Aula Engenharia Genetica

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Aula Engenharia Genetica

  1. 1. Fundamentos de Engenharia Genética Prof. Dr. Eduardo Honda Porto Velho 2008
  2. 2. Dogma Central da Biologia Molecular
  3. 3. O que é Engenharia Genética? É um conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) de material genético in vitro Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo
  4. 4. Clonagem Molecular Para se estudar um determinado gene que codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá- lo.   Clonagem = fazer várias cópias idênticas Clonagem de DNA → isolar um fragmento específico de DNA do cromossomo, introduzi- lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias idênticas  
  5. 5. Clonagem Molecular Isolamento de Novos organismos que produzem enzimas de interesse Biotecnológico.
  6. 6. Clonagem Molecular- Isolamento Gênico Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.
  7. 7. Isolamento do DNA- PCR Desnaturação do DNA Fita-Dupla
  8. 8. Isolamento do DNA- PCR Após vários ciclos... Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!
  9. 9. Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor   Tipos: A) Genômica: - clonado diretamente do genoma. B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
  10. 10. Isolamento de DNA- Biblioteca genômica Extração do DNA Genômico; Clivagem com enzimas de restrição; Ligação dos Fragmentos nos vetores; Transformação Celular; Replicação do vetor.
  11. 11. Biblioteca de cDNA - mRNA de um tipo celular específico; - “primer” de oligo dT e transcriptase reversa; - DNA Polimerase I e dNTPs; - Clonagem em um vetor de escolha
  12. 12. Clonagem Molecular- Requerimentos 1) Método para clivar o DNA alvo; 2) Método para juntar 2 moléculas de DNA covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO! 3) Célula hospedeira; 4) Método para introduzir moléculas de DNA para dentro da célula hospedeira que as possa duplicar; 5) Método para selecionar moléculas de DNA quimérico ou recombinantes; 6) Métodos para o screening da característica procurada .
  13. 13. Geração de moléculas recombinantes - Clonagem Molecular -
  14. 14. CLONAGEM
  15. 15. Ligação de extremidades compatíveis
  16. 16. Sítio Múltiplo de Clonagem (Polylinker)
  17. 17. As endonucleases de Restrição Clonagem Orientada
  18. 18. As “Ferramentas” 1) Enzimas 2) Vetores 3) Células hospedeiras
  19. 19. ENZIMAS
  20. 20. Enzimas de Restrição São endonucleases que clivam o DNA em seqüências específicas chamadas sítio de restrição. Quebram a ligação fosfodiéster Os sítios de restrição são, geralmente, seqüências palindrômicas (mesma seqüência nos dois sentidos)
  21. 21. Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
  22. 22. Enzimas de Restrição Classes of Restriction Enzymes Type I cleavage occurs 400-7000 bp from recognition site Type II cleavage occurs adjacent or within recognition site Type III cleavage occurs 25-27 bp from recognition site • Endonucleases sítio-específicas isoladas de procariotos • Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos) • Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio de restrição • Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular EcoRI metilase
  23. 23. DNA Ligase Promover a união de moléculas de DNA pela formação de uma ligação fosfodiéster entre uma extremidade 3’- OH e outra 5’-PO4.
  24. 24. DNA Polimerases Polimerizam a molécula de DNA a partir de uma extremidade 3´-OH e usando uma das fitas do DNA como molde. Exe: Taq polimerase
  25. 25. Transcriptase reversa Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA Isolada dos retrovírus Aplicação: síntese de cDNA
  26. 26. VETORES
  27. 27. Os Vetores São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado.   Características desejadas:Características desejadas: •Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;Habilidade de se duplicar na célula hospedeira; • Marca genética para selecionar a célula contendo oMarca genética para selecionar a célula contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas); •Sítios de clonagem únicos.Sítios de clonagem únicos.
  28. 28. Tipos de vetoresPlasmídios Bacteriófagos (fagos) Cosmídios Cromossomos artificiais de levedura (YAC) Vetores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos
  29. 29. Plasmídios Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autônoma (ORI); Têm marcas de seleção para resistência a antibióticos ou complementação auxotrófica.
  30. 30. Sequências de DNA de um vetor de expressão de E. coli
  31. 31. Vetores de expressão
  32. 32. Transformação Bacteriana Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
  33. 33. O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado. O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA recombinante no plasmidio.
  34. 34. Bacteriófagos Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na célula hospedeira. Ex: Fago λ  
  35. 35. Vetores baseados no fago λ Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessários para integração/excisão para serem substituídos por DNA exógeno e formar um genoma de 50 Kb que é empacotado in vitro. Genomas maiores ou menores não são empacotados. Ciclo lítico compulsório
  36. 36. Clonando no Fago λ
  37. 37. Cosmídios • São plasmídios contendo as extremidas “cos” do fago λ • Capacidade de clonagem: 40 Kb
  38. 38. Cromossomos artificiais
  39. 39. CÉLULAS HOSPEDEIRAS
  40. 40. Células hospedeirasCaracterísticas: Permitir a duplicação do vetor; Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia); Não pode representar perigo ao meio ambiente; Não deve modificar o DNA exógeno; Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras, células vegetais, cultura de células de insetos e mamíferos).
  41. 41. Métodos de introdução do DNA na célula hospedeira Transformação com cloreto de cálcio (bactérias); Transdução (fagos empacotados in vitro); Transfecção (células de mamíferos); Eletroporação (leveduras e bactérias); Biolística ou “bombardeamento” (plantas); Microinjeção (ovos e oócitos).
  42. 42. O canhão gênico é uma nova forma de transformação celular. Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolística Inserindo genes nas células
  43. 43. Adapted from Human Genetics, Ricki Lewis Microinjeção
  44. 44. Transformação Bacteriana Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
  45. 45. Clonando no Fago λ
  46. 46. Seleção de clones recombinantes resistência e sensibilidade a antibióticos; requerimentos nutricionais (auxotrofia); formação de placas de lise
  47. 47. Identificação de um clone de interesse - hibridação com sonda radioativa - anticorpo específico Screening
  48. 48. Aplicações da Engenharia Genética
  49. 49.  Análise da estrutura/função de genes  Produção de proteínas de interesse industrial e terapêutico  Engenharia proteica  Criação de organismos transgênicos  Terapia gênica  Diagnóstico molecular (doenças parasitárias e genéticas)  Teste de paternidade / medicina forense  Arqueologia molecular / evolução
  50. 50. Plantas Transgênicas
  51. 51. Animais Transgênicos
  52. 52. Microinjeção de DNA no núcleo de ovoMicroinjeção de DNA no núcleo de ovo fertilizado de camundongo - gene dofertilizado de camundongo - gene do fator de crescimento humanofator de crescimento humano
  53. 53. Biofármacos Recombinantes
  54. 54. Terapia Gênica
  55. 55. Adição do gene terapêutico Substituição do gene terapêutico
  56. 56. Uso de vírus

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