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Aula Pcr

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Biologia Molecular

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Aula Pcr

  1. 1. Polymerase Chain Reaction (PCR) Prof. Msc. Eduardo Honda
  2. 2. A invenção da PCR <ul><li>1983 Kary Mullis </li></ul><ul><li>1985 1º paper </li></ul><ul><li>1993 Nobel da Química </li></ul>
  3. 3. PCR, a ferramenta do futuro <ul><li>Grande quantidade de DNA em pouco tempo. </li></ul><ul><li>Baixo custo </li></ul><ul><li>A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada. </li></ul><ul><li>PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA. </li></ul><ul><li>O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado. </li></ul>
  4. 4. A reacção
  5. 5. O que envolve a reacção? <ul><li>DNA Template </li></ul><ul><li>Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino) </li></ul><ul><li>Nucleótidos (dNTPs) </li></ul><ul><li>Primers </li></ul><ul><li>DNA polymerase (pex: Taq, Pfu ) </li></ul>
  6. 6. Quantos ciclos?
  7. 7. Fidelidade da reacção <ul><li>A Taq comete ERROS </li></ul><ul><li>Qual a importância dos erros? </li></ul><ul><li>Como superá-los? </li></ul>
  8. 8. Termo-Cicladores
  9. 9. Funcionou? <ul><li>Se não…o que fazer? </li></ul>
  10. 10. Optimização da reacção de PCR <ul><li>Temperatura </li></ul><ul><li>Tempos </li></ul><ul><li>Concentração de Mg 2+ na reacção. </li></ul><ul><li>Quantidade de template e de polymerase </li></ul>
  11. 11. DNA polimerases.. <ul><li>E. coli </li></ul><ul><li>Taq </li></ul><ul><li>Pfu – proofreading </li></ul><ul><li>rTth DNA Polymerase </li></ul>
  12. 12. Concepção dos PCR Primers <ul><li>Comprimento: especificidade vs eficácia </li></ul><ul><li>Temp de annealing </li></ul><ul><li>Composição de bases </li></ul><ul><li>Extremidade 3’ </li></ul><ul><li>Regiões repetitivas do DNA </li></ul><ul><li>Enzimas de restrição </li></ul><ul><li>Estrutura secundária </li></ul><ul><ul><li>Homologias Intra e Inter-primer </li></ul></ul>
  13. 13. Primers a formar Hairpins e Dímeros <ul><li>Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin : </li></ul><ul><li>Dímero de primers (intra ou inter primer). </li></ul>
  14. 14. Aplicações do PCR <ul><li>Multiplex PCR </li></ul><ul><li>Real Time PCR </li></ul><ul><li>PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas </li></ul><ul><li>PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA </li></ul><ul><li>PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas </li></ul><ul><li>PCR assimétrico </li></ul><ul><li>PCR e clonagem de DNA genómico </li></ul><ul><li>PCR e clonagem de cDNA </li></ul><ul><li>PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética </li></ul>
  15. 15. Multiplex PCR
  16. 16. Real time PCR
  17. 17. PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas
  18. 18. Para detectar polimorfismos de local de restrição <ul><li>O que são polimorfismos? </li></ul><ul><li>Porque existem os polimorfismos? </li></ul><ul><li>Como se detectam esses polimorfismos? </li></ul>
  19. 19. PCR específico para um alelo e detecção de mutações <ul><li>Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo? </li></ul><ul><li>Um só nucleotídeo faz a diferença? </li></ul><ul><li>Como se interpretam os resultados? </li></ul>
  20. 20. <ul><li>Qual a vantagem? </li></ul>PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA
  21. 21. Linker-primed PCR <ul><li>Como decorre? </li></ul><ul><li>O que é o linker? </li></ul><ul><li>Que primers são usados? </li></ul>
  22. 22. <ul><li>Qual a vantagem? </li></ul>PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada
  23. 23. PCR inverso <ul><li>Quando se utiliza? </li></ul><ul><li>Como são os primers? </li></ul><ul><li>Como decorre o processo? </li></ul>
  24. 24. Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA
  25. 25. PCR assimétrico <ul><li>Com que fim se utiliza? </li></ul><ul><li>Porquê assimétrico? </li></ul>
  26. 26. Clonagem de DNA genómico ↓ Clonagem de cDNA ↓
  27. 27. PCR e DNA Fingerprinting Exemplo: “locus” D1S80
  28. 28. PCR e DNA Fingerprinting <ul><li>Suas principais aplicações: </li></ul><ul><li>Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime) </li></ul><ul><li>Filiação genética (ex. testes de paternidade) </li></ul>
  29. 30. PCR e Filiação genética Pai Mãe
  30. 31. O futuro da PCR <ul><li>PCR ↔ material genético </li></ul><ul><li>Fotocopiadora ↔ material escrito </li></ul><ul><li>tornando a cópia </li></ul><ul><li>fácil, barata, acessível </li></ul>
  31. 32. O futuro da PCR <ul><li>Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado. </li></ul>
  32. 33. Referências <ul><ul><ul><li>Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics ;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition ; 1992; New York,Scientific American Books </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Geoffrey M Cooper: The Cell , a molecular approach; second edition </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Alkami quick guide tm for PCR </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004 </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR) </li></ul></ul></ul>

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