes nonecesariamente localizados en regiones adyacenteshttp://www.hapmap.org. La principal aplicación de toda la información generadaes aportar las herramientas necesarias para desarrollar estudios de asociación(genotipo asociado con un determinado fenotipo) que permitan la identificación PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 18
  19. 19. de factores genéticos determinantes de la susceptibilidad a padecer ciertasenfermedades o del tipo de respuesta a determinados fármacos (fig. 2).Figura 2. El proyecto HapMap. Con el genotipado de 270 individuos de 4 grupos étnicos diferentes se ha elaborado el proyectoHapMap. A) Toda la información genotípica de una región determinada se puede obtener de forma gratuita en la página webde HapMap, incluidos los tSNP que deben ser genotipados. B) Los tSNP (SNP 1, 2 y 6) identifican otros SNP que por consecuente nonecesitan ser genotipados. C) Los estudios de asociación se realizangenotipando los tSNP en una población con el fenotipo de interés. Uno de lostSNP (en este ejemplo el SNP 2) está asociado con el fenotipo lo que nos indicaque el causante es él o cualquiera de los otros SNP con los que está asociado. 3.5.3.- PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE FÁRMACOS Watson y Crick, hace algo más de 50 años, publicaron la estructura de lamolécula de ADN1. Este hecho supuso un hito en la historia del conocimiento ymarcó el inicio de un proceso de descubrimientos en los campos de la Biología yla Medicina. En estos años, en los laboratorios de Biología Molecular y Celularse aprendió a identificar, aislar y manejar los genes que contienen la informaciónpara las más variadas estructuras y funciones celulares. También se hicierongrandes avances en asociar alteraciones de genes con el desarrollo deenfermedades, es decir, en la comprensión de las bases moleculares de lasenfermedades 2. El punto de partida de la Biomedicina en el siglo XXI es elacceso a la secuencia completa del genoma humano 3. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 19
  20. 20. El genoma es el conjunto de material genético de un organismo (contienegenes y regiones intergénicas) y está constituido por una secuencia de unos tresmil millones de nucleótidos presentes en el ADN. Un gen es un segmento de la secuencia de ADN que codifica un producto,habitualmente una proteína, de función bien definida y que se encuentralocalizado en un cromosoma concreto. Los ácidos nucleicos son las moléculasconstitutivas del ADN y ARN. La molécula de ácidos nucleicos condiciona lasíntesis de proteínas; es, sencillamente, su precursor natural imprescindible. El genoma ha sido un terreno inexplorado hasta hace pocos años. En ladécada de 1980 los científicos comenzaron a identificar genes cuyas variantesoriginaban enfermedades, pero ello requería años de trabajo «cartografiando» aldetalle las regiones que contenían el gen buscado, para encontrar finalmente alresponsable directo de la enfermedad. Algunos investigadores trataron deimaginar formas más sistemáticas de examinar el genoma, y en 1990 unainiciativa de los Institutos Nacionales de la Salud y el Ministerio de Energía deEE.UU. marcó el inicio del Proyecto del Genoma Humano. Este proyectointernacional liderado por EE.UU. se marcó como objetivos (Ommen GJB, et al1999) 319: a) identificar todos los genes del ADN humano; b) determinar lassecuencias de los 3 billones de pares de bases del ADN humano, y c) almacenaresta información en bases de datos. Con anterioridad a la secuenciación del genoma humano se estimaron unos100.000 genes, después de la secuenciación este número se redujo a 40.000genes y actualmente después del refinamiento de la secuencia dicho número seconsidera alrededor de los 30.000 o menos (número bastante inferior alesperado). Este reducido número es más aparente que real, ya que muchos genes seexpresan en diferentes formas, por lo que en lugar de hablar de un gen único,esta misma unidad transcripcional puede dar lugar a 4-5 formas distintas, yentonces tendríamos que hablar de 100.000-150.000 genes funcionales. Además, si consideramos que el producto del gen, la proteína, sufre cambiosdespués de su síntesis, el número de proteínas funcionales en las células puedesobrepasar el millón.El 14 de abril de 2003 se anunció, por parte del International Genome Project(http://www.genome.gov/), que se había alcanzado el último de los objetivos queera la secuenciación completa del genoma humano y en octubre de 2004 sepresentaron los datos al 99% International Human Genome Sequencing, 2004320 .Todo ello nos ha permitido descubrir los siguientes hallazgos: PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 20
  21. 21. 1. El genoma es muy semejante entre los diferentes animales.2. La secuencia de ADN entre dos seres humanos es idéntica en el 99,9 %. Lamayor parte de las diferencias se encuentran en regiones que no codifican aproteínas. Es ese 0,1 % de diversidad genética el responsable de la mayoría delas diferencias que existen entre los individuos. Sin embargo, muy pequeñasdiferencias en la secuencia del ADN pueden dar lugar a grandes diferencias enla expresión génica. El mismo gen puede tener una expresión muy marcada enun individuo y ser mínimamente o ni siquiera ser expresado en otro.3. Cada célula de nuestro organismo contiene la misma secuencia de ADN. Apesar de ello, cada gen no se expresa en cada una de las células. Algunosgenes básicos se expresan en casi todas o todas las células (por ejemplo,aquellos que codifican la obtención de energía), pero otros sólo se expresan encélulas muy especializadas (por ejemplo, genes que codifican la síntesis demelanina sólo se expresan en los melanocitos).4. A pesar de que los genes representan la principal función biológica delgenoma, sólo comprenden una fracción pequeña de su extensión. El genomacontiene grandes desiertos. De hecho, sólo el 30 % del genoma contiene genesy la suma de todas las secuencias codificantes de proteína ocupa únicamente el1,5% del genoma (existen genes codificantes de proteína y no codificantes).5. Que se haya completado la secuenciación de nuestro genoma no significa quese conozca su funcionamiento.Aún se ignora la función de la mayoría de los genes. 6. En la actualidadcontamos con una identificación de la secuencia del genoma humano muypróxima al 100 %, con un grado de verosimilitud superior al 99 %. Tenemos unabase de datos que reúne los más de seis millones de polimorfismos denucleótidos únicos que, probablemente, sigan aumentando. Sin duda, la secuenciación del genoma humano es un gran logro que facilitaráenormemente el desarrollo de la Biomedicina. Sin embargo, lo más difícil estátodavía por hacer: encontrar la función de estos genes (genómica funcional), suasociación con las enfermedades y cómo podemos utilizarlos para prevenir ocurar éstas. Éstos son los objetivos de la llamada «era post-genómica». En estesentido, se acercan cambios y nuevas posibilidades. Por todo ello, se dice queestamos saliendo de una era en la que se habla en idioma de dos letras (el 0 y 1del lenguaje digital de los ordenadores) y entrando en otro de cuatro letras (loscuatro nucleótidos con las bases adenina [A], timina [T], guanina [G] y citosina[C] del ADN). Estos cambios serán posibles porque al amparo del Proyecto GenomaHumano se están desarrollando una serie de tecnologías, denominadas de alto PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 21
  22. 22. rendimiento, que por primera vez nos permiten analizar el comportamiento detodos los genes (técnicas genómicas), las proteínas y su relación con los genes(técnicas proteínicas) o metabolitos (técnicas metabolómicas) de una célula otejido en respuesta a una enfermedad o tratamiento. La ingente cantidad dedatos que el uso de estas tecnologías está generando (que constituye el procesode acumulación de información más rápido en la historia de la humanidad,terabytes) ha requerido el desarrollo de una nueva disciplina, la Bioinformática,para ser capaces de almacenarlos y explotarlos adecuadamente. La investigación y desarrollo de esta área de la Medicina permitirá avanzaren: a) diagnóstico molecular y pronóstico de las enfermedades; b) desarrollo defármacos; c) terapia celular e ingeniería genética de teji-dos; d) terapia génica yvacunas génicas, y e) individualización de tratamientos (se podrá predecir quiénse puede beneficiar de un medicamento y evitar su administración a quién sólole provoque efectos secundarios indeseables (Wolff CR, Roses AD, et al 2000,2001) 321,322. Permite identificar los genes responsables de las diferentesrespuestas al tratamiento y así desarrollar una medicina personalizada. Es sobreesta área en la que se va a centrar esta Revisión). 3.5.4.-MÉTODOS MOLECULARES DE ESTUDIO EN FARMACOGENÉTICA.A.-Tecnología de los microarrays de ADN Desde la década de los ochenta se ha venido analizando la estructura de losgenes y su expresión de manera individualizada mediante técnicas comoSouthern Blot y Northern Blot (hibridación de una sonda con ADN y ARNrespectivamente). Con ellas se llevaba a cabo el análisis individualizado de ungen o de un grupo reducido de genes cada vez. El problema es que paraencontrar asociaciones entre un gen y una enfermedad había que probar cientoso miles de posibilidades en lo que sería un proceso lento, caro, pesado y que,con frecuencia, no conducía a nada. Estudiar la expresión del genoma completode gen en gen sería como vaciar el océano con una cucharilla. Sin embargo, lasnuevas técnicas de microarrays permiten analizar miles de genes en un únicoexperimento (NCBI) 344. En un futuro se convertirán en técnicas de rutina. En laactualidad la técnica más empleada para llevar a cabo estos estudios se realizamediante la tecnología de los microarrays o chips de ADN (EBI-MBL) 345. Los orígenes de la tecnología de los microarrays o chips de ADN se remontaal inicio de los años noventa3. Desde entonces su uso en investigaciónbiomédica ha aumentado de forma espectacular en los últimos años, y abre unasenormes expectativas para el futuro. La técnica se fundamenta en lacomplementariedad de las dos cadenas de los ácidos nucleicos (permitedetectar secuencias específicas de ARN o ADN basándose en su capacidad decombinarse específicamente a secuencias complementarias de una sonda deADN) (PDG, CNB-CSIC) 346. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 22
  23. 23. El microarray es un soporte al que se han unido fragmentos de genes,oligonucleótidos (fragmentos cortos de ADN), o productos procedentes de lareacción en cadena de la polimerasa (PCR), por lo que el «encuentro» conmaterial procedente del tejido del enfermo permite identificar, gracias a lacomplementariedad, aquellos genes que están presentes. Con ello se consiguela identificación de genes presentes en los tejidos normales o enfermoscomparando la carga y la expresividad de cada una de las muestras. Permite situar en los escasos centímetros cuadrados de un vidrio especial, enposiciones definidas y concretas, hasta cientos de miles de fragmentos de ADNcon una secuencia concreta (en su conjunto representan varias veces los genesdel genoma). Se fabrican empleando la misma tecnología que se utiliza paraelaborar los chips semiconductores, pero utilizando millones de cadenas de ADNcolocadas verticalmente en un chip de cristal o silicona. Para ello se utilizalallamada combinatorial chemistry. Se llegan a sintetizar hasta 1,3 millones desondas de oligonucleótidos en cada array (cada oligonucleótido se coloca en unárea específica del array llamada «celdilla de la sonda» o probe cell. Cada probecell contiene cientos de miles de millones de copias de un determinadooligonucleótido). El diseño y la fabricación de los microarrays de ADN dependen en primerainstancia del ácido nucleico que posteriormentese vaya a estudiar. Para suconstrucción es esencial la caracterización total o parcial del genoma. Lasecuenciación de miles de clones procedentes de genotecas de ADN genómicoy de ADNc permite identificar los distintos genes. A partir de esa información,almacenada en grandes bases de datos como GeneBank (http://www.ncbi.nih.gov) o EMBL (http://www.ebi.ac.uk), se identifican clones representativos decada uno de los genes. El ADN presente en cada uno de ellos es amplificadomediante PCR y purificado, para ser posteriormente depositado, mediante robotsde alta precisión, sobre soportes de vidrio que constituyen los chips de ADN. Alternativamente, a partir de la secuencia de los genes o de los ADNc sediseñan oligonucleótidos de pequeño tamaño (25-70 residuos) queespecíficamente hibridan con cada uno de ellos. Los oligonucleótidos sonpreviamente sintetizados antes de inmovilizarlos sobre los soportes, o biensintetizados in situ sobre el chip. De esta última tecnología los diferentesproveedores emplean métodos también diferentes: Affymetrix(www.affymetrix.com), la fotolitografía; Agilent (www.agilent.com), inyección deprecursores fosforoamiditos; Roche (www.roche-applied-cience.com/sis/matrixarray/), activación de precursores por campo eléctrico. Los desarrollos futuros ofrecerán chips específicos de enfermedad o derespuesta a fármacos, presumiblemente más baratos y de un manejo mássencillo que los dispositivos actuales, de tal manera que puedan universalizarse PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 23
  24. 24. en los sistemas de salud tanto públicos como privados. Aunque todavía existecierta controversia sobre la sensibilidad y especificidad de estas técnicas(Secuencias de ADN) 348, en el momento presente están empezando a sercomercializados. Esta técnica permite analizar el comportamiento, es decir, la inducción orepresión de todos los genes que se expresan en un tejido como consecuencia,por ejemplo, de una enfermedad o un tratamiento. Detecta pérdidas o gananciascromosómicas, polimorfismos, mutaciones y cambios en los niveles de expresiónde los genes. Estos resultados nos pueden permitir establecer si una personatiene un «patrón» o «perfil» de enfermedad, es susceptible de desarrollarla, opuede responder o no a un tratamiento.Se distinguen tres tipos de microarrays:1. Microarrays para determinar la expresión génica: detectan secuenciasespecíficas de ARN.2. Microarrays para determinar el genotipo: detectan secuencias específicas deADN.3. Microarrays para determinar la resecuenciación. Dado que la expresión génica, más que la propia dotación génica, y lospolimorfismos existentes en ellos es lo que explica y condiciona las diferenciasde los individuos en la respuesta a los tratamientos, objeto de esta revisión, noscentraremos fundamentalmente en los dos primeros tipos de estudios conmicroarrays. B-ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA No todos los genes de los que el individuo es portador se expresan; sólo lohace una fracción de ellos. La expresión génica es el mecanismo por el que lainformación contenida en el ADN da lugar a ARN mensajero (ARNm) y,finalmente, este proceso se traduce en la síntesis de una proteína. La expresión génica permite a la célula adaptarse y responder a los estímulosprocedentes de otras células o del ambiente. La importancia que tiene conocercuáles son los genes «activos» es trascendental para explicar el perfil genéticoen cada situación. Un estudio fundamental con referencia a la determinación dela expresión génica mediante tecnología de microarrays de ADN fue llevado acabo por Lockhart et al en 19966. En él, oligonucleótidos de ADN permitieronidentificar unas pocas moléculas de ARNm por célula. En aquella época, losmicroarrays de ADN podían detectar la expresión génica de unos 1.000 genes.En la actualidad, los microarrays llevan sondas de todos los genes conocidoshasta la actualidad (varios miles). PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 24
  25. 25. La expresión génica se estudia midiendo la cantidad de copias de ARN queproduce un gen (gen activo). No detecta, por tanto, aquellos genes que,existiendo, permanecen inactivos. Los análisis de expresión génica conmicroarrays con frecuencia se realizan a ciegas inicialmente. Se estudia unpanel amplio de genes y posteriormente se ana-lizan los resultados y su posibleinfluencia en la enfermedad o en la respuesta terapéutica. Permiten alinvestigador comenzar sin una hipótesis concreta. Pueden medir la expresióngénica de cada uno de los genes conocidos en el genoma humano completo,incluso de genes de los que se desconoce su función. Simplemente comparandolos patrones de expresión génica (por ejemplo pacientes con psoriasisrespondedores a ciclosporina y no respondedores) se pueden detectardiferencias en estos patrones. En el caso de que se demuestre una diferencia depatrones en la expresión de los genes tiene sentido iniciar una investigacióndirigida. Los microarrays para determinar la expresión génica se basan en la atracciónquímica natural (llamada hibridación) entre el ADN (en el array) y las moléculasde ARN (en la muestra de estudio) para determinar qué secuencias de ARN seestán expresando en una determinada muestra y su nivel de expresión a partirde un determinado gen (qué ARN y la cantidad de ARN que se estáproduciendo). Cuando una cadena de ADN fabrica una cadena de ARN, las dos cadenasson complementarias porque los pares de bases se corresponden (A, T, G y Cen la cadena de ADN, con U, A, C y G en la cadena de ARN respectivamente).Si las bases no son complementarias no se unirán el ADN y el ARN (una solabase que no se complementa es capaz de impedir que se unan las doscadenas). Existen dos tipos de microarrays para determinar la expresión génica. En laactualidad ambas tecnologías tienen una distribución similar en los laboratoriosde investigación del mundo:1. Microarrays de oligonucleótidos de ADN. Se inmovilizan pequeñosfragmentos de ADN sintetizados químicamente (oligonucleótidos) específicospara cada genexpresado. Actualmente por su homogeneidad, reproducibilidad yrobustez son los más usados. Existen varios proveedores: Affymetrix (es laprincipal compañía proveedora de este tipo de microarrays. Posee chips de altadensidad que con sus más de 500.000 oligonucleótidos permiten analizarsimultáneamente la expresión de másde 20.000 genes) (fig. 1), Agilent y Roche.2. Microarrays de ADNc. Emplean sondas de ADN con aproximadamente 600-2.000 bases de longitud, en lugar de las 25, sobre una base de cristal,nitrocelulosa o nylon. Se inmovilizan fragmentos de ADNc procedentes de PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 25
  26. 26. colecciones de clones (genotecas). Metodología en la técnica de microarrays deoligonucleótidos La metodología en la técnica de microarrays de oligonucleótidos de expresióngénica incluye las siguientes fases:1. Extracción y preparación del ARN a partir de una muestra (sangre o tejido).Se obtiene el ARN total a partir de los leucocitos en las muestras de sangre y/odel tejido tras un proceso de machacado o molido (grinding) en estas últimas.2. Amplificación y secuenciación del ARN. Con el fin de facilitar la hibridación,se realiza una amplificación (millones de copias) del ARN mediante PCR.Posteriormente se fragmentan las cadenas de ARN en millones de secciones.Además se añaden moléculas de biotina que actúan como pegamento paramoléculas fluorescentes.3. Identificación del ARN. La determinación de la expresión de los genescandidatos se realiza mediante microarrays deoligonucleótidos de alta densidad.Este microarray examina prácticamente cada gen del genoma humano Contienemás de 45.000 fragmentos (probe sets) que corresponden a 33.000 genesconocidos y 6.000 expressed sequence tags (EST), es decir, aproximadamentetodo elgenoma humano. Ello permite la identificación de aquellos genes,conocidos o desconocidos previamente, que estén expresados, y también lacuantificación del nivel de expresión de cada uno de ellos. En estos microarrays las sondas de ADN van colocadas en la superficie deuna base de cristal. Cada sonda contiene generalmente tan sólo 25 bases de PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 26
  27. 27. longitud que suponen una pequeña sección, pero muy representativa de un gencompleto con muchísimas más bases. Si una cadena de ARN se combina conestas 25 bases, se podrá saber de qué gen concreto se trata. El microchip es tanpreciso que puede detectar incluso una sola molécula de ARN específico de ungen dentro de 100.000 ARN diferentes que también puedan estar presentes enla muestra (sensibilidad de detección de aproximadamente 1:100.000). La superficie de este microarray es como un tablero de damas de 1,25 1,25cm. La superficie total contiene hasta 1,3 millones de cuadrículas. Cadacuadrícula (feature) mide 11 11 micrometros y contiene millones de copias decada sonda de un mismo ADN (fig. 2). Las sondas se van apilando unas junto aotras por un mecanismo de síntesis fotolitográfica. El proceso de identificación del ARN consta de los siguientes pasos: a)colocación del ARN en el microarray. El ARN extraído de la muestra ymultiplicado se deposita en el microchip. Se deja 14-16 horas para permitir quela hibridación tenga lugar (para que se complementen las bases de ARN de lamuestra y ADN de las sondas del microarray). Cada cadena de ARN de los genes que se han expresado está nadando entrelas sondas de ADN, buscando su complemento perfecto. Aunquedesgraciadamente la mayor parte de ellas no encuentra su combinación en elarray, algunas sí lo hacen y quedan como adheridas a la sonda de ADN (fig. 3);b) aclarado del microarray. Posteriormente se aclara el microarray para eliminarel ARN no combinado. Por el contrario permanece el ARN hibridado a la sondade ADN, a su vez unida a la molécula de biotina, y c) observación del ARNhibridado. Para poder ver el ARN combinado con la sonda de ADN se utiliza unamolécula fluorescente que se une a la biotina. Tras un lavado, las moléculasfluorescentes no combinadas se eliminan de manera que sólo quedan lasmoléculas fluorescentes unidas a biotina, expresión de las cadenas de ARNunidas a las sondas de ADN. Por tanto, la detección de luz fluorescente serásíntoma de hibridación y, por ello, de detección deuna secuencia específicadeterminada. La lectura de la fluorescencia se realiza mediante un láser escáner.La intensidad de las radiaciones informará de la cantidad relativa de cadasecuencia de la muestra. Dependiendo de la cantidad de ARN hibridado, brillará más o menos. Si ungen está muy expresado y existen muchas moléculas de ARN, brillará mucho.Por ello, según la intensidad del brillo se puede cuantificar la cantidad de ARN. Asu vez, valorando todas las cuadrículas se podrán evaluar todos PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 27
  28. 28. Figura 2. Composición de un microarray de ADN.Figura 3. Hibridación del ARN. Fuente: Daudén E. Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática yaspectos éticos, Actas Dermosifiliogr. 2007;98:3-13 PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 28
  29. 29. Fuente: Daudén E. Farmacogenética II. Métodos moleculares de estudio, bioinformática y aspectos éticos, Actas Dermosifiliogr. 2007;98:3-13los varios miles de genes presentes en el array. En síntesis, conociendo laidentidad de una sonda de oligonucleótido (y la de su gen correspondiente) porsu localización en el microarray podremos identificar el gen expresado y por laintensidad de fluorescencia podremos determinar su nivel de expresión (fig. 4).Para poder comparar entre unas y otras muestras se construye un «mapa decalor» (heat map). Según la intensidad de la expresión, tras aplicar el láser, losfeatures mostrarán unos u otros colores. Son representacionesgráficas quecolorean la expresión génica. Solo se colorearán intensamente aquellos genesque estén muy expresados.Estos mapas se pueden grabar, registrar y almacenar, para así poder servalorados pasado un tiempo. La imagen obtenida de esta manera es analizadainformáticamente (fig. 5).3. Investigación de nuevos fármacos. En función del apartado anterior, elconocimiento de mecanismos patogénicos de una enfermedad permite lainvestigación de nuevos fármacos que tengan por diana aquellos mecanismosen los cuales interviene ese gen, pero también es útil para determinar sutoxicidad, no sólo su eficacia.4. Predicción de la respuesta terapéutica de los pacientes a los fármacos yoptimización de su utilización: terapia individualizada. Ya ha sido comentado previamente que los pacientes con una determinadaenfermedad común responden de forma diferente a los mismos fármacos. Si PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 29
  30. 30. comparamos la expresión génica de un paciente antes y después de recibir unfármaco, veremos las diferencias que existen. Si comprobamos que los pacientes respondedores tienen un patróncaracterístico, frente a los no respondedores, podremos predecir qué pacientesse beneficiarán de un fármaco y cuáles no. De esta forma valoramos eficacia. Sirealizamos lo anterior con diferentes dosificaciones de un fármaco, podremostambién comprobar qué dosis son necesarias para determinados patrones depacientes (por ejemplo aquellos con determinado patrón de expresión génica noson respondedores a la dosis habitual, pero sí lo son a dosis más altas). De estamanera podremos individualizar y ajustar la dosis necesaria. Y lo mismopodríamos decir de la toxicidad; podremos predecir qué pacientes sufriránefectos secundarios y cuáles no. C.-ANÁLISIS DEL GENOTIPO Aunque la mayor parte de la secuencia del genoma es homogénea, alrededorde uno de cada 100-1.500 nucleótidos es polimórfico, es decir, tiene una base enun cromosoma distinta a la de otro cromosoma. Estas diferencias, llamadaspolimorfismos, tienen consecuencias sobre la expresión de la proteína o sobresu estructura lo que hace que, en la práctica, sólo los gemelos monocigóticostengan una carga genética altamente semejante, mientras que hay diferenciasmuy notables entre los individuos de la especie humana. Cada persona hereda dos copias de cada gen, una de cada uno de suspadres. Estas copias pueden ser idénticas o diferentes. El conjunto de estasdiferencias heredables constituye la variación genética entre individuos. Muypequeñas diferencias en la secuencia de ADN pueden tener grandes efectos enla salud y la enfermedad. Un gen que funciona correctamente en una personapuede hacerlo de forma reducida o incluso no funcionar en otra. Lospolimorfismos genéticos pueden ser definidos cuando existen variacionesmonogénicas en la población normal con una frecuencia mayor del 1%7. Lospolimorfismos pueden ser:1. Mutaciones importantes del ADN, con repercusiones muy notables como: a) delecciones (eliminación de una o más bases o segmentos de la secuenciade ADN). Generalmente tiene una repercusión negativa importante en el genafectado y en la proteína que es codificada por él; b) inserciones (se añade unabase o una sección de bases, extras, a la secuencia de ADN). Puede tener lugaren la zona de codificación del gen o no. Generalmente tienen efectosextremadamente negativos sobre las proteínas codificadas.2. Pequeñas mutaciones, con menor repercusión. Incluyen los polimorfismosde un único nucleótido (SNP), el tipo más frecuente de polimorfismo. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 30
  31. 31. Los SNP son variaciones, homo o heterocigotos, de un solo par de bases enla secuencia de ADN del genoma humano. Son la forma más simple y frecuente de polimorfismos entre individuos.Constituyen una de las herramientas más poderosas para el análisis degenomas. La mayor parte de los SNP se encuentran fuera de las regionescodificadoras o promotoras de los genes. Sin embargo, tanto los que seencuentran dentro como fuera de esas zonas pueden tener influencia en latranscripción de los genes. Las características más importantes de los SNP, quehacen de ellos unos marcadores genéticos ideales en la búsqueda de genes desusceptibilidad de una enfermedad o genes que determinan la respuesta a unfármaco son: simplicidad, amplia distribución, estabilidad y alta frecuencia a lolargo del genoma (se estima que tienen una incidencia de aproximadamenteun SNP por cada 1.000 pares de bases) (Shastry BS, et al 2002) 351. Se han identificado más de 1,4 millones de SNP en la secuenciación inicialdel genoma humano (con más de 60.000 de ellos en las zonas de codificaciónde los genes, (Sachinadandam R, et al 2001) 352, y se estima que el genomahumano contiene unos 10 millones de SNP. En la actualidad, el Consorcio SNP(grupo sin ánimo de lucro formado por compañías farmacéuticas, compañíasprocesadoras de información, instituciones académicas y fundaciones deinvestigación) ha determinado un mapa de alta densidad con varios millones deSNP (http://snp.cshl.org). Gracias a este mapa, actualmente miles depolimorfismos se pueden identificar y ordenar de forma precisa. En el pasado, y todavía en el presente, para conseguir los objetivos de lafarmacogenética se seguían, y se siguen, los pasos detallados a continuación: a)se analiza la distribución de la población para la variación en estudio utilizandouna sonda válida para detectar el polimorfismo fenotípico (que afecta a 1% de lapoblación); b) se identifica el gen responsable y sus variantes; c) se realizanestudios familiares y de gemelos para confirmar sus características genéticas(herencia dominante, recesiva, mendeliana, etc.); d) se desarrollan ensayosgenéticos para las distintas variantes del ADN; e) se realiza la correlación entreel genotipo y el fenotipo, y f ) se aplica a la práctica clínica. De hecho, la mayoría de los estudios de farmacogenética publicados estánbasados en correlacionar la respuesta del paciente con las variaciones en losgenes involucrados en el mecanismo de acción del fármaco o de su metabolismo con el fin de determinar el «gen candidato». Por el contrario, en la últimadécada, los avances en la tecnología de secuenciación molecular permiten,además, una investigación sistemática para encontrar variaciones funcionalessignificativas en las secuencias de ADN de los genes que influyen en los efectosde diversos fármacos, para después estudiar su repercusión fenotípica. Esto sepuede hacer hoy en día gracias nuevamente a los microchips de ADN paradetectar SNP 8-10. No es imprescindible conocer de antemano el gen responsable, PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 31
  32. 32. sino que se puede llegar a él desde el análisis de las diferencias entrerespondedores y no respondedores. Se basa en la complementariedad, en laatracción de una cadena de ADN con otra cadena de ADN (y en la combinaciónde pares de bases: ATCG con TAGC respectivamente). Para determinar el genotipo se empleanchips de oligonucleótidos de manera casi exclusiva. Affymetrix es también elprincipal proveedor, con microchips que permiten analizar miles de SNPconocidos en un único experimento (actualmente se están desarrollandomicroarrays de hasta 100.000 SNP). Dado que el Proyecto Genoma Humano hapermitido secuenciar gran parte del mismo, en el microarray está reflejado talconocimiento y contiene las secuencias de ADN (secuencias cortas perorepresentativas de los genes del genoma), de manera que se podrá detectar elgenotipo completo (incluyendo los SNP) del individuo que aporte la muestra. Determinar el genotipo de un individuo sólo tiene que realizarse una vez paraun determinado gen, porque, con excepción de raras mutaciones, no suelecambiar (a diferencia del análisis de expresión del ARN, en el que la expresióngénica de los diferentes tipos celulares y, por tanto, la producción de ARN esvariable) y además se puede realizar en cualquier tejido o fluido, ya que el ADNes común a todas las células del organismo. Metodología de la técnica demicroarrays para la detección de polimorfismos de un único nucleótidoLa metodología en la técnica de microarrays para detectar SNP es similar a ladescrita para la expresión génica:1. Extracción y multiplicación del ADN a partir de una muestra (sangre o tejido).2. Amplificación y secuenciación del ADN. Con el fin de facilitar la detección delos SNP se realiza una amplificación (millones de copias) de cada fragmento delADN que contiene estos polimorfismos de la muestra mediante PCR.Posteriormente se secuencia el ADN.3. Identificación del genotipo de ADN. La muestra obtenida anteriormente, conel ADN, se introduce en un micro- array para la detección de SNP. La estructuradel microarray es similar a la empleada en el análisis de ARN, con sondas deoligonucleótidos de ADN con 25 bases dispuestas apiladas unas con otras encientos de miles de cuadrículas (cada cuadrícula con un solo tipo de sonda deADN). Incluye la mayoría de los genes del genoma humano. Permite analizarmiles de SNP conocidos en un único experimento. El proceso de identificacióndel ADN sigue las mismas fases que para el ARN: PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 32
  33. 33. 3.6.-CLASIFICACIÓN DE LOS ESTUDIOS FARMACOGENÉTICOS Los estudios farmacogenéticos encargados de investigar la contribución delos factores genéticos a la variabilidad en la respuesta y/o toxicidad a distintosfármacos pueden clasificarse en 3 grandes grupos: los estudios que pretendencomprobar hipótesis (fig. 3A), los que intentan generar nuevas hipótesis (fig. 3B)y los estudios mixtos. 3.6.1.-ESTUDIOS DE COMPROBACIÓN DE HIPÓTESIS Este tipo de estudios farmacogenéticos se caracteriza por la investigación delos polimorfismos genéticos de genes conocidos cuyos vínculos de interaccióncon un fármaco concreto ya se han establecido previamente. Por esta razón seconocen también como estudios farmacogenéticos de genes candidatos (fig.3A). Estos estudios pretenden comprobar la hipótesis generada a partir delconocimiento previo de que los polimorfismos genéticos en los genes candidatospodrían estar asociados a una o varias de las variables de evaluación fenotípicade un fármaco. Estas variables pueden ser de tipo farmacocinético (PK),farmacodinámico (PD) o clínico. Los vínculos de interacción entre un fármaco y un gen que avalan laplausibilidad biológica y lo definen como genes candidatos pueden ser de variostipos. Por un lado, el fármaco puede ser sustrato del producto de un genimplicado en los procesos de su absorción, distribución, metabolismo oeliminación (vías ADME). Por otro lado, el producto de un gen puede ser la dianaterapéutica sobre la que el fármaco ejerce su actividad terapéutica o una dianasecundaria responsable de su toxicidad. Y, por último, el fármaco puedeinteraccionar con los productos de genes que se encuentran corriente abajo enlas cascadas de transmisión de señales implicadas en su mecanismo de acción,o con los que forman parte de las complejas redes fisiopatológicas implicadas enla patogenia de la enfermedad que se pretende tratar. De este modo, en función de los vínculos de interacción, podemos agrupar losgenes candidatos en 3 grandes grupos: los implicados en los procesos ADME,los involucrados en el mecanismo de acción tera-péutica y tóxica del fármaco y,por último, los integrantes de las redes fisiopatológicas de la enfermedad atratar. Los vínculos funcionales entre un gen candidato y sus polimorfismosgenéticos son otro aspecto que contribuye, aunque no de forma imprescindible,a la plausibilidad biológica de los estudios de genes candidatos. Los vínculosfuncionales que definen a un polimorfismo genético como candidato serían losconocimientos preestablecidos que establecen una relación entre estepolimorfismo y los niveles de transcripción (ácido ribonucleico mensajero PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 33
  34. 34. [ARNm]) y/o expresión proteica y/o actividad funcional del producto del gen alque pertenece. El estudio farmacogenético ideal sería el que investigase polimorfismos conrepercusión funcional comprobada de un gen candidato. Sin embargo, nosiempre se dispone de la información completa que permita definir lospolimorfismos funcionales candidatos, ni de este tipo de información para todoslos polimorfismos genéticos conocidos de cierto gen candidato. Ante estaausencia de información experimental una alternativa la proporcionan lasactuales herramientas bioinformáticas como FastSNP (Yuan HY., et al. 2006)15,Pupa-Suit (Conde L., et al. 2006) 16 o TAMAL (Hemminger BM., et al. 2006) 17que proporcionan una estimación aproximada del efecto funcional putativo. Otraforma de buscar polimorfismos funcionales putativos consiste en investigarpolimorfismos localizados en las regiones de los genes candidatos muyconservadas en otras especies (Carlton VE., et al 2006) 18. Otra opción, cuando no se dispone de la información necesaria paraconsiderar un polimorfismo como funcional probado o putativo, es la utilizaciónde tSNP. Los tSNP ofrecen una aproximación indirecta (a través del patrón dedesequilibrio de ligamiento entre los tSNP y los funcionales desconocidos) de lavariabilidad genética. Recientemente, la estrategia de resecuenciación de genes candidatos hadado buenos resultados con la identificación de nuevos polimorfismos genéticoscon repercusión funcional directamente relacionados con variables de evaluación fenotípica, ya sean farmacocinéticas (Rotger M, et al. 2007) 19 o clínicas TopolEJ., Romeo S., et al. 2007) 20,21. Además ha demostrado que el porcentaje de variabilidad explicada en lasvariables de evaluación fenotípica aumenta a medida que aumenta el número depolimorfismos funcionales analizados. 3.6.2.-ESTUDIOS DE GENERACIÓN DE NUEVAS HIPÓTESIS La secuenciación del genoma humano (Lander ES., Venter JC., et al. 2001)22,23 , la culminación de proyecto HapMap (International HapMap Consortium,2003) 12-14 y el desarrollo de técnicas de genotipado de alto rendimiento (Fan JB.,Gunderson KL., 2005/2006)24,25 han propiciado la aparición en los últimos 2 añosde una nueva modalidad de estudios genéticos. Se trata de los estudios deasociación con cobertura genómica completa (Hirschhorn JN, y Wang WY et al.2005)26,27. Son estudios en los cuales se selecciona un gran número de tSNP(entre cien mil y un millón), en función de los patrones de desequilibrio deligamiento descritos por el proyecto HapMap, con el objetivo de ofrecer una PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 34
  35. 35. cobertura de la variabilidad genómica común (5%) existente en el ser humano(fig. 3B). A diferencia de los estudios de genes candidatos, estos estudiospretenden abarcar la variabilidad presente en el genoma completo paradescubrir nuevos genes candidatos o regiones genómicas candidatas generandonuevas hipótesis cuya veracidad debe ser confirmada en los estudios dereplicación y cuya plausibilidad biológica ha de ser investigada.Básicamente, su diseño consiste en elegir unos criterios fenotípicos según loscuales clasificar la población de estudio en casos (afectados por ciertaenfermedad o los que reciben un fármaco) y controles (no afectados por laenfermedad o los que reciben placebo), posteriormente genotipar ambos grupospara los cien mil o un millón de tSNP y comparar las frecuencias alélicas y/ogenotípicas entre ambos. Los tSNP que resulten más o menos frecuentes en los casos respecto a loscontroles se definen como asociados al fenotipo investigado (a la variable deevaluación fenotípica) y consecuentemente como polimorfismos candidatos. Su localización en genes conocidos o regiones genómicas sin genesconocidos hasta ahora permite a su vez postular nuevos genes o regionescandidatos. Los estudios de asociación con cobertura genómica completa hanofrecido muy buenos resultados en enfermedades oftalmológicas, oncológicas,endocrinológicas, neurológicas, cardiovasculares e infecciosas (Fellay J, et al.2007)28. No obstante, su aplicación en los estudios farmacogenéticos estátodavía en sus comienzos (Kelly P, y Warren LL, et al 2006/2007)29-31. Estos estudios requieren muestras de tamaños considerables (unos 1.000casos y otros tantos controles) que exigen la creación de grandes consorcios decolaboración. Además, se necesita la aplicación de técnicas estadísticas deajuste para comparaciones múltiples para controlar los falsos positivosresultantes del análisis de tan elevado número de SNP junto con técnicas deajuste por la estratificación de la población de estudio (Balding DJ, Gibbs JR et al2006) 32,33.3.7.-ESTUDIOS MIXTOSLa otra modalidad de estudios farmacogenéticos de reciente aparición son los estudios mixtos. Estos estudios PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 35
  36. 36. Figura 3. Tipos de estudios farmacogenéticos. Principales tipos de estudios farmacogenéticos: A) estudios de comprobación de hipótesis o de genes candidatos y B) estudios de generación de nuevas hipótesis. Para más información, véase texto.ofrecen una aproximación indirecta (a través del patrón de desequilibrio deligamiento entre los tSNP y los funcionales desconocidos) de la variabilidadgenética. Recientemente, la estrategia de resecuenciación de genes candidatos hadado buenos resultados con la identificación de nuevos polimorfismos genéticoscon repercusión funcional directamente relacionados con variables de evaluación fenotípica, ya sean farmacocinéticas (Rotger M., et al. 2007) 19 o clínicas(Romeo S, y Lander ES, et al 2001/2007) 21,22. Además ha demostrado que el porcentaje de variabilidad explicada en lasvariables de evaluación fenotípica aumenta a medida que aumenta el número depolimorfismos funcionales analizados. 3.7.1.-ESTUDIOS DE GENERACIÓN DE NUEVAS HIPÓTESIS Hasta aquí se han descrito los diferentes tipos de estudios farmacogenéticosque pretenden investigar la aportación de los factores genéticos a la variabilidad PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 36
  37. 37. fenotípica de distintos fármacos. No obstante, todos ellos poseen elinconveniente de ser en mayor o menor medida una aproximación a lacomplejidad de la variabilidad presente en el genoma humano, ya que utilizanmarcadores genéticos subrogados. Por lo tanto, la forma de estudiar los factoresgenéticos en su conjunto se lograría con la secuenciación en paralelo delgenoma completo a nivel poblacional. 3.7.2.-PROYECTO DEL GENOMA HUMANO: SECUENCIACIÓN DEL GENOMA COMPLETO Desde la culminación del Proyecto Genoma Humano hasta la fecha, lastécnicas de secuenciación han mejorado su rendimiento y reducidoconsiderablemente su coste; aunque éste siga siendo prohibitivo pues ronda los10 millones de dólares Bennett ST, Bentley DR, et al. 2005, 2006 36,37. Unobjetivo teórico a medio-largo plazo de la comunidad internacional es conseguirla secuenciación de las 3 gigabases del genoma humano por 1.000 $ 38-41. Hastaque el proyecto «Genoma Humano por 1.000 $» (Hutchison CA, et al 2007) 42sea una realidad, tendremos que seguir utilizando las técnicas de genotipado dealto rendimiento como los mejores marcadores subrogados de la variabilidadgenómica. 3.8.-APLICACIONES FARMACOGENÉTICAS ACTUALES Aunque todavía es pronto para hablar de una verdadera medicinapersonalizada en la que el fármaco más adecuado para cada paciente seadeterminado de manera prospectiva basándose en el perfil genético, existenalgunos ejemplos de aplicaciones de la farmacogenética en la práctica clínica.Un ejemplo es el reconocimiento por parte de la Food and Drug Administration(FDA) de que el perfil genético del paciente puede determinar la aparición deefectos adversos a ciertos fármacos y, por tanto, esta información debe constaren el etiquetado del producto. Éste es el caso de los fármacos antitumoralesirinotecán y 6-mercaptopurina y más recientemente, del anticoagulante warfarinay del anticomicial carbamacepina. Irinotecán es un fármaco muy eficaz para el tratamiento del cáncer de colon,pero que presenta efectos adversos como neutropenia y diarrea grave. Elresponsable de estos efectos adversos es un metabolito activo del irinotecán, elSN-38, que es principalmente inactivado por la enzima UGT1A1. Unpolimorfismo en el promotor de esta enzima que define el alelo UGT1A1*28 estáasociado con una disminución de su actividad y con la aparición de los efectosadversos (Innocenti F, et al 2004/2006) 43,44. Basándose en estos resultados, laFDA aprobó indicar en la ficha técnica del producto que los individuoshomocigotos para el alelo UGT1A1*28 tienen mayor riesgo de sufrir neutropeniay se recomienda empezar el tratamiento con una dosis menor. PhD. Luis E. Medina Medina –“Pharmacogenetics” - School Social and Human Studies-Program PhD in Publics Health with major Epidemiology 37

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