Presentazione ii anno campana

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  • Le membrane cellulari sono strutture estremamente complesse costituite da centinaia di molecole di diversa natura. Lo stato fisico, determinato dalla loro composizione, dalla temperatura e dalle condizioni esterne, interviene nel regolare l’attività di tutte le proteine che vi sono immerse e, conseguentemente, anche l’espressione di alcuni geni coinvolti nelle risposte da stress. Le membrane lipidiche partecipano pertanto al “signaling” cellulare, regolando in questo modo importanti funzioni. All’interno di questo"mare" lipidico sono immerse le proteine, distinte in due categorie principali in base alle caratteristiche della loro collocazione nella membrana: proteine integrali e periferiche. La separazione dei lipidi in cluster asimmetrici può essere dovuta all’influenza di fattori esterni (p.e. Ca 2+ ) e fattori interni (p.e. colesterolo). La loro organizzazione in raft lipidici e la differente composizione garantiscono il migliore intorno chimico-fisico per le proteine.
  • I G Protein Coupled Receptor (GPCR) sono proteine di membrana con sette domini transmembrana e probabilmente sono la superfamiglia di proteine più eterogenea e una delle più rappresentate nel proteoma umano. I GPCR interagiscono con proteine G eterotrimeriche (cioè costituite da 3 diverse subunità chiamate α, β e γ). Le proteine G, che sono ancorate alla membrana, devono il loro nome al fatto che sono GTPasi, legano cioè GTP nella forma attiva e lo idrolizzano a GDP inattivandosi. Quando la molecola che porta l’informazione (ligando) lega il GPCR, viene promosso lo scambio di GDP con GTP nella subunità α della proteina G attivandola e permettendone l'interazione con un effettore (quale fosfolipasi C, canali ionici, guanilato ciclasi o adenilato ciclasi), spesso collocati in differenti domini di membrana, come i lipid raft. Dall’altro lato il dimero G  rimane in prossimità del recettore per reclutare GRK (che fosforila e inattiva GPCR) o per regolare altre proteine di segnalazione. Dopo un certo periodo di tempo, la molecola di GTP si idrolizza in GDP, inattivando la subunità α che può nuovamente ricongiungersi col complesso βγ. Il sistema, quindi, è organizzato in modo tale da auto-spegnersi dopo un certo periodo di tempo. La trasduzione del segnale mediata da GPCR attiva una vera e propria cascata di conduzione del segnale: è anche per questo che bastano bassissime concentrazioni di ligando per avere una risposta dall'organismo. Infatti una sola molecola di ligando (messaggero primario) lega un GPCR, che è in grado di attivare molte proteine G, ognuna delle quali, interagendo con opportuni effettori, porterà alla produzione di numerosi messaggeri secondari con una notevole amplificazione del segnale. Pertanto si possono trovare molte migliaia di proteine G nelle regioni di membrana ad alta densità di GPCR. In tali siti le interazioni proteina-lipide e lipide-lipide definiscono la struttura della membrana, il tipo di proteine che si posso trovare, l'attività dei GPCR e le relative proteine di segnalazione. Vari ligandi utilizzano i GPCR per stimolare dei target di membrana, citoplasmatici e nucleari. Il GPCR interagisce con le proteine G eterotrimeriche composte da….e che sono legate al GDP nello stato inattivo. Il legame all’agonista porta ad un cambio conformazionale nel recettore, che catalizza la dissociazione dalla subunità seguito da legame del GTP alla proteina G e dalla dissociazione di G in subunità. Le subunità delle proteine G sono divise in quattro grandi famiglie: G s , G i , G q e G 12 , e un singolo GPCR può legarsi a una o più famiglie di proteine G. ogni proteina G attiva alcuni effettori a valle. Generalmente la G s stimola l’adenilato ciclasi e aumenta I livelli di cAMP, mentre G i inibisce l’adenilato ciclasi e abbassa i livelli di cAMP, mentre i membri della famiglia G q attivano la PLC, che separa il PIP 2 in DAG e IP 3 . Le subunità Gb e Gg funzionano come un dimero per attivare molte molecole deputate al signaling, inclusa la fosfolipasi, I canali ionici e le chinasi lipidiche. as a dimer to activate many signalling molecules, including phospholipases, ion channels and lipid kinases. Lo spostamento di ogni subunità verso il giusto intorno lipidico dipende in gran parte dalla preferenza per alcuni lipidi, o strutture lipidiche, anche se ad oggi sono disponibili poche informazioni sulle interazioni proteina G - membrana. Come già detto, i GPCR sono raggruppati in regioni di membrana ben definite, dove le proteine G eterotrimeriche co-localizzano in eccesso molare. In queste regioni le proteine G interagiscono con lo strato citosolico della membrana plasmatica, aiutate da frazioni di MA e PA legate alla subunità G  e da frazioni di GG della subunità G  . L'effetto di questi lipidi sul bilayer, dovuto alla loro influenza sulla struttura fosfolipidica, non è stato ancora studiato.
  • Alcune proteine contengono delle molecole lipidiche legate in maniera covalente alla catena peptidica: esse sono utilizzate come ancore per inserirsi all’interno della membrana cellulare. Queste molecole comprendono: acidi grassi, palmitico (PA) e miristico (MA), isoprenoidi (farnesolo e geranilgeraniolo, GG) e glicosilfosfatidilinositolo (GPI, molecola complessa formata da fosfatidilinositolo e oligosaccaridi). Le proteine palmitoilate e miristoilate e quelle GPI-legate si distribuiscono di preferenza nei raft, in quanto le loro catene lipidiche sature hanno una conformazione particolarmente adatta ad essere accolta nei domini lipidici allo stato liquido-ordinato. Al contrario, le proteine isoprenilate, che hanno catene lipidiche ramificate e voluminose, non idonee per i domini allo stato liquido-ordinato, si distribuiscono di preferenza nelle regioni della membrana più fluide (stato liquido-cristallino). Il lateral stress profile è stato calcolato registrando la posizione e l’accelerazione di tutti gli atomi nelle membrane. Se da un lato l’inserzione di una molecola di MA, PA o GG provoca una netta riduzione del valore della pressione laterale, sia nelle membrane di PC che di PC-PE, nella zona interna (idrofobica) della membrana stessa (fig.2), dall’altro lato la pressione a livello dell’interfaccia acqua-lipidi non viene alterata in maniera marcata. In più l’effetto di MA, PA e GG sulle membrane di PC è maggiore di quello avuto sulle membrane PC-PE, anche se GG provoca un effetto maggiore rispetto agli acidi grassi sulle membrane di PC: probabilmente ciò è dovuto al maggiore volume dell’isoprenoide e al più stretto impaccamento della membrana di PC.
  • Quindi è possibile concludere dicendo che MA e PA legano membrane ricche di fosfatidilcolina (PC) in maniera più forte di GG, anche se quest'ultimo riduce maggiormente la pressione laterale delle membrane PC rispetto agli altri acidi grassi. Tutto ciò non fa altro che confermare il fatto che: 1) le proteine Gαβγ e Gβγ preferiscono intorni lipidici propensi alla fase non-lamellare, il che può in parte spiegare il fatto che le proteine G si accumulano in zone ricche di GPCR, i cui domini transmembrana aumentano la propensione alla fase non-lamellare; 2) le subunità Gα preferiscono legare regioni della membrana propense alla fase lamellare, come i lipid raft, dando una spiegazione ragionale alla loro migrazione dal recettore ai domini effettori di membrana. Questi risultati dimostrano che modificazioni dei lipidi legati alle proteine G regolano la struttura delle membrane e ne influenzano le proprietà fisico-chimiche dei microdomini, il che in parte spiega le basi molecolari alla base dello smistamento delle subunità della proteina G nella membrana plasmatica.
  • Currently there are no clinical trials that have evaluated COX-2 inhibitors for the treatment or prevention of AD, although results are expected soon. Most of the evidence comes from in vitro and animal work. There is a substantial amount of COX-2 in neurons of the neocortex and hippocampus in normal brains.29 COX-2, but not COX-1, production may be stimulated in AD. Studies using cell cultures and animal models suggest that COX-2 may contribute to neurodegeneration through apoptosis mechanisms.
  • The Fukui function, denoted by f(r), is defined as the differential change in electron density due to an infinitesimal change in the number of electrons. A molecule is susceptible to radical attack at sites where f*(r) is large. The map of the Fukui radical function on the total electron density indicates clearly the sites more favorable for radical attack. The arrows indicate the C13, which is the carbon interested of H* abstraction in COX. It is evident that –OH group in alpha reduce the chance to react of AAxOH.
  • In seguito a stress dovuti all’aumento di temperatura, vengono generati diversi mediatori lipidici dai pathway della fosfolipasi C, diacilglicerolo lipasi e monoacilglicerolo lipasi. Il riarrangiamento specifico dei microdomini di membrana (raft) potrebbe aiutare il funzionamento della piattaforma dello stress signaling. I composti interagenti con i lipidi di membrana modulano l’espressione di Hsp senza indurre l’unfolding delle proteine. Il Bimoclomol, un co-induttore di Hsp interagente con la membrana, prolunga l’attivazione dell’integratore della risposta da stress, l’heat shock factor-1 (HSF1). HSF1 è soggetto a complesse modificazioni post-traslazionali come l’acetilazione, la fosforilazione e la sumoilazione. L’attivazione prolungata di HSF1 è mediata dalla deacetilasi SIRT1. Obiettivi: avere una visione del meccanismo della modulazione della fase lipidica dovuto al co-induttore BGP15, un miglioramento del Bimoclomol. Mediante studi di dinamica molecolare (MD) ho analizzato il binding, la permeazione e l’accumulo di molecole biologiche rilevanti sulle membrane cellulari. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare il legame alla membrana e il comportamento di ripartizione su modelli di membrana di sfingomielina (SM)-colesterolo (CHOL).
  • BGP-15 è una molecola attiva su membrana capace di riconoscere spontaneamente e di inserirsi nei domini SM-CHOL. Il BGP-15 non attraversa la membrana ma rimane vicino alla superficie a una distanza di 2-5 Å dall’ossigeno della sfingomielina e di 5-8 Å dallo strato acquoso. L’ipotesi immediata che il BGP-15 in forma neutra possa attraversare la membrana e raggiungere la parte più idrofobica che rappresenta il centro della membrana non sembra corretta. Probabilmente la presenza di molecole grandi e aromatiche al centro della membrana forzerebbe le catene aciliche dei lipidi ad adattarsi attorno al BGP-15. Questo ridurrebbe la mobilità della parte terminale delle catene (è stato osservato un leggero aumento della mobilità nella parte terminale delle catene visibile in fig. 8) e conseguentemente ridurrebbe l’entropia della membrana, che è altamente sfavorevole. Il BGP-15 induce un aumento dello spessore del bilayer e un migliore allineamento dei lipidi (fig. 10-11). È da notare la capacità del BGP-15 di discriminare tra le membrane di SM-CHOL con differente composizione. L’analisi del profilo di densità indica che la membrana SM-CHOL con una composizione di 1:1 sono più capaci di incorporare le molecole di BGP-15 (più rigide) rispetto a quella con una composizione non bilanciata. Il BGP-15 induce anche un aumento del disordine nella parte terminale delle catene. Le ultime due osservazioni sono in accordo con una possibile interazione favorevole tra il BGP-15 e le molecole di CHOL.
  • Atomistic MD simulations are used to compute bilayer properties and equilibrium distributions of solutes across lipid bilayers. All simulation studies are susceptible to sampling errors, particularly when simulation timescales are much smaller than the typical times in which a molecule cross a membrane. The investigation of a membrane interacting molecule can be precluded by high energy barrier, even when the molecular dynamics appear to converge. To face this critical problem, two elements are required: 1) a computational power well above the typical laboratory capabilities; 2) new algorithms to sample the free energy of binding across the bilayer.
  • The installation of GRIMD is straithforward. What you must do is install the MASTER and the SLAVES. The installation of the slaves must be done only once. Any update can be performed automatically, on all slaves, from the master. GRIMD comes in two flavors: there is a modality suited for computers used by students (SCREENSAVER mode), and an installation for computers of your own lab (LABORATORY mode). GRIMD was tested on tens of computers spread across buildings and department. The performance depends linearly with the number of nodes and permits a rational use of available computational power.
  • The algorithm we have developed is similar to umbrella sampling or metadynamics. The molecule is placed 1-2 nm far from the membrane surface and a force, orthogonal to membrane, is applied to the molecule. To predefined points, the force is removed and the whole system is left unbiased. After 1 ns, the free energy of binding, as well as Van der Waals energies, is computed. The collection of thousands of the free energy values permit the reconstruction of the G profile and further application to the potential of mean field.
  • E’ un sottile rivestimento in forma di doppio strato che delimita la cellula ed è formata in prevalenza da fosfolipidi e proteine. Presenta microdomini costituiti principalmente da sfingolipidi e colesterolo. Questi microdomini sono coinvolti in una miriade di funzioni cellulari come la trasduzione del segnale, il traffico di membrana, il differenziamento neuronale l'entrata di patogeni e di tossine nella cellula.  E’ caratterizzata da una marcata asimmetria che riflette le differenti funzioni dei due monostrati.
  • Presentazione ii anno campana

    1. 1. <ul><ul><ul><li>Tutor: Dottoranda: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Prof. Stefano Piotto Piotto Federica Campana </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Co-Tutor esterno: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Prof. Pablo V. Escribá </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Department of Biology, University of the Balearic Islands </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Spain </li></ul></ul></ul>Università degli Studi di Salerno Dottorato di Ricerca in Scienza e Tecnologie per l’Industria Chimica, Farmaceutica e Alimentare XI CICLO Studio di interazione di molecole attive su membrane cellulari mediante tecniche bioinformatiche e di dinamica molecolare
    2. 2. Brief recall to cell membranes Proj 1: Study on the effect of G protein lipids on membrane structure Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new potential non steroidal anti-inflammatory drug Proj 3: The HSP co-inducer BGP-15 activates stress signal transduction pathways by remodeling plasma membrane rafts Proj 4: GRIMD: Grid for molecular dynamics Outline
    3. 3. Brief recall to cell membranes
    4. 4. Dorsam and Gutkind Nature Reviews Cancer 7 , 79–94 (February 2007) | doi:10.1038/nrc2069 Brief recall to cell membranes
    5. 5. Analysis: lateral pressure profile Proj 1: Study on the effect of G protein lipids on membrane structure Myristic acid (MA) Palmitic acid (PA) G eranylgeraniol (GG)
    6. 6. Conclusions: MA and PA interact strongly with PC membranes than GG. The addition of GG decreases drastically the lateral pressure of POPC membranes than other fatty acids: this is possibly due to the greater volume of the isoprenoid and the tight packing of the GG-free PC membrane. GG increases markedly the non-lamellar phase propensity. G βγ and G αβγ prefer non-lamellar prone regions and G α lamellar membranes. The regulatory effect of GG on the membrane may explain its influence on the binding of G proteins. Effect of G protein lipids on membrane physical state Federica Campana, Stefano Piotto, José Castro, Pablo V. Escribá and Xavier Busquets . Submitted to Biochemical Journal Proj 1: Study on the effect of G protein lipids on membrane structure
    7. 7. The COX functions as a membrane-associated homodimer, catalyzing the committed step in the conversion of AA to prostaglandin H 2 (PGH 2 ), following AA's release from membrane phospholipds. Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new anti-inflammatory drug
    8. 8. Analysis: binding energy Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new anti-inflammatory drug
    9. 9. Analysis: docking COX-1 COX-2 Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new anti-inflammatory drug
    10. 10. Analysis: Fukui Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new anti-inflammatory drug
    11. 11. Conclusions: AAxOH has a better interaction with COX2 than AA, whereas AAxOH and AA have roughly the same interaction with COX1. The good interaction of AAxOH is mainly due to hydrogen bond network. This excellent binding induces a distortion of the carbon chain, and the position of C13, the first carbon to react, is circa 0.3 Å farer by the Tyrosine residue. This distance is responsible, presumably, for an increasing of the activation energy and therefore for the slowdown of the reaction. The map of the Fukui radical function on the total electron density indicates clearly that –OH group in alpha reduce the chance of AAxOH to react with COX. 2-hydroxy arachidonic acid, a new potential non steroidal anti-inflammatory drug. Daniel H. López, María A. Fiol, María L. Martín, María A. Noguera-Salva, Silvia Terés, Federica Campana, Stefano Piotto, José Castro, Pablo V. Escribá and Xavier Busquets . Submitted to Biochemical Journal Proj 2: 2-Hydroxy arachidonic acid, a new anti-inflammatory drug
    12. 12. BGP-15: Preservation of the chemical architecture of a cell or of an organism under stressful conditions is termed homeostasis. One of the best known mechanisms protecting cells from various stresses is the heat-shock response, which results in the induction of the synthesis of heat-shock proteins (HSPs or stress proteins). BGP-15, interacting with lipid bilayers, promotes the formation of chaperone molecules in eukaryotic cells and induces the expression of heat-shock genes.  Proj 3: BGP-15 remodeling plasma membrane rafts
    13. 13. Density profile: The permeation of BGP-15 is mildly influenced by the composition. The docking of BGP-15 is enanced by high cholesterol level. The docking of BGP-15 molecules on the membrane triggers a reorganization of cholesterol and sphingomyelin with an increase of order of BSM in the outer layer. Proj 3: BGP-15 remodeling plasma membrane rafts
    14. 14. Density profile (2): Density distribution for 12 atom types at t=0 (a) and after 5ns (b). The uptake of BGP-15 induce a swelling and an increase of disorder in the terminal carbons. (a) (b) Proj 3: BGP-15 remodeling plasma membrane rafts
    15. 15. Conclusions BGP-15 is a membrane active molecule capable to spontaneously recognize and insert SM-CHOL domains. Density profile analysis indicate SM-CHOL layer with lipid ratio 1:1 to be more capable to incorporate BGP-15 molecules (more rigid) than SM-CHOL layer with unbalanced composition. BGP-15 is also inducing more disorder in the chain ends. The last two observation are in agreement with a favorable interaction among BGP-15 and cholesterol molecules. Membrane-lipid therapy in operation: The HSP co-inducer BGP-15 activates stress signal transduction pathways by remodeling plasma membrane rafts . Imre Gombos*^, Tim Crul*^, Stefano Piotto1, Burcin Güngör*, Zsolt Török*, Gábor Balogh*, Mária Péter*, J. Peter Slotte2, Federica Campana1, Ana-Maria Pilbat*, Noémi Tóth*, Zsuzsanna Literati-Nagy*, László Vigh, Jr.*, Attila Glatz*, Mario Brameshuber3, Gerhard J. Schütz3, Andrea Hevener4, Mark A. Febbraio5 , Ibolya Horváth* and László Vígh*$ - PlosONE in press Proj 3: BGP-15 remodeling plasma membrane rafts
    16. 16. www.wix.com/piotto/GRIMD Proj 4: GRIMD: Grid for molecular dynamics
    17. 17. GRIMD is a system for distributed molecular dynamics, a new powerful and flexible protocol for distributed computing. The main advantages of GRIMD are: • Easy to install and to use even for not skilled users. • Performances scale almost linearly up to thousand machines. • Script of NAMD or YASARA can be distributed upon addition of few lines of code. Proj 4: GRIMD: Grid for molecular dynamics
    18. 18. Proj 4: GRIMD: Grid for molecular dynamics Potential energy of the drug across the bilayer: asymmetric membrane of BSM-CHOL interacting with the BGP-15.
    19. 19. Thanx for your attention
    20. 20. Flexible docking: <ul><li>The preparation of the structure of COX-1 and COX-2 followed the protocol of Furse et al [1]. </li></ul><ul><li>The crystal structure for the COX-1 (pdb entry 2OYE) and for COX-2 complexes (pdb entry 1CVU), were used to generate the initial models. </li></ul><ul><li>The COX system consisted of the homodimer, two hemes, two AA molecules, eight detergent molecules, 32,776 waters and 12 sodium counterions, for a total of 118,858 atoms. Each homodimer complex was then energy minimized using a steepest decent gradient method to relieve any residual unfavorable steric interactions introduced during the model building and solvation procedures. </li></ul><ul><li>Isothermal-isobaric ensemble MD simulations were then run for 10 ns for each complex. </li></ul><ul><li>In order to consider the flexibility of COX receptors, I have run docking experiments onto 10 structures obtained sampling every 1ns a 10 ns MD full atoms, keeping the ligands flexible. </li></ul><ul><li>[1] Furse KE, Pratt DA, Porter NA, Lybrand TP (2006) Molecular Dynamics Simulations of Arachidonic Acid-Derived Pentadienyl Radical Intermediate Complexes with COX-1 and COX-2: Insights into Oxygenation Regioand Stereoselectivity. Biochemistry 45: 3189-3205. </li></ul>
    21. 21. It is a thin coating in the form of double layer that surrounds the cell and is composed mainly of phospholipids and proteins. It presents microdomains primarily composed of sphingolipids and cholesterol. They are involved in many cellular functions such as signal transduction, membrane trafficking, neuronal development, etc. It is characterized by a marked asymmetry that reflects the different functions of the two monolayers [1]. [1] After Rothman and Lenard, 1977 . Science 194: 1744 The cell membrane:

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