Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Pengantar imunoasai

4,176 views

Published on

An introduction for Immunoassay for Indonesian students

Published in: Health & Medicine

Pengantar imunoasai

  1. 1. KULIAH PENGANTAR DASAR2 IMUNOASAI Jusak Nugraha 2015
  2. 2. PENGANTAR IMUNOASAI (SEROLOGI) DASAR  Imunologi  mempelajari reaksi tubuh terhadap masuknya Ag & efek dari Ab yang terbentuk / telah ada pd Ag tsb.  Perkembangan Imunologi membutuhkan sarana untuk mengukur derajat imunitas / [Ab] dalam tubuh.  Reverse Serologi : Bila Ab diket untuk menentukan Ag yang tak diketahui.  Uji serologi (Imunoasai).  IMUNOASAI: UJI SEROLOGI + Reverse Serologi
  3. 3. 1. Konsep Dasar Imunoasai Reaksi Ag dan Ab ; terdiri dari beberapa tahap a. Tahap awal : Ag + Ab  Ag-Ab b. Tahap Desosiasi : Ag-Ab  Ag + Ab c. Tahap keseimbangan ( equilibrium ): Ag + Ab <=> Ag- Ab Afinitas Ab thd Ag ukuran kekuatan ikatan Ag- Ab Makin besar afinitasnya, makin banyak ikatan Ag-Ab pada saat equilibrium.
  4. 4. -S-S- -S-S--S-S- Regio variabel L H L H Fc Fab Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain 2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODI
  5. 5. Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari : - profil spesifitas Ab-nya & - kemurnian Ag-nya Ab yang amat spes. = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik saja. a. Spesifitas dari Ab
  6. 6. x y z x y z Antigen I Antibodi I Antigen II v w x v w x X Y Z X Y Z V W X X Y Z Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi yang mungkin terbentuk Antibodi II
  7. 7. b. Ukuran kuantitas Ab Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum. - Kualitatif pos. /neg.  adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan. - Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif  Titer - Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku  kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol. Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.
  8. 8. Gambar 3. Kurva baku uji ELISA 0 Kadar Bahan X OD 5 g/dl
  9. 9. VALIDITAS KLINIS (NILAI DIAGNOSTIK) IMUNOASAI. SENSITIVITAS Dx = FNTP TP  Pd. Pend. Peny. TTT SPESIFISITAS Dx = FPTN TN  Pd. Bukan Pend. Peny. Tsb. EFISIENSI Dx = N TNTP   N = Pend. + Bukan Pend. NRN Dx = NRP Dx = FNTN TN  FPTP TP 
  10. 10. FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dll Elektrolit dan pH2 1 Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap a. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai b. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll) 3 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh. 4 Rasio Ag dan Ab5
  11. 11. Prozone, Tak ada presipitasi Equivalent zone, Presipitasi Post zone, Tak ada presipitasi Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya = ANTIBODI = ANTIGEN
  12. 12. BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI MACAM BAHAN : serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis Inaktivasi C  56°C, 30 menit Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.
  13. 13. IMUNOASAI KADAR BAHAN RENDAH ( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml) Hasil reaksi tak tampak FAKTOR PENGUAT (LABEL) IF RIA EIA Homogen Heterogen = ELISA Hasil reaksi DAPAT DILIHAT  RID  UJI AGLUTINASI ICA
  14. 14.  UJI PRESIPTASI  UJI AGLUTINASI  UJI FIKSASI KOMPLEMEN  UJI NETRALISASI TOKSIN I. IMUNOASAI TAK BERLABEL Ada 2 jenis imunoasai. I. IMUNOASAI TAK BERLABEL II. IMUNOASAI BERLABEL JENIS IMUNOASAI
  15. 15. Ag yang larut Antibodi PRESIPITASI Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi UJI PRESIPITASI
  16. 16. Ag. Serum dengan Ab Inkubasi Presipitasi Gambar 6. Uji presipitasi tabung
  17. 17. Serum dengan Ab Ag Aplikasi : Uji VDRL Mikro Rotasi (dengan rotator) Presipitasi (+) Tak ada Presipitasi (-) Gambar 7. Uji presipitasi lempeng (Slide)
  18. 18. 1 2 Agar Ag. dlm sumur 1 Ab. dlm sumur 2 Gambar 8 . DIFUSI GANDA SEDERHANA 1 2 Garis presipitasi Ag. dlm sumur 1 Ab. dlm sumur 2
  19. 19. GAMBAR 9. Uji ELEK
  20. 20. Antisera dalam agar GAMBAR 10. R.I.D 1 3 4 5 6 7 8 2 Sera baku Tes serum Tes serum Tes serum Tes serum Tes serum
  21. 21. APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI Uji Tabung : VDRL - Makro Uji Slide : VDRL - Mikro Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP Uji Difusi Ganda Sederhana : Uji ELEK RID : Penentuan kelas Ig
  22. 22. Ag. pada permukaan sel Ab. Aglutinasi Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi UJI AGLUTINASI Tak larut
  23. 23. + - Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide
  24. 24. Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung Serum ( Ab ) Susp. Ag Inkubasi Aglutinasi
  25. 25. AGLUTINASI TAK LANGSUNG A. AGLUTINASI PASIF B. Ab TAK LENGKAP a. Ab Monovalen b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )
  26. 26. + + Ag Larut Partikel Partikel disalut Ag Ab dalam serum Aglutinasi Gambar 14. Uji aglutinasi pasif
  27. 27. APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI  Uji Slide (lempeng): uji Widal slide  Uji Tabung : uji Widal tabung  Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung, Hanya Anti – Ig diganti C  Lisis Imun
  28. 28. Komplemen Sensitized cell Ab Ag pada permukaan sel = Komplemen Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun Uji Lisis Imun
  29. 29. Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen A. C C Tak ada Lisis Komplemen Komplemen Terikat Sensitized SDM B. C C Lisis Komplemen Komplemen Bebas Serum dgn. Ab Serum tanpa Ab Uji Positif Uji Negatif
  30. 30. A. Gambar 17. Uji Netralisasi Toksin Contoh : Uji ASO Tak hemolisisSDM Kompleks SO-ASO SO ASO SOB. Reaksi Positif Serum tanpa ASO SO SDM Reaksi Negatif Hemolisis
  31. 31. II. IMUNOASAI BERLABEL 1. CAT FLUORESENS: IF 2. RADIOISOTOP: RIA 3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA ) A. EIA HOMOGEN B. EIA HETEROGEN (ELISA) C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE 4. EMAS KOLOIDAL: ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)
  32. 32. CUCI Mikroskop Fluoresens Ab diket berlabel cat fluoresens Ag tak diket. Fiksasi pada slide Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung. 1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)
  33. 33. CuciAg diket. Ab tak diket Cuci Mikroskop Fluoresens Kompleks Ag – Ab tak tampak AHG dilabel Fluorescein Kompleks Ag – Ab – AHG berfluoresensi Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung.
  34. 34. KELEMAHAN UJI IF  Peralatan canggih dan mahal  Perlu tenaga terlatih  Per hari maks 25 slide / analis  Sukar dibuat otomatis  Pelaksanaan agak kompleks & membosankan
  35. 35. Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop R RR R R R R R R Radiation Counter 2. Uji RIA
  36. 36. PEMISAHAN Ag / Ab BERLABEL yg TERIKAT drp yg BEBAS  Paper Electrophoresis  Presipitasi  Adsorbsi  IMOBILISASI pd FASE PADAT
  37. 37. Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif R R R R R R R RADIATION COUNTER Cuci
  38. 38. KELEMAHAN UJI RIA  Butuh alat mahal & tenaga terlatih  Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )  Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.  Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus
  39. 39. BERBAGAI MACAM EIA : A. EIA yang HOMOGEN; label berbeda sifat tergantung pada keadaan reagensianya TERIKAT/TIDAK pada lawan reaksinya  TAK MEMBUTUHKAN PEMISAHAAN B. EIA yang HETEROGEN; label TAK berbeda sifat baik reagensinya dalam keadaan terikat maupun BEBAS pada lawan reaksinya  PERLU PEMISAHAAN bag. terikat dari yang bebas 3. Imunoasai Enzim (EIA)
  40. 40. SUBSTRAT BERKROMOGEN PRODUK berwarna Ab pada Fase padat Ag berlabel enzim Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif Uji ELISA Ag dlm serum
  41. 41. SUBSTRAT berkromogen PRODUK berwarna Ag Ab I pada Fase padat Ab II berlabel enzim Gambar 23. Prinsip dasar double antibody sandwich ELISA
  42. 42. Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA tak langsung Ab PRODUK berwarna SUBSTRAT berkromogen Ag pada Fase padat Anti –Ig berlabel enzim
  43. 43. 4. ICA / Uji Aliran Samping ( lateral flow test ) atau uji strip Asai Berlabel Spt IFA, RIA & EIA BEDA DENGAN IFA & RIA Tak perlu alat canggih Dibaca dg mata telanjang Amat praktis BEDA DENGAN EIA / DOT EIA Tak perlu substrat berkromogen * Waktu pemeriksaan < * Konjugat dg label colloidal gold Amat sensitif Waktu pemeriksaan <<  90 det – 15 men * Bantalan Abs Aliran reagen ke lateral > cepat
  44. 44. Jadi : ICA  Sarana lab yang  Praktis  Andal Amat dibutuhkan di negara sedang berkembang DASARNYA : Tiap legan yang dapat diikat pada partikel padat berwarna (mikrosfer)  dapat dipakai untuk uji ICA Contoh : tes kehamilan, Strepthroat, Chlamydia & ICT-TB
  45. 45. PRINSIP DASAR ICA (UJI STRIP) Dapat dipakai untuk melacak analit maupun Ab. I. ICA untuk melacak analit. Ada 2 cara pendekatan utama yaitu : • NON- KOMPETITIF (Langsung) & • KOMPETITIF / HAMBATAN KOMPETITIF
  46. 46. GAMBAR 25 Bila sampel berisi analit ikatan analit-konjugat  ikut aliran lateral  ditangkap oleh Ab ke 2 pd grs pengikat  warna. Syarat: 1. Mol. analit cukup besar (  2 epitope) 2. [analit] < [Ab pengikat] atau [Ab pelacak]
  47. 47. Sisa konjugat bergerak terus ( diisap oleh bantalan Abs)  ditangkap oleh Ab spec. spes. pada garis kontrol warna Gambar 26 = emas koloidal = Ag/analit = Ab pelacak (konjugat) = Ab pengikat (Ab ke 2) = Ab spesies spesifik pd grs kontrol Sample Flow
  48. 48. II. ICA untuk melacak antibodi Dipakai 2 prinsip dasar asai tak langsung (indirect assay) 1. Ab (serum)  Ag (capture line)  kompleks Ag-Ab   konjugat  Ag-Ab- Konj (di garis pengikat) 2. Ab  konjugat  diikat Ag pada garis pengikat (capture line)  sisa konjugat dihisap oleh absorben pad  diikat oleh antikonjugat (contol line)
  49. 49. Ab AH Glob berlabel coloidal gold Ag Antikonjugat  Gambar 28
  50. 50. Sample pad (bantalan sampel) Conjugate pad (bantalan konjugat) Capture line (garis pengikat) Mengandung Ag 1 epitop protektif 2 epitop infeksi berat Garis kontrol/control line (mengikat sisa konjugat) Absorbance pad (bantalan absorban) 1 2 1 2 Kontrol TB aktif 1 2 Kontrol 1 2 Kontrol Tertular tidak sakit Teknik salah/reagens rusak Contoh aplikasi ICT-TB.
  51. 51. Session I selesai..!!
  52. 52. PENENTUAN C-REAKTIF PROTEIN (CRP) Dr. Jusak Nugraha, dr, MS, SpPK (KGH,K-Im,KT-I) Bagian Patologi Klinik FK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya
  53. 53. APA ??? - Tergolong dalam Protein Fase Akut - Serum normal; jumlah kecil - Radang /nekrosis ; dapat sampai 1000 X INDIKASI PEMERIKSAAN. 1. Membantu menegakkan Dx kead. penyakit radang/ nekrosis 2. Mengikuti hasil Tx peny. radang akut/nekrosis.
  54. 54. Gambar 43. Sintesis dan aktivitas biologis dari CRP HEPAR IL-1, IL-6 PGE1 CRP Mengikat bakteria  presipitasi Aktivitas & motilitas fagosit  Aktivasi C ( klasik & alternatif ) Menghambat agregasi trombosit (Adrenalin ADP maupun kolagen) Mempunyai daya ikat selektif terhadap Limfosit T. COLCHICIN NEKROSIS JARINGAN
  55. 55. Gambar 44. Perubahan kadar CRP-serum setelah suatu operasi tanpa penyulit Jam setelah operasi
  56. 56. PRINSIP DASAR PENENTUAN CRP Merupakan reverse serology. Ada 2 prinsip dasar dari berbagai cara yg dipakai 1. UJI PRESIPITASI CRP  Ag yang akan ditentukan, dg anti – CRP yang diketahui. 2. UJI AGLUTINASI PASIF Merupakan reverse passive agglutination test
  57. 57. Anti – CRP pada partikel CRP dalam serum AGLUTINASI Gambar 45. Prinsip dasar REVERSE PASSIVE AGGLUTINATION TEST
  58. 58. CARA PEMERIKSAAN. 1. CARA PRESIPITASI KAPILER Tinggi presipitat diukur dalam mm; 1 mm = + , 2 mm=++. 2. CARA AGLUTINASI LATEKS Pos.  0,5 mg/dl. Neg  encerkan 1:10 3. R.I.D : Ukur diameter cincin presipitasi. Tentukan kadar CRP dg kurva baku. HARGA NORMAL : RIA 1,3 mg/1 ( 0,068-8,2 mg/1 ) 4. Nephelometris : Amat sensitif. (Tes hs-. CRP)
  59. 59. Positi f Negati fGambar 47. Uji aglutinasi slide / lempeng
  60. 60. NILAI KLINIS/FISIOPATOLOGIS. Liniaritas & aselaritasnya amat baik . PENGGUNAAN KLINIS. 1. Uji penyaring peny. organik ; pada radang / nekrosis CRP  2. Penentuan aktivitas peny. radang ; punya kelebihan daripada indikator nonspesifik lain ( LED, pyrexia dll ). 3. Membantu Dx & evaluasi hasil Tx dr peny. infeksi. ( Septikemis pada anak, SLE disertai infeksi )
  61. 61. Session II Selesai..!!
  62. 62. PENENTUAN FAKTOR RHEMATOID ( RHEUMATOID FACTOR ) UJI ROSE – WAALER DAN MODIFIKASINYA Dr. Jusak Nugraha, dr, MS SpPK (KGH, K-Im,KT-I) Bagian Patologi Klinik FK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya
  63. 63. Apa ??? Faktor rhematoid ( RF )= otoantibodi (Ig M, Ig G, Ig A ) yang ditujukan thd Ig G (anti-Ig G) & terbentuk dalam stadia agak lanjut dari penyakit artritis rhematoid ( RA ) UJI ROSE-WAALER / AGLUT. LATEKS. Hanya Ig M anti-Ig G yg dapat ditentukan. INDIKASI PEMERIKSAAN. Membantu menegakkan Dx & menentukan prognosis penyakit RA
  64. 64. Ag X ( EBV )  SENDI SEL-2 IMUNOKOMPETEN Limfosit -- B T- Suppressor ( terganggu ) T-Helper Sel Plasma RF ( Anti-Ig G ) Ig M, Ig G & Ig A Anti X – Ab (terut. Ig G) IMUNOPATOGENESIS ARTRITIS REMATOID Gangguan glikosilasi
  65. 65. + + Ag Larut Partikel Partikel disalut Ag Ab dalam serum Aglutinasi Gambar 48. Aglutinasi
  66. 66. UJI ROSE-WAALER. SERUM * Waterbath 50°C, ½ jam Encerkan secara serial ( 1/32 – 1/1792 ) Tambahkan susp SDM ( 5 % ) yg sensitized INKUBASI 4°C 18 jam Baca adanya aglutinasi (HN 1:32) * Untuk hilangkan aglutinin nonspesifik (Ab heterofil), serum & SDM domba yang dipadatkan ( 4 : 1 ), inkubasi 40 men, 2 kali.
  67. 67. Gambar 49. Uji Rose-
  68. 68. Gambar 50. Uji Rose-Waaler. Untuk memastikan hasil positif atau negatif
  69. 69. NILAI KLINIS/FISIOPATOLOGIS . Tidak begitu baik. Faktor2 yang perlu diperhatikan 1. Pos pada 70 – 80 % pend RA ( 6 – 12 bl ) 2. Pos. stad dini/titer amat tinggi  prog. jelek 3. 20 – 30% kasus RA tes tetap neg  prog. baik 4. Korelasi pos. dg nod subcutan, arthritis pergelangan tangan asimetris dg deformitas & manifestasi viseral RA
  70. 70. 5. Hasil pos terdapat juga pada : a. SLE ( 30 – 50 % ) b. Scleroderma ( 30% ) c. Sjörgen’s syndrome ( 75% ) d. Endocarditis lenta e. Hepatitis menahun & agresif f. Beberapa peny. virus (Herpes zoster, influenza A, Viral hepatitis) g. Orang normal : 4 - 6% 6. Peny. Sendi dg hasil tes yg negatif : Gout, Artrosis, Demam rhematik, Ankylosing spondylitis, Reiter’s disease & psoriatic arthritis
  71. 71. Session V selesai…!!
  72. 72. PENENTUAN ANTISTREPTOLISIN O (ASO) Dr. JusakNugraha, dr, MS, SpPK (KGH,KIm,KT-I) Bagian Patologi Klinik FK UNAIR / RSUD Dr. Soetomo, Surabaya
  73. 73. ASO ???  Ab thd enzim proteolitik SO. SO ???  Produk ekstra-seluler dr - hemolitik streptococcus group A,C humanus & G dari Lancefield Aktivitas biologik ; merusak dinding SDM INDIKASI PEMERIKSAAN. 1. Bantu menegakkan Dx demam rhematik & glomerulonephritis akut. 2. Meramalkan, relapse pada demam rhematik
  74. 74. Streptolisin O, S Streptokinase Hyaluronidase Diphosphopyridine nucleotidase Desoxyribonuclease A, B, C, a b c d Gambar 56. Struktur antigen  -hemolitik streptococcus group A dari Lancefield. a = kapsul, b= komponen permukaan dari dinding sel (CSMA) , c= dinding sel, d= komponen intraseluler.
  75. 75.  -hemolitik streptococcus group A CSMA SO SS STREPTOKINASE Hyaluronidase DNAse SEL - SEL IMUNOKOMPETEN Anti CSMA ASO (Spesifik) ASS (tak spesifik) REAKSI SILANG DG ENDOCARD & GBM DEMAM RHEMATIK ANTIBODI
  76. 76. A. Tak ada hemolisisSDM Kompleks SO- ASO SO ASO SOB. Reaksi Positif Serum tanpa ASO SO SDM Reaksi Negatif Hemolisis Gambar 57. Prinsip dasar uji Antistreptolisin O
  77. 77. Gambar 58. Prinsip dasar uji aglutinasi lateks ASO AGLUTINASI (POSITIF) SO, JUMLAH TERTENTU ASO SO pd LATEKS Serum pend. (ASO > 200 iu)
  78. 78. HARGA NORMAL : Batas atas ; 200 iu/ml. Pd 20 % orang normal>200 iu/ml Dipengaruhi usia & geografi/iklim. - Bayi baru lahir ; > tinggi daripada Ibunya   dengan tajam dalam beberapa minggu - Usia sekolah ; titer mulai sp titer usia dewasa - Usia lanjut ; titer lagi. - Titer normal  bila makin dekat katulistiwa
  79. 79. NILAI KLINIS/ FISIOPATOLOGIS . - Kurang baik ; 20 % orang normal  ASO  200 iu - Periksa 1X  tak punya arti DX yang penting. - ASO pos  ada/pernah infeksi dengan Streptococcus, dan tak berarti penderita suatu peny. tertentu ( demam rhematik ). - Penyakit-2 hepar, ginjal & hyperlipidemia  pos. semu o.k. inhibator nonspesifik  absorbsi/LAT
  80. 80. TERIMA KASIH ATAS PERHATIAN ANDA

×