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Inmunohistoquimica

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Inmunohistoquimica

  1. 1. INMUNOHISTOQUIMICA LILIANA MARIA AGRESOTT BELTRAN Bacterióloga
  2. 2. INMUNOHISTOQUIMICA Inmunohistoquímica consiste en una serie de métodos para localizar antígenos específicos en tejidos o células basados en una reacción antígeno-anticuerpo. Estos métodos tienen sus bases en tres disciplinas fundamentales: la histología, la inmunología y la química. Los métodos inmunohistoquímicos se desarrollaron a partir de 1941, año en el que Albert Hewett Coons, describe un método de inmunofluorescencia para detectar antígenos celulares en secciones de tejido. 25 años después Nakane, Pierce y Avrameus, revolucionaron la técnica hasta hacerla práctica, útil, de fácil realización y aplicabilidad clínica general, llegando a la inmunohistoquímica como es hoy. Albert Hewett Coons
  3. 3. La Inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno.
  4. 4. INMUNOHISTOQUIMICA UTILIDAD  Diagnóstico y clasificación de tumores malignos indiferenciados.  Marcadores predictivos y pronósticos de tumores (receptores estrogenicos y Her2 para C.A. de Mama).  Identificación de agentes infecciosos en tejidos (Virus, bacterias, hongos, parásitos).  Clasificación de leucemias y linfomas.  Determinación del origen de tumores metastáticos.
  5. 5. TOMA DE MUESTRA AGUJA RASPADO ENDOSCOPIA DISECCION DIRECTA CATETER
  6. 6. PREPARACION DE LA MUESTRA FIJACIÓN Permite preservar el tejido del deterioro provocado por la putrefacción y autolisis derivada de la muerte celular. El fijador más empleado es el formaldehído en microscopía de luz, mientras que en microscopía electrónica se utiliza más el glutaraldehído.
  7. 7. FIJADORES FIJADORES POR METODOS FISICOS FIJADORES POR METODOS QUIMICOS Se emplea enfriamiento por congelación del tejido. Se utiliza para estudios morfológicos o funcionales que requieran conservar intacta la estructura antigénica del tejido. Ej.: liofilización Los fijadores desnaturalizan e insolubilizan la proteínas tisulares, bloqueando la autolisis por inactivación enzimática . Ejemplo: alcohol etílico, acetona, acido acético
  8. 8. FORMALDEHÍDO O FORMOL  Barato  Conserva estructura tisular.  Buen desinfectante y no endurece los tejidos.  A temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de las 36 horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas.  Compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan rutinariamente en Anatomía patológica
  9. 9. INCLUSION Consiste en sustituir el agua tisular por un medio liquido capaz de solidificar a fin de proporcionar a la muestra la consistencia y homogeneidad adecuadas para obtener secciones muy delgadas mediante un instrumento llamado micrótomo. Deshidratación Tiene como finalidad la eliminación completa del agua de la muestra tisular para que se pueda embeber en medios de inclusión.
  10. 10. Deshidratación Parámetros 1. Se emplean una serie de alcoholes de concentración ascendente (50,70,80,95 y 100%) 2. El volumen del baño debe ser 10 veces superior al volumen de la muestra que se va a deshidratar. 3. La deshidratación debe ser completa 4. La exposición prolongada al agente deshidratante provoca un endurecimiento de los tejidos. 5. Se recomienda el empleo de sulfato de cobre anhídrido, oxido de calcio, resinas humectantes.
  11. 11. El principal agente deshidratante es el alcohol etílico. Otros: alcohol metílico, acetona, alcohol butírico, dióxido de etilo.
  12. 12. Aclaramiento o Desalcoholización Sustitución del agente deshidratante por una sustancia que pueda disolverse con el medio de inclusión que va a utilizarse. Principal agente : Xileno  Rápido  Endurece poco los tejidos  Se elimina fácilmente del medio de inclusión Desventajas:  Toxico  Solo aclara desde alcohol absoluto  Por mucho tiempo, endurece el tejido
  13. 13. Infiltración o impregnación Una vez que la muestra ha sido totalmente embebida por el xilol (aclaramiento) se transfiere a un baño de parafina derretida dentro de una estufa. La estufa es mantenida a 58 grados centígrados (el punto de fusión de la parafina es 56-57 grados) y la muestra es transferida a través de tres baños sucesivos de parafina. De esta forma la parafina caliente desplaza al xilol y difunde dentro de la muestra o tejido. A este paso se lo denomina Inclusión en parafina.
  14. 14. Encastramiento del tejido y confección de los bloques Consiste en la obtención de un bloque de tejido, mas el medio de inclusión, mediante el enfriamiento lento a 10-15°C Las Estaciones de Inclusión forman los bloques; formados por:  Dispensador de parafina liquida  Placa caliente para la orientación de las piezas.  Placa fría para la solidificación del bloque.
  15. 15. Corte Las secciones producidas a partir de un tejido en parafina, suelen tener un espesor entre 4 y 6 micras. Hay secciones mas gruesas de entre 10 y 20 micras y se emplean para el estudio del sistema nervioso central. Los cortes se realizan con el micrótomo.
  16. 16. Coloración COLORACIONES NUCLEARES Colorantes: Carmin, Safranina, hematoxilina.
  17. 17. COLORACIONES CITOPLASMATICAS Colorantes: Eosina, Floxina, Cromotropo SR. Colorantes menos específicos que los nucleares, se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos.
  18. 18. ….. INMUNOHISTOQUIMICA. TECNICAS DE INMUNOPEROXIDASA TECNICAS CON AC MARCADOS Método Directo
  19. 19. Método Indirecto
  20. 20. METODO DE AVIDINA- BIOTINA Incubación de los cortes en antisuero primario especifico. 2. Incubación en anticuerpo secundario biotinizado 3. Incubación en solución ABC (complejo avidina-biotinaperoxidasa). 4. Incubación en Diaminobencidina y peróxido de hidrogeno. 1.
  21. 21. ASPECTOS PRACTICOS EN EL DESARROLLO DE LA INMUNOHISTOQUIMICA  El tiempo de fijación debe ser el necesario para preservar la muestra, el exceso de fijación reduce la inmunorreactividad del tejido.  La fijación debe ser inmediata para evitar la autolisis.  La inclusión en parafina caliente produce perdida de la antigenicidad.  La albumina de huevo, gelatina, poli-L-lisina, cromogel son adhesivos de las secciones de la muestra al portaobjeto. Un exceso de éste causa el aumento de tinción inespecífica de fondo.
  22. 22. BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ENDOGENA Se inhibe su actividad por la incubación de secciones con metanol absoluto que contenga peróxido de hidrogeno al 3%, de 10-30 minutos a temperatura ambiente. BLOQUEO DE LA TINCION DE FONDO  Tinción de fondo especifica  Tinción de fondo inespecífica
  23. 23. Tinción de fondo especifica  Presencia de Ag en lugares distintos a aquel en que se quiere detectar.  El antisuero contenga Ac contra Ag distintos al que se quiere determinar . Tinción de fondo inespecífica Se forma unión no inmunológica del antisuero a ciertos componentes del tejido, ejemplo: colágeno. Se evita usando antisuero primario en diluciones muy altas .
  24. 24. PENETRACIÓN DE REACTIVOS Para la escasa penetración se emplea el uso de detergentes como el Tritón X- 100 y la saponina que permeabilizan las membranas. CONTROLES Control negativo: se omite el antisuero primario y se reemplaza por suero no inmune o Buffer. Control Positivo: se utiliza una sección de tejido donde se encuentre el antígeno a determinar.
  25. 25. CROMOGENO Actúan como oxidantes y afectan el grado de tinción:  Luz intensa  Incremento o disminución de la porción entre el cromógeno y sustrato. Recomendaciones:  El revelado no debe realizarse en condiciones de iluminación intensa  El peróxido de hidrogeno no debe exceder una concentración del 3%.  El DAB no debe exceder una concentración del 0.5%.
  26. 26. CICLOOXIGEASA-2 La ciclooxigenasa (COX) es una enzima que cataliza la síntesis de prostaglandinas. Se han demostrado incrementos en la expresión de la COX2 en enfermedades inflamatorias y en distintas neoplasias como carcinomas de colon, estomago, esófago, mama , pulmón, hígado, ovario y páncreas. Se ha relacionado al COX-2 en la carcinogénesis por la estimulación de la angiogénesis y esto es un proceso crucial para el crecimiento y expansión tumoral.
  27. 27. K i 67  Ki-67 es una proteína nuclear expresada en las células durante las fases activas del ciclo celular (G1,S,G2,M). Es empleada para medir el crecimiento de tejidos en las neoplasias malignas. Establece una relación directa entre la presencia o no de lesión intraepitelial y la extensión de células positivas .  Marcador poco específico porque su expresión aumenta en cuadros reactivos epiteliales (inflamación).
  28. 28. OSTEOPONTINA La osteopontina (OPN) es una glicoproteína sintetizada por una gran variedad de células, incluyendo: linfocitos T, macrófagos, células epiteliales, células endoteliales, células del músculo liso, fibroblastos, osteoclastos, osteoblastos y células Tumorales. La OPN media interacciones célula-célula y célula-matriz. Es una proteína anti-apoptotica y se sobreexpresa en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de ovario, carcinoma papilar de tiroides, melanoma.
  29. 29. REPORTE Cuantificación del resultado inmunohistoquímico (J Histoch 2005; 28:89)  Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las células “diana” con menor intensidad que el control.  Positividad débil (+/-): más del 50% de las células “diana” con menor intensidad que el control.  Positivo (+): más del 50% de las células “diana” con igual o mayor intensidad que el control. El límite de intensidades entre negativo y positividad débil o positivo se hace por comparación con un control interno existente
  30. 30. REPORTE Determinación de c-erbB-2/neu en cáncer de mama: análisis comparativo de la determinación mediante análisis inmunoenzimático (ELISA) e inmunohistoquímico. Dra Maria L Lamelas Suarez-Pola , Dr Julio Vázquez , Dr. Luis O González , A Rodil , Dra Paula Vérez , Dr Francisco Vizoso y Dr Pablo Raigoso  0: no tinción  +: tinción incompleta o débil de membrana  ++: tinción completa de membrana en al menos el 10% de las células  +++: fuerte tinción completa de membrana en la mayoría de las células .
  31. 31. Tinción inmunohistoquímica (+)cerbB2/neu en un carcinoma de mama (400x) Tinción inmunohistoquímica (++)cerbB2/neu en un carcinoma de mama (400x) Tinción inmunohistoquímica (+++) de c-erbB2/neu en un carcinoma ductal infiltrante de mama (400x)
  32. 32. Ki 67 Tesis doctoral caracterización inmunofenotípica del cáncer de cuello uterino asociado a la infección por virus papiloma humano (hpv), Morelva Toro de Méndez. universitat de valencia, 2006.  El porcentaje de células neoplásicas o normales con reactividad fue estimado considerando un mínimo de 100 células por disco tisular. La distribución de las células inmunoreactivas se efectuó mediante una escala semicuantitativa como se describe a continuación:
  33. 33. KI 67 Negativo: < del 5% de células reactivas. +: de 5% a <25% de células reactivas. ++: de 25% a 50% de células reactivas. +++: > del 50% de células reactivas.  La evaluación de la inmunoreactividad de Ki-67 consideramos esta reacción como baja cuando observamos menos del 5% de las células teñidas.
  34. 34. CICLOOXIGENASA 2 Tesis doctoral: estudio de la expresión imuohistoquímica de ciclooxigeasa-2 en pacientes con cáncer avanzado de laringe sometidos a quimioterapia de inducción, con la intención de conservar la función fonatoria. Óscar E. Cazorla Ramos. Málaga, 2008.  se utilizo un anticuerpo monoclonal de ratón, COX2, diluido a 1:900.
  35. 35. CICLOOXIGENASA 2 Para la cuantificación de COX-2 utilizaron s el método descrito por Davies y cols. La expresión de COX-2 fue evaluada, de manera semicuantitativa, valorando la intensidad de tinción citoplasmica clasificada en: - 0: Ausencia de tinción - 1: débil tinción - 2: moderada tinción - 3: fuerte tinción Posteriormente se realizo una estimación del porcentaje de células positivas para cada intensidad en 10 campos de gran aumento. Se multiplico el porcentaje de células que presentaba cada intensidad de tinción, y el resultado se sumo obteniendo un valor que oscilaba de 0 a 300. Finalmente, se considero: - Negativo: 0 a 100 - Positivo: 101 a 300
  36. 36. OSTEOPONTINA Osteopontin is overexpressed in colorectal carcinoma and is correlated with P53 by immunohistochemistry. 2012 JING LI1, GUANG-ZHI YANG, ZI-MAN ZHU, ZHI-YONG ZHOU and LIN LI1 The expression of OPN and P53 was determined in each case when positive cells were >10%, since the positive pattern was often diffuse and similar in staining intensity. OPN only displayed weak staining in a few cells and the ratios were much <10%, therefore all the cases were determined as negative
  37. 37. OSTEOPONTINA EN TEJIDO DE COLON

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