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Ingenieria genetica

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Ingenieria genetica

  1. 1. INGENIERIA GENETICA
  2. 2. 1.-INTRODUCCIÓNLa utilización de organismos vivos o de sus componentes en laobtención de productos útiles para las personas es la base de labiotecnología .Tradicionalmente se utilizaba la fermentación demicroorganismos para obtener productos como el yogur, el pan o elvinoEl paso de la biología tradicional a la moderna surge con lastécnicas que derivan de la ingeniería genética como la tecnologíadel ADN recombinanteLa ingeniería genética puede definirse como un conjunto detécnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipularel genoma de un ser vivo.La ingeniería genética es una técnica que consiste en lamanipulación, modificación e introducción de genes en el genomade un individuo que carece de ellos.
  3. 3. Los organismos que han sido modificados por ingeniería genética sedenominan transgénicosLa ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas,entre las que destacan:1.-la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislary manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirloen otro.Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de"cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADNrecombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADNextraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADNvírico en un ADN celular. 2.- Clonación Permite la producción de múltiples copias de un genespecífico o de un fragmento de ADN
  4. 4. 3.-La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen. 4.- la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio..
  5. 5. El conocimiento del genoma de muchos organismos ha provocado laaparición de nuevas disciplina científicas:-genómica: rama de la genética que estudia el genoma completo deun organismo-Proteómica: Estudia, desde el punto de vista estructural y funcional,todas las proteínas codificadas por un genoma concreto-Farmacogenética: Persigue la fabricación de medicamentospersonalizados
  6. 6. 2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINNANTE Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee : .Este ADN puede incorporarse a las células deotros organismos (vegetales, animales,bacterias...) en los que se podrá "expresar" lainformación de dichos genes. (De una maneramuy simple podemos decir que "cortamos"un gen humano y se lo "pegamos" al ADN deuna bacteria; si por ejemplo es el gen queregula la fabricación de insulina, lo queharíamos al ponérselo a una bacteria es"obligar" a ésta a que fabrique la insulina).
  7. 7. Lo primero que hay que realizar es un corte específico del ADNen fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización deun tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción quepueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimasse aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres,siendo lo característico de ellas estos dos principios:
  8. 8. a) Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específicade nucleótidos(4-8 nucleótidos denominado sitio de restricción) ycorta en ese punto cada una de las cadenas de ADN b) Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción
  9. 9. Estas uniones entre los bordes cohesivos son temporales , pero sepueden hacer permanentes en presencia de la enzima ADN ligasaLa unión del ADN procedente de dos orígenes distintos produceuna molécula de ADN recombinanteLos fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintasenzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir,según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante latécnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.
  10. 10. El segundo paso es la inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonación, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras. Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN capaces de transportar ADN extraño , que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.Además del origen dereplicación, los vectores declonación deben llevar otrosgenes denominados marcadores,que sirven para identificar lascélulas que contienen el vectorde clonación.
  11. 11. Se suelen utilizar como marcadores, Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificarbacterias que contienen el vector de clonación, porque estasbacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga elgen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya queel marcador que se le incorpora determina que se exprese esacaracterística. Este sistema se emplea cuando la célulahospedadora es una célula eucariota.
  12. 12. Los vectores de clonación más utilizadosa) Plásmidos. Son moléculas de ADN circular bacteriano, conun tamaño menor que el del cromosoma. Se replican conindependencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propioorigen de replicación.La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con elvector de clonación, se realiza por medio ADN-ligasas, que unenambos trozos de ADN
  13. 13. .b) Virus bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar elgen deseado en un fragmento de ADN vírico Posteriormente seensamblarán las distintas partes del virus Así quedará el viruscompleto. En el siguiente paso se insertará este ADN por el procesode la TRANSDUCCION: proceso en el cual los bacteriófagostransportan genes bacterianos desde una célula huésped a otraSon capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plásmido
  14. 14. c) Cósmidos: son vectores híbridos entre el fago λ y un plásmido , de modo que su ADN puede replicarse como un plásmido o empaquetarse como un fagoD) Otros vectores: Cromosomas artificiales de levaduras, genomasmodificados de adenovirus, retrovirus, cromosomas humanosartificiales.
  15. 15. El siguiente paso será introducir el vector de clonación quecontiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora,para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleveel gen concreto.Existen varios métodos que dependerán del tipo de célulafundamentalmente.En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:a) Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos debacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célulabacteriana a tratamientos físicos y químicos.La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medioexterno, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.
  16. 16. b) Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en lacélula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector declonación el genoma del virus.Para poder realizar la clonación génica, el huésped debe ser:- De crecimiento rápido y en un medio de cultivo barato- No ser dañino ni patógeno- Ser capaz de aceptar ADN exógeno- Tener las enzimas necesarias para la replicación del vectorLos huéspedes más utilizados son las bacterias Escherichia coli(Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisae
  17. 17. . Una vez que se ha conseguido la población de bacteriastransformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en unmedio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez quese reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el genque interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células quellevan todas ese gen de interés.Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interéspara el hombre. Este conjunto de clones se denomina bibliotecagenómica
  18. 18. 3.- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de vecesun fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnicapueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de unamolécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas.La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muypequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, unafuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúancomo cebadores.La reacción es un proceso cíclico: a) La molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.
  19. 19. b) Se enfría la mezcla para permitir que los cebadores se unan a cada unode los extremos de las hebras del ADNc) Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utilizala ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales,Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado
  20. 20. APLICACIONES DE LA PCR Secuenciación Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formación de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho mas sencillo y rápido que la clonación en células.Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.
  21. 21. Huellas dactilares del ADN. Mediante esta técnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de paternidad.Diagnósticos prenatales: Utilizando ADN de célulasembrionarias
  22. 22. 4.- SECUENCIACION DEL ADNSe realiza con el método didesoxi de Sanger o Método determinación de la cadenaSe denomina así porque es necesaria la utilización de losdidesoxirribonucleótidos que son nucleótidos modificados quehan perdido el grupo OH situado en el carbono 3’y que provocanla parada de la copia del ADN por la ADN polimerasa Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:
  23. 23. El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar.Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADNPolimerasa I del bacteriofago T4.Un cebador o "primer"Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). APor último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP,ddCTP y ddGTP) marcados con una molécula fluorescente paracada uno de ellosEl método básicamente consiste en:1º Se desnaturaliza el ADN que se desea secuenciar2º Se mezclan todos los componentes de la reacción y se formannuevas cadenas de ADN que utilizan como molde la secuenciadel ADN que se quiere secuenciar . La copia continua hasta quepor azar se encuentra con un didesoxi. Al final se obtiene unamezcla de cadenas de ADN de longitudes variadas
  24. 24. 3.- Se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa ungel de poliacrilamina, de tal manera que las más cortas se muevencon mayor rapidez4.- Se obtiene un espectrograma que nos dará la secuencia de basescomplementaria de la molde
  25. 25. 5.- APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIAGENETICA1.-OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc ... tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales. En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana.
  26. 26. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente.DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO: Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo está presente en un determinado individuo.
  27. 27. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES.(TERAPIA GÉNICA) Este proceso abre las puertas para luchar contra enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes de que aparezcan los primeros síntomasLa terapia génica se define como técnica terapéutica mediante lacual se inserta un gen funcional en las células de un pacientehumano para corregir un defecto genético o para dotar a lascélulas de una nueva función
  28. 28. 6.- APLICACIONES EN LA AGRICULTURAMediante la ingeniería genética han podido modificarse lascaracterísticas de gran cantidad de plantas para hacerlas másútiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Lasprimeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron untipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunassemanas después de haber sido cosechados.Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular,lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (losprotoplastos son células desprovistas de pared celular, que seconsigue empleando enzimas que destruyen la lámina media ydesorganizan la parte de celulosa).PLANTAS TRANSGÉNICASEntre los principales caracteres que se han transferido avegetales, merecen destacarse:
  29. 29. •Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades microbianas. Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas transgénicas con el gen de la proteina de la cápsida de un virus, son resistentes a la invasión de dicho virus.•Incremento del rendimiento fotosintético Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C4 que es más eficiente.•Mejora en la calidad de los productos agrícolas Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen aceites modificados, que no contienen los caracteres indeseables de las plantas comunes.
  30. 30. •Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables•Asimilación de nitrógeno atmosférico Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados, aumentando la síntesis de proteinas de modo espectacular.
  31. 31. 7.-APLICACIONES EN ANIMALESLa transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extrañoen un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditariay afecte a todas las células en los organismos multicelulares.Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, seintroduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADNextraño en su genoma, previamente a la primera división , produciránun organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a lassiguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos).Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: •La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación. •Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. •Estudiar la función de genes específicos.
  32. 32. •Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteinas humanas. •La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.El principio de la clonación está en la obtención de organismosidénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente,como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueño de muchosganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidadesde algún ejemplar especialmente bueno.Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:Por disgregación de células embrionarias .Se basa en el mismoprincipio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separarlas células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde elestado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separadapuede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar unindividuo completo.
  33. 33. Por TRANSFERENCIANUCLEAR. Se tomancélulas embrionarias en fasede mórula o blástula,obtenidas por disgregación,se cultivan in vitro,ydespués se transfieren aovocitos a los que se les haquitado el núcleo.Se provoca la fusión de lasdos células animales demodo que el núcleo de lacélula embrionaria quede enel interior del ovocito,pudiendo éste empezar afuncionar como un zigoto.
  34. 34. 8.-APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN ELMEDIO AMBIENTEMicroorganismos modificados genéticamente están siendo utilizadospara limpiar el medio ambiente de ciertos contaminantes , ya quetienen la capacidad de transformarlos en sustancias no contaminanteso de adsorberlos. Su acción se realiza de dos maneras-Biorremediación : bacterias transgénicas que degradan la materiaorgánica como los hidrocarburos con un gran rendimiento y endiversas condiciones-Bioadsorción: Bacterias genéticamente modificadas son capaces deadsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo
  35. 35. 8.-PROYECTO GENOMA HUMANOEl Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en los EstadosUnidos con un presupuesto de 375.000 millones de pesetas y un plazode 15 años, con el objetivo de analizar molecularmente la herenciagenética humana.Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos.Implica dividir los cromosomas en pequeños fragmentos que puedanser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma.Este proyecto supone la realización de dos tipos de mapas: •Mapas genéticos: Estos mapas simplemente indican la posición relativa de los diferentes genes. Para esta confección se están estudiando la transmisión de caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una generación a otra en grandes familias. En 1994 se terminó el primer mapa genético de todo el genoma humano.
  36. 36. •Mapas físicos: De mayor resolución, pues muestra la secuencia denucleótidos en la molécula de ADN que constituye el cromosoma. Seobtiene la secuencia de nucleótidos de un gen. Se realizafundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintosfragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores.El completar este mapa se ha conseguido cinco años antes de lo quese esperabaCARACTERÍSTICAS PRINCIPALE DEL GENOMA HUMANO-Sólo 20000 a 25000 genes codifican proteínas, mucho menos de loque se esperaba-Los seres humanos son idénticos en un 99,9% y nos diferenciamosen apenas unos tres millones de nucleótidos
  37. 37. -La mayor parte de estas diferencias se encuentran localizadas en los llamados polimorfismos de un único nucleótido que son variaciones que afectan a un solo par de bases. La mayor parte del genoma no es codificante y se le denomina ADN basura que parecía que no tenía ninguna función los últimos estudios los relaciona con funciones de regulación de la expresión de los genesLa genómica estudia ese genoma y sus objetivos principales son:d) Identificar los genes codificadores de proteínase) Estudiar las interacciones de los genes entre sí

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