Enzyme-catalyzed kinetic resolution of racemic tramadol and its analogues industrial applicability

Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltung von
Tramadol-Analoga und deren industrielle Anwendbarkeit

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Rheinisch-
Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Chemiker

Carsten Griebel

aus
Niebüll

Berichter: Universitätsprofessor Dr. H.-J. Gais
Universitätsprofessor Dr. D. Enders

Tag der mündlichen Prüfung: 13. Dezember 2002

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum vom 01.04.1998 bis zum 28.02.2002 am
Institut für Organische Chemie der Rheinisch Westfälischen Technischen
Hochschule Aachen unter Anleitung von Prof. Dr. H.-J. Gais angefertigt.

„Wenn wir wüßten, was wir tun,
würden wir das nicht Forschung nennen.“

(Albert Einstein)

Danksagung

Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie
der RWTH Aachen bedanken. Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H.-J. Gais für die
engagierte Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit, die interessanten und anregenden
Diskussionen sowie für die Bereitstellung der ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Allen
Arbeitskreismitgliedern danke ich für die angenehme und freundschaftliche
Arbeitsatmosphäre, die stete Diskussionsbereitschaft sowie für die gute Zusammenarbeit.
Für die hilfreichen Anregungen bei der Fertigstellung der vorliegenden Arbeit danke ich
Herrn Dipl.-Chem. Stefan Koep.

Bei Frau Ing. Cornelia Vermeeren möchte ich mich besonders für die Lösung einer Vielzahl
von Trennproblemen und für ihre stete Hilfsbereitschaft bedanken. Besonderer Dank gebührt
auch Frau Magdalena Grosch und Frau Ursula Ripkens für die durchgeführten HPLC-
Trennungen.

Für die Ausführung von analytischen Aufgaben möchte ich mich bei Frau Dittrich, Frau
Glensk, Frau Kuyper, Frau Müller, und Herrn Dr. Runsink bedanken und für die Abwicklung
organisatorischer Aufgaben bei Frau Bertrand, Frau Renardy, Herrn Dr. Bettray und Herrn
Dr. Geibel.

Meiner Forschungspraktikantin Frau Dipl.-Chem. Martina Mennicken danke ich für ihre
präparative Unterstützung und engagierte Mitarbeit.

Ein großer Dank gebührt auch den Mitarbeitern der Grünenthal GmbH, die mich hilfsbereit
unterstützt haben. Im besonderen möchte ich Herrn Dr. Helmut Buschmann für seine
engagierte Unterstützung dieser Arbeit danken, ebenso Herrn Heinz-Günter Döteberg, Herrn
Dr. Michael Finkam, Herrn Dr. Bernd Sundermann, Herrn Dr. Oswald Zimmer und nicht
zuletzt denjenigen Mitarbeitern, die es ermöglicht haben, daß mir die benötigten Substanzen
zur Verfügung gestellt werden konnten.

Ganz besonders möchte ich mich herzlich bei meiner Familie und meinen Freunden
bedanken, die mich während meiner Promotionszeit unterstützt haben.

Teile dieser Arbeit wurden auszugsweise publiziert in:

Enzymatic resolution of analgesics: δ-hydroxytramadol, ε-hydroxytramadol and
O-desmethyltramadol. H.-J. Gais, C. Griebel, H. Buschmann, Tetrahedron:
Asymmetry 2000, 11, 917-928.

Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung von Aminomethyl-Aryl-
Cyclohexanol-Derivaten. H. Buschmann, D. Kaulartz, C. Griebel, H.-J. Gais,
DE 10004926 A1, 04.02.2000 und WO 01/57232 A1, 09.08.2001; Chem. Abstr.
2001, 135, 179820.

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII

1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1
1.1 Opioide Analgetika 3
1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga 7
1.3 Zielsetzung 11

2 THEORETISCHER TEIL 13
2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-Katalysator Präparation 13
2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga 16
2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen 24
2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse 26
2.3.1 Kinetische Racematspaltungen 26
2.3.1.1 Der E-Wert 29
2.3.2 Auswahl geeigneter Enzyme und Reaktionsmedien 35
2.3.2.1 Auswahl der verwendeten Substrate und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Hydrolyse 38
2.3.2.2 Auswahl der verwendeten Acyldonoren und Reaktionsbedingungen in der
enzymatischen Transacylierung 39
2.4 Enzym-katalysierte kinetische Racematspaltungen von Tramadol-Analoga 42
2.4.1 Substrate auf Basis aromatischer Hydroxylfunktionen 42
2.4.1.1 Enzym-katalysierte Hydrolysen des (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylesters (rac-15) 49
2.4.1.2 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylamino-
methyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 59
2.4.1.3 Enzym-katalysierte Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 63
2.4.1.4 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-
1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 73
2.4.1.5 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-
amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) 75
2.4.2 Substrate auf Basis sekundärer Hydroxylfunktionen 77
2.4.2.1 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
methyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 82
2.4.2.2 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 93
2.4.2.3 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 104

VERZEICHNISSE II

2.4.2.4 Versuche zur enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-
6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 108
2.4.2.5 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 113
2.4.2.6 Enzym-katalysierte Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethyl-
aminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-22) 120
2.4.2.7 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-
2.4.2.8 Darstellung von (+)-14 durch enzymatische Racematspaltung im präparativen
Maßstab 140
2.4.2.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-
2.4.3 Substrate auf der Basis tertiärer Hydroxylfunktionen 154
2.4.3.1 Versuche zur Enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 155
2.5 Zusammenfassung 158
2.6 Ausblick 163

3 EXPERIMENTELLER TEIL 164
3.1 Allgemeine Vorbemerkungen 165
3.1.1 Eingesetzte Computerprogramme 165
3.1.2 Analytische Methoden und Geräte 165
3.1.3 Lösungsmittel und Reagenzien 170
3.1.4 Verwendete Proteine 170
3.1.5 Besondere Arbeitstechniken 173
3.2 Darstellung und Analytik der MPEG/PLE Präparationen 174
3.2.1 Darstellung von MPEG/PLE 174
3.2.2 Standardtest zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE 174
3.3 Darstellung der Substrate zur enzymatischen Racematspaltung 176
3.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 176
3.3.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Freisetzung der racemischen Basen (AAV 1) 176
3.3.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von Phenolen
(AAV 2) 176
3.3.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung der Carbonsäureester von
Hydroxysubstituierten-Tramadolen (AAV 3) 177
3.3.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Darstellung von Hydrochloriden aus den
racemischen Basen (AAV 4) 177
3.3.2 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung 178
3.3.2.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexanol (rac-7) 178

III VERZEICHNISSE

3.3.2.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-1-hydroxy-cyclohexyl)-
phenol (rac-8) 179
3.3.2.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-
phenol (rac-11) 180
3.3.2.4 Darstellung von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
cyclohexan-1,3-diol (rac-12) 181
3.3.2.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
3.3.2.6 Darstellung von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
3.3.3 Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse 185
3.3.3.1 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 185
3.3.3.2 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-1-hydroxy-
cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 186
3.3.3.3 Darstellung von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-
1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 187
3.3.3.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18) 189
3.3.3.5 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3.3.3.6 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-3-(6-Dimethylaminomethyl-1,3-dihydroxy-
cyclohexyl)-phenol (rac-20) 191
3.3.3.7 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl-
1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 193
3.3.3.8 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
3.3.3.9 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
3.3.3.10 Darstellung von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
3.3.3.11 Darstellung von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-
methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 198
3.3.4 Darstellung der racemischen Ester zur Bestimmung des Umsatzes in der
enzymatischen Transacylierung 199
3.3.4.2 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-

VERZEICHNISSE IV

3.3.4.4 Darstellung von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Propionsäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
3.3.5 Versuche zur Darstellung von (±)-(1RS,5RS,8RS)-8-Dimethylaminomethyl-1-
(3-methoxy-phenyl)-2,4-dioxa-bicyclo-[3.3.1]-nonan-3-on (rac-48) 204
3.3.5.1 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit Bis-(trichlormethyl)-carbonat 204
3.3.5.2 Versuch zur Darstellung von rac-48 durch Acylierung mit 1,1´-Carbonyldiimidazol 205
3.4 Überprüfung der Hydrolysestabilität der Estersubstrate 207
3.4.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Überprüfung der Hydrolysestabilität der racemischen
Substrat Ester (AAV 5) 207
3.4.2 Hydrolysestabilität des Esters rac-15 207
3.4.3 Hydrolysestabilität der Ester rac-17, rac-18, rac-19, rac-21, rac-22 und rac-25 207
3.5 Bestimmung von Umsätzen und Enantiomerenverhältnissen 210
3.6 Enzym-katalysierte Racematspaltungen im wäßrigen und organischen
Medium 214
3.6.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften 214
3.6.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrigen Einphasen
System (AAV 6) 214
3.6.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Hydrolyse im wäßrig-organischen
Zweiphasen System (AAV 7) 214
3.6.1.3 Allgemeine Arbeitsvorschrift zur enzymatischen Transacylierung in organischen
Lösungsmitteln (AAV 8) 215
3.6.2 Berechnung des E-Werts 216
3.6.3 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15) 217
3.6.3.1 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem unter
Zusatz von Aceton als Cosolvens 217
3.6.3.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 217
3.6.3.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem zur
Darstellung von (+)-15 218
3.6.3.4 Versuch zur AChE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 219
3.6.3.5 CAL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 219
3.6.3.6 Mucor miehei Lipase-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen
Einphasensystem 220
3.6.3.7 HLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 220
3.6.3.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221

V VERZEICHNISSE

3.6.3.9 PPL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 221
3.6.3.10 BCL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem 222
3.6.3.11 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrigen Einphasensystem mit
roher CRL 222
3.6.3.12 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-15 im wäßrig-organischen Zweiphasen-
system mit roher CRL 223
system mit aufgereinigter CRL 224
3.6.4 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16) 224
3.6.4.1 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem mir
roher CRL 224
3.6.4.2 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei
pH 7.0 225
3.6.4.3 PLE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-16 im wäßrigen Einphasensystem bei
pH 8.0 225
3.6.5 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS)-3-(2-Dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-8) 226
3.6.5.1 Versuche zur enzymatischen Transacylierung des Phenols rac-8 unter Verwendung
verschiedener Lipasen 226
3.6.5.2 Versuch zur PPL-katalysierten Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 227
3.6.5.3 BCL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 228
3.6.5.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylacetat 229
3.6.5.5 CRL-katalysierte Transacylierungen des Phenols rac-8 mit Vinylbutyrat 230
3.6.5.6 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Phenols rac-8 230
3.6.6 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,2RS)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-
1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17) 231
3.6.6.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-17 im wäßrigen Einphasensystem mit
roher CRL 232
3.6.7 Versuche zur Enzymatischen Transacylierung von (±)-(1RS,2RS)-3-(3-Dimethyl-
amino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-propyl)-phenol (rac-11) unter Verwendung
verschiedener Lipasen 232
3.6.8 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,3RS,4RS)-Buttersäure-4-dimethylamino-
3.6.8.2 CRL-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasensystem 234
system 235
system mit extraktiver Aufarbeitung 236

VERZEICHNISSE VI

3.6.8.5 Versuch zur Novozym 435-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen
Einphasensystem 237
3.6.8.6 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-18 im wäßrigen Einphasen-
system 237
3.6.9 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,3SR,6RS)-6-Dimethylaminomethyl-
3.6.9.1 Versuche zur BCL-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 mit
Isopropenylacetat 238
3.6.9.2 BCL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 238
3.6.9.3 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Vinylpropionat 239
3.6.9.4 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-12 mit Isopropenylacetat 241
3.6.9.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 242
3.6.9.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-12 243
3.6.10 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19) 244
3.6.10.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 unter Verwendung
verschiedener Lipasen im wäßrigen Einphasensystem 244
3.6.10.2 Versuch zur CRL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrig-organischen
Zweiphasensystem 245
3.6.10.3 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-19 im wäßrigen Einphasen-
system 246
3.6.11 Versuche zur Enzymatischen Transacylierungen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-6-Dimethyl-
aminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,3-diol (rac-13) 246
3.6.11.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter
Verwendung verschiedener Lipasen 246
3.6.11.2 Versuche zur Novozym 435-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 247
3.6.11.3 Versuche zur Enzym-katalysierten Transacylierung von Alkohol rac-13 unter Zusatz
von Triethylamin 248
3.6.12 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1RS,3RS,6RS)-Buttersäure-3-(6-dimethylamino-
methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21) 249
3.6.12.1 CE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-21 im wäßrigen Einphasensystem 249
system 250
3.6.13 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Buttersäure-3-dimethylamino-
3.6.13.1 Versuch zur BCL-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen
Einphasensystem 251
3.6.13.2 Novozym 435-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system 252

VII VERZEICHNISSE

3.6.13.3 Chirazyme L-2-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system 252
system 253
3.6.13.6 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem 254
3.6.13.7 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasensystem mit
extraktiver Aufarbeitung 255

3.6.13.8 CE-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22⋅HCl im wäßrigen Einphasensystem 256

3.6.13.10 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-22 im wäßrigen Einphasen-
system unter Zusatz von Aceton als Cosolvens 257
3.6.13.11 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Hydrochlorids von Ester rac-22

(rac-22⋅HCl) im wäßrigen Einphasensystem 258

3.6.14 Enzymatische Hydrolysen von (±)-(1SR,2RS,4RS)-Hexansäure-3-dimethylamino-
3.6.14.1 Chirazyme E1-katalysierte Hydrolyse des Esters rac-23 im wäßrigen Einphasen-
system mit Aufarbeitung durch kontinuierliche Extraktion 261
3.6.15 Enzymatische Transacylierungen von (±)-(1RS,2RS,4SR)-2-Dimethylaminomethyl-
3.6.15.1 CRL-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 262
3.6.15.2 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylacetat 263
3.6.15.3 Novozym 435-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 mit Vinylpropionat 264
3.6.15.4 Novozym 435-katalysierte Transacylierung des Alkohols rac-14 mit Isopropenylacetat 267
3.6.15.5 Versuche zur PLE/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 267
3.6.15.6 Versuche zur PLE/BSA/MPEG-katalysierten Transacylierung des Alkohols rac-14 268
3.6.15.7 Versuch zur Chirazyme E1-katalysierte Transacylierungen des Alkohols rac-14 268
3.6.16 Versuche zur enzymatischen Hydrolyse von (±)-(1RS,3RS,4RS)-Buttersäure-
3-butyryloxy-4-dimethylaminomethyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-25) 269
3.6.16.1 Versuche zur Enzym-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 im wäßrigen
Einphasensystem 269
3.6.16.2 Versuch zur PLE-katalysierten Hydrolyse des Esters rac-25 269
3.7 Anhang zum experimentellen Teil 271
3.7.1 Programm zur Bestimmung der Esteraseaktivität von PLE durch Verseifung von
Buttersäureethylester 271

4 LITERATUR 272

VERZEICHNISSE VIII

Abkürzungsverzeichnis
AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift
Abb. Abbildung
AChE Acetylcholinesterase
abs. absolut
APT attached proton test
Äq. Äquivalent
BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin)
BCL Burkholderia cepacia Lipase
c Umsatz (conversion)
d Duplett
d Tag
dest. Wasser vollentmineralisiertes Wasser
CAL-B Candida antarctica Lipase, Typ B
CE Cholesterolesterase
CRL Candida rugosa Lipase
CVL Chromobacterium viscosum Lipase
Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
DCM Dichlormethan
DiBAl-H Diisobutylaluminiumhydrid
E-Wert Selektivitätsparameter nach Chen und Sih
(Enantiomeric Ratio)
ee Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess)
EE Essigsäureethylester
Et Ethyl
EtOH Ethanol
GC Gaschromatographie
ges. gesättigt
h Stunde
HLE Pferdeleber-Esterase (horse liver esterase)
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
HV Hochvakuum
J Kopplungskonstante

IX VERZEICHNISSE

KOtBu Kalium-tert-butylat
log P-Wert Logarithmus des Verteilungskoeffizienten eines
Lösungsmittels zwischen Oktanol und Wasser
m Multiplett
MeOH Methanol
Min. Minuten
MPEG Polyethylenglykolmonomethylether
MPEG/PLE Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase und Poly-
ethylenglykolmonomethylether
MTBE tert-Butyl-methylether
MW Molekulargewicht
n. b. nicht bestimmt
NMR Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear
magnetic resonance)
PLE Schweineleber-Esterase (porcine liver esterase)
PLE/BSA/MPEG Colyophilisat aus Schweineleber-Esterase, Poly-
ethylenglykolmonomethylether und Rinderserum-
Albumin
PPL Schweinepankreaslipase (porcine pancreatic lipase)
ppm parts per million
Pr Propyl
PrOH Propanol
Rf Retentionsfaktor (ratio of fronts)
Rfl. Rückfluß
RT Raumtemperatur
s Singulett
Smp. Schmelzpunkt
TEA Triethylamin
TMS Tetramethylsilan
t Triplett
tR Retentionszeit
U Aktivitätseinheit (Units)
wfr. Wasserfrei

1 Einleitung und Zielsetzung

Enzymatische Transformationen gehören mittlerweile zu den Grundoperationen der
präparativen organischen Chemie. Es sind bis heute zahlreiche industrielle Prozesse
mit enzymatischen Schlüsselschritten etabliert, die weit über die enzymatische
Racematspaltung von Aminosäurederivaten hinausgehen.1,2 Die Vorteile von
Biokatalysatoren liegen vor allem in den milden Reaktionsbedingungen, dem damit
verbundenen geringeren Sicherheitsrisiko3 und der geringen Neigung zur Bildung
von Nebenprodukten, da sie Prozesse mit hoher Chemo-, Regio- und
Stereoselektivität katalysieren.

Enzyme aus der Klasse der Hydrolasen (Lipasen, Proteasen u. a.) sind für
technische Anwendungen besonders interessant, da sie in großer Zahl kommerziell
erhältlich sind4, zur Entfaltung ihrer katalytischen Aktivität keine teuren und eventuell
zu regenerierenden Cofaktoren benötigen und ein breites Substratspektrum
akzeptieren.5,6,7,8 Lipasen werden zur Modifizierung von Fetten, zur Synthese von
Estern und zur kinetischen Racematspaltung eingesetzt.9,10,11 Hierbei ist die
Stabilisierung und effektive Immobilisierung der Enzyme zur Erhöhung der
Betriebsstabilität, zur leichten Abtrennung und zur Wiederverwendung bei der
absatzweisen Reaktionsführung von besonderer Bedeutung.9 Als aktuelle Methoden
zur Stabilisierung von Enzymen sind vor allem die von der Firma ALTUS entwickelte
Quervernetzung von Enzymkristallen (CLECs)12,13 und das von REETZ et al.
entwickelte Verfahren zum Einschluß von Enzymen in hydrophobe Sol-Gele14,15 zu
nennen. Alternativen zur Immobilisierung von Enzymen auf unlöslichen Trägern
stellen Systeme zur Enzymrückhaltung wie Enzym-Membran-Reaktoren (EMR)16,17
oder die von der Firma SEPRACORE entwickelten Hohlfasermodule18,19 dar.
Der Einsatz von nicht-wäßrigen Reaktionsmedien eröffnet der Enzymkatalyse den
Zugang zu einer Vielzahl von neuartigen Anwendungen.20,21 In Zukunft wird auch der
Einsatz von Enzymen, die durch Mutationen optimiert wurden, eine wichtige Rolle
spielen. Solche Mutationen können zufällig eingeführt werden, so daß in einem
anschließenden Selektionsverfahren dann Enzyme mit verbesserten Eigenschaften
identifiziert werden können (directed evolution).22 Mutationen können auch gezielt
vorgenommen werden, nachdem anhand der Proteinstruktur Aminosäuren
identifiziert wurden, deren Austausch verbesserte Eigenschaften erwarten läßt.23

2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG

Die Wirkstoffsynthese in der medizinischen Chemie ist ein ideales Einsatzgebiet für
biokatalytische Methoden.10,24 Viele Wirkstoffe sind chiral, und es muß mit
unterschiedlicher biologischer Aktivität der Enantiomeren gerechnet werden.25 Ein
Racemat wird daher als Gemisch zweier Wirkstoffe behandelt. Nur wenn beide
Enantiomere annähernd identische Wirkung aufweisen oder synergistische Effekte
zwischen den beiden Wirkstoffe bestehen, kann ein Racemat als Medikament
zugelassen werden. Ausnahmen sind Substanzen, die unter physiologischen
Bedingungen racemisieren oder Substanzen die metabolisch deracemisiert werden,
wie beispielsweise das Ibuprofen: (R)-Ibuprofen wird unter physiologischen
Bedingungen in das ungefähr viermal wirksamere (S)-Ibuprofen umgewandelt.26

1522 Wirkstoffe

426 (28 %) 1096 (72 %)
Naturstoffe Synthetika

422 (99 %) 4 (1 %) 422 (38 %) 674 (62 %)
enantiomerenrein achiral oder racemisch chiral achiral

52 (12 %) 370 (88 %)
enantiomerenrein racemisch

Abb. 1.1: Statistik über die Aufteilung von Wirkstoffen (1982).27

KLEEMANN und ENGEL haben 1982 eine repräsentative Auswahl an Arzneistoffen
untersucht und festgestellt, daß darunter fast alle eingesetzten Naturstoffe und deren
Derivate chiral sind und in enantiomerenreiner Form vorliegen. In der Mehrheit
werden synthetisch gewonnene Arzneistoffe eingesetzt, von denen hingegen nur
38 % chiral sind. Der überwiegende Teil davon (88 %) wurde 1982 noch als Racemat
eingesetzt (s. Abb. 1.1).27 Für die Neueinführungen der letzten Jahre hat sich dieses
Verhältnis deutlich in Richtung zu enantiomerenreinen Substanzen verschoben. 1985
betrug der Anteil enantiomerenreiner Wirkstoffe am pharmazeutischen Weltmarkt
noch ca. 2 %. Dieser Anteil ist bis ins Jahr 1995 auf 20 % angestiegen und weiter auf
32 % im Jahr 2000.28,29 Für die folgenden Jahre wird auch weiterhin ein wachsender
Anteil vorhergesagt.29

Auch vor dem Hintergrund der Auflagen nationaler und internationaler
30
Gesundheitsbehörden , welche die Erforschung der Wirkung jedes einzelnen

3

Stereoisomers als Notwendigkeit verlangen, wird enantiomerenreinen Substanzen
(enantiomerically pure compounds, EPC)31 von der pharmazeutischen Industrie ein
vermehrtes Interesse entgegengebracht.10,32 Daneben können auch patentrechtliche
Überlegungen von Unternehmen eine Rolle spielen, da nach Ablauf einer Schutzfrist
eines Racemats anschließend das aktiviere Enantiomer geschützt werden kann
(chiral switch). So können verlängerte Schutzfristen für Wirkstoffe erzielt werden.33

Die vermehrte Bedeutung enantiomerenreiner Verbindungen erfordert die Suche
nach neuen Zugängen zu diastereo- und enantiomerenreinen Produkten bei der
Entwicklung neuer Pharmaka. In den letzten Jahren sind zur Synthese
enantiomerenreiner Wirkstoffe viele Methoden eingesetzt worden: asymmetrische
Synthese, katalytische kinetische Racematspaltung und Racematspaltungen durch
Chromatographie an chiraler stationärer Phase (CSP) oder durch stereoselektive
Kristallisation.34,35 Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet der asymmetrischen
Synthese, basieren die Synthesen vieler chiraler Wirkstoffe noch auf der Trennung
der racemisch synthetisierten Verbindung.36 Unter den genannten Methoden spielen
biokatalytische Verfahren als Schlüsselschritt eine wichtige Rolle.35 Extracelluläre
Lipasen sind hierbei besonders attraktive Katalysatoren für synthetische
Verfahren.9,37

1.1 Opioide Analgetika

Die Behandlung von Schmerzen hat in der Medizin eine große Bedeutung. Es
besteht zur Zeit noch ein weltweiter Bedarf an gut wirksamen Schmerztherapien für
eine patientengerechte und zielorientierte Behandlung. Zentralwirksame Opioide38,
die auch als stark wirksame (morphinartige) Analgetikaa bezeichnet werden, werden
seit langem in der Schmerztherapie eingesetzt, obwohl sie ein dem Morphin
ähnliches Wirkungsprofil haben. Sie rufen eine Reihe von Nebenwirkungen wie
Sucht, Abhängigkeit, Atemdepression, gastro-intestinale Hemmwirkung und
39
Obstipation in unterschiedlicher Stärke hervor. Die moderne Analgesieforschung ist

a
algos (griech.) = Schmerz


daher bemüht Medikamente zu entwickeln, die eine schmerzstillende Wirkung, nicht
aber die für Opioide typischen Nebenwirkungen, zeigen.40
Die hohe Spezifität der Wirkung stark zentralwirksamer Analgetika hat ihre Erklärung
gefunden, nachdem es gelang, Opioid-Rezeptoren im Organismus nachzuweisen.41
Diese Rezeptoren werden normalerweise mit körpereigenen, morphinartig wirkenden
Peptiden, den Endorphinenb und Enkephalinen, die endogene Agonisten dieser
Rezeptoren sind, aktiviert.26,42,43,44 Das endogene schmerzhemmende System hat die
Funktion die lähmende Schmerzreaktion zu unterdrücken, so daß dem Organismus
seine Handlungsfähigkeit erhalten bleibt.
Opioid-Rezeptoren kommen in unterschiedlicher Dichte sowohl prä- als auch
postsynaptisch im Zentralnervensystem vor.44 Außerhalb des Zentralnervensystems
findet man Opioid-Rezeptoren vor allem im Dünndarm. 41 Wie bei anderen
Neurotransmitter-Rezeptoren werden auch bei den Opioid-Rezeptoren verschiedene
Subtypen unterschieden, die man als µ-, κ- und δ-Rezeptoren bezeichnet45. Seit
kurzem kennt man einen weiteren neuen Rezeptor, den ORL1-Subtyp (Opioid-
Receptor-Like 1), und dessen endogenen Liganden, das Peptid Nociceptin.46 Dabei
ist je nach Rezeptorsubtyp eine bestimmte pharmakologische Wirkung möglich. Bei
der supraspinal analgesierenden Wirkung spielt beispielsweise der µ-Rezeptor eine
dominante Rolle.47 Jeder Subtyp ist jedoch auch für ganz bestimmte
Nebenwirkungen verantwortlich. µ-Rezeptoren sind vor allem für die durch Opiate
ausgelöste Atemdepression und Abhängigkeit verantwortlich.44 Durch eine
unterschiedliche Affinität zu den verschiedenen Rezeptoren kann das variable
Wirkungsprofil verschiedener Opioide erklärt werden.

Morphinc (1, s. Abb. 1.2) ist eines der wenigen Beispiele eines Naturstoffs, der auch
heute noch in seiner ursprünglichen Form in der Therapie eingesetzt wird.48
SERTÜRNER isolierte 1806 das Morphin erstmals aus Opium. Die Klärung der Struktur
des Morphins, an der viele Forscher beteiligt waren, hat über 120 Jahre gedauert.
Die 1925 von ROBINSON und GULLAND angegebene Strukturformel wurde 1952 von
GATES und TSCHUDI bestätigt, denen die Totalsynthese des Morphins und damit auch
die Klärung der Stereochemie gelang. Diese vielstufige Synthese hat allerdings keine
praktische Bedeutung erlangt, da Morphin bis heute aus Opium gewonnen wird.49

b
Endo-Morphine
c
Morpheus = griech. Gott des Schlafs

OPIOIDE ANALGETIKA 5

R1O
OH

O H O
N CH3 Me
N
R2O OH
Morphin (1): R1 = R2 = H 1
Codein (2): R1 = Me, R2 = H
Heroin (3): R1 = R2 = Acetyl
Abb. 1.2: Morphin in einer konventionellen Darstellung nach Robinson (links) und
in einer Stereoformel (rechts).

Morphin stellt den Prototyp und auch den Standard der stark wirksamen Analgetika
zur Behandlung heftiger akuter und chronischer Schmerzen dar.50 Auf der Suche
nach analgetisch wirksamen Verbindungen ist die Struktur des Morphins vielfältig
variiert worden. Dabei zeigte sich, daß auch sehr weit abgewandelte Derivate typisch
morphinartige Eigenschaften besitzen können.51 Die Forschung auf dem
Morphingebiet zeigt weiter, wie aus einem komplexen Naturstoff durch systematische
Strukturvariation leichter herzustellende, strukturell einfache Analoga mit identischer
Wirkung, zum Teil sogar mit höherer Spezifität der Wirkung, gewonnen werden.26
Erste Abwandlungsprodukte wie Codein, der Methylether von 1, oder Heroin, das
Diacetylderivat von 1, waren ebenfalls Naturstoffe. Codein ist zwar schwächer
wirksam als Morphin, weist aber auch ein geringeres Suchtpotential auf. Für Heroin
trifft das Gegenteil zu, es weist ein sehr großes Suchtpotential auf.26

CH3
O O
CH3 N O
O CH3

CH3
N H 3C N
N
CH3 CH3
4 (-)-5 6
Pethidin Levomethadon Fentanyl
Abb. 1.3: Verschiedene opioide Wirkstoffe.

Pethidin52 (4, s. Abb. 1.3), das erste vollsynthetische Schmerzmittel vom Morphintyp,
wurde 1939 von EISLEB bei der Suche nach krampflösenden Wirkstoffen durch


Variation der Struktur des Atropins entdeckt.26,41,46 Das ebenfalls vollsynthetische
Methadon (rac-5) wurde 1941 von BOCKMÜHL und EHRHART gefunden. Als sich
herausstellte, daß nur das (−)-(R)-Enantiomer des Methadons für die analgetische
Wirkung verantwortlich ist, wurde es als Levomethadon53 ((−)-5, s. Abb. 1.2)
eingeführt. Es wird durch Racematspaltung mit (+)-(2R,3R)-Weinsäure aus
Methadon erhalten.41,47 Levomethadon wird hauptsächlich in der Schmerztherapie
eingesetzt, wohingegen racemisches Methadon, oral verabreicht, in der
Ersatztherapie bei Opioid-Abhängigkeit verwendet wird.54 Pethidin und Methadon
besitzen nur etwa ein fünftel bis ein viertel der analgetischen Wirkung des Morphins.
Zwar sind auch die Nebenwirkungen entsprechend schwächer ausgeprägt26,41,44,
jedoch ist ein entscheidender Fortschritt mit diesen Substanzen nicht erreicht
worden.

Fentanyl (6, s. Abb. 1.3), das ebenfalls synthetisch hergestellt wird, ist eines der am
stärksten wirksamen Analgetika, das etwa 100mal stärker wirksam ist als Morphin.
Es wirkt hauptsächlich über den µ-Rezeptorsubtyp.47 Fentanyl wird wegen seiner
relativ kurzen Wirkungsdauer von etwa 30 Minuten ebenfalls in der
Neuroleptanalgesie eingesetzt. Darunter versteht man ein Verfahren bei dem ein
Neuroleptikum gleichzeitig mit einem stark wirksamen Analgetikum injiziert und
dadurch ein Zustand induziert wird, bei dem der Patient sediert und angstfrei ist. So
können kleinere Eingriffe (wie beispielsweise Endoskopien) vorgenommen werden,
bei denen das Erwachen ohne Desorientierung vor sich geht und eine postoperative
Analgesie gewährleistet ist.41,44,55 Fentanyl und dessen Derivate mit einem hohen
Mißbrauchspotential („Designer Drogen“)56 zeigen die typischen Nebenwirkungen
starker µ-Opioide und führen zu einer physischen Abhängigkeit, ähnlich wie beim
Morphin.

Neben Molekülen mit einer agonistischen Wirkung gibt es auch Morphin-
Antagonisten (s. Abb. 1.6, S. 9), die eingesetzt werden, um die Wirkung von opioiden
Analgetika aufzuheben, im besonderen zur Aufhebung der Atemlähmung bei akuter
Vergiftung.41,47

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 7

1.2 Tramadol und analgetisch aktive Analoga

Tramadol57 (rac-7, s. Abb. 1.4) nimmt unter den stark wirksamen Analgetika eine
Sonderstellung ein, da dieser Wirkstoff eine starke Schmerzhemmung ohne die für
Opioide typischen Nebenwirkungen hervorruft.58 Das Suchtpotential ist so gering43,
das dieser Wirkstoff nicht unter Kontrollmaßnahmen von Narkotika fällt, in
Deutschland das Betäubungsmittelgesetz. Tramadol, das 1976 von der GRÜNENTHAL
GmbH in die Schmerztherapie eingeführt wurde, wird von der WORLD HEALTH
ORGANISATION (WHO) auf Stufe zwei der Schmerztherapie krebskranker Patienten
empfohlen.59 Tramadol wird weltweit vermarktet und ist eines der wichtigsten
zentralwirksamen Schmerzmittel.59

OH OH
(S)
(R)
OCH3 H3CO
(R) (S)

H3C N N CH3
CH3 H3C
(+)-(1R,2R)-Tramadol (−)-(1S,2S)-Tramadol
Abb. 1.4: Die Enantiomere des Tramadols ((+)-7, (−)-7).

Tramadol ist ein Racemat aus (+)-(1R,2R)- und (−)-(1S,2S)-2-Dimethylaminomethyl-
1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexanol. Das in der Therapie eingesetzte Tramadol
hydrochlorid ist ein partieller Opiat-Agonist, dessen Wirkstärke etwa 1/10 bis 1/5 der
des Morphins entspricht, jedoch mit stark reduzierter Opioidwirkung.44 Tramadol zeigt
eine µ-opioide und eine nicht-opioide Wirkung. Die nicht-opioide Wirkung ist eine
Inhibierung der spinalen Schmerzleitung durch Inhibierung der Wiederaufnahme der
Neurotransmitter Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5HT).
Dieses wird durch das (−)-(1S,2S)-Enantiomer bewirkt, wohingegen das (+)-(1R,2R)-
Enantiomer ein starker µ-Agonist ist und für die opioide Wirkung verantwortlich ist.
Die analgetische Wirksamkeit des Tramadols resultiert aus einer synergistischen
Kombination beider Enantiomere auf die die beiden Wirkmechanismen verteilt
sind.38,47,60,61,62 Zusätzlich trägt auch der in vivo durch oxidative Dealkylierung
gebildete Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol (8, M1), der eine wesentlich höhere
µ-Opioidrezeptor-Affinität besitzt, zur komplexen Gesamtwirkung bei.46,47,61,63,


OH
OH

O
H3C HO
CH3
N N
OH
CH3
(−)-1 (+)-8
Abb. 1.5: Strukturelle Ähnlichkeit zwischen Morphin und (+)-O-Desmethyltramadol.

Das (+)-(1R,2R)-Enantiomer des Tramadols und insbesondere das (+)-(1R,2R)-
Enantiomer des O-Desmethyltramadols lassen sich als stark vereinfachte Derivate
des physiologisch aktiven (−)-Morphins auffassen, deren Struktur durch Wegfall von
Ringanteilen flexibler wird (s. Abb. 1.5).

Sowohl für Opioide als auch für Endorphine und Enkephaline, die an diesen
Rezeptoren eine analgetische Wirkung auslösen, sind intensive Untersuchungen zur
Struktur-Aktivitäts-Beziehung durchgeführt worden.26,57,64 Demnach ist für ein aktives
Molekül ein in 1-Stellung arylsubstituiertes Cycloalkangrundgerüst, welches in 2-
Stellung aminoalkyliert ist, essentiell. Bei systematischen Variationen des Tramadol-
grundgerüsts stellte die GRÜNENTHAL GmbH fest, daß eine meta-Hydroxyfunktion am
Phenylring zur stärksten analgetischen Wirkung führt und daß die agonistische
Wirkung an die Dimethylaminogruppe gebunden ist. Bei Variationen der Ringgröße
hat sich der Sechsring als optimal herausgestellt.57 Eine freie Hydroxyfunktion am
quarternären Zentrum erweist sich außerdem als günstig, da die analgetische
Wirkung durch Substitution mit Chlor oder Wasserstoff verringert wird, bei
Veresterung geht sie völlig verloren.57
Daß sich das Agonist/Antagonist-Verhältnis eines Moleküls über die Stickstoff-
substitution beeinflussen läßt, zeigt sich im Naloxon (9) und Naltrexon (10) (s. Abb.
1.6, S. 9). Hier ist unter anderem ein N-Methylrest gegen einen Allyl- oder einen
Methylencyclopropyl-Rest ersetzt worden: beide Verbindungen sind dadurch Opioid-
Antagonisten. Des weiteren ist die räumliche Anordnung dieser Gruppen für die
Analgesiewirkung entscheidend. Allerdings kann eine vollständige Struktur-Aktivitäts-
Beziehung immer noch nicht aufgestellt werden.38

TRAMADOL UND ANALGETISCH AKTIVE ANALOGA 9

HO HO

O OH O OH
N N
CH2
O O
Naloxon (9) Naltrexon (10)
Abb. 1.6: Opioid-Antagonisten.

Die Synthese des racemischen Tramadol hydrochlorids erfolgt durch Grignard-
Reaktion von 2-(Dimethylaminomethyl)-cyclohexanon, welches durch Mannich-
Reaktion65 von Cyclohexanon, Formaldehyd und Dimethylamin hydrochlorid erhalten
wird, und dem Grignardreagenz des 3-Bromanisols. Aus dieser Reaktion wird eine
cis /trans (cis : trans = 85 : 15) Mischung erhalten. Das gewünschte cis-Isomer wird
durch Kristallisation des diastereomerenreinen Hydrochlorids erhalten. Das trans-
Isomer kann unter Verwendung starker Säuren epimerisiert werden.47,57,66

Präparative Verfahren zur Racematspaltung von Tramadol sind seit langem
dokumentiert. Die wichtigsten basieren auf der „klassischen“ diastereomeren
Salzbildung unter Verwendung von Weinsäure67, O,O´-Dibenzoyl-weinsäure66,68,
Mandelsäure69 und seit neustem auch O,O´-Di-para-toluoyl-weinsäure70. Die
Anwendbarkeit von chromatographischen Trennverfahren in einem präparativen
Maßstab ist ebenfalls demonstriert worden (unter Verwendung der simulated moving
bed Technologie, SMB).71 Analytisch lassen sich die Enantiomere chromato-
graphisch durch HPLC an chiraler stationärer Phase (s. Kap. 3.5, S. 210), durch
Kapillarelektrophorese (CE)72 oder spektroskopisch durch 1H-NMR-Spektroskopie in
Gegenwart von paramagnetischen Verschiebungsreagenzien73 identifizieren.

GRIGG et al. gelang die erste Festphasensynthese racemischen Tramadols mittels
eines „Linker“-Systems74, welches auf Hydroxylamin basiert.75 Das in der Mannich-
Reaktion eingesetzte Iminiumsalz wurde nach einer modifizierten Variante von
SCHROTH et al.76 aus einem N-Trimethylsilylamin mit einem Chlormethylether
hergestellt (s. Abb. 1.7).


1) TMSCl, TEA
O
O CH3 2) ClCH2OEt O
N N
H OTMS CH3

57 % RMgBr

H3CO
OH
H3CO
(H3C)2N 1) MeOTf OH
2) TEA O
N
rac-7, de = 92 % CH3
Abb. 1.7: Festphasensynthese von Tramadol nach GRIGG et al.

Einen ersten Ansatz zur asymmetrischen Festphasensynthese von Tramadol
verfolgten ENDERS et al., die einen „Linker“ auf Basis der THP-Schutzgruppe von
ELLMAN77 mit einem Derivat des Auxiliars (S)-2-Methoxy-methyl-pyrrolidin (SMP)
funktionalisierten. In dieser Syntheseroute wurde die chirale Mannich-Base vom
polymeren Träger abgespalten und dann in flüssiger Phase mit dem
Grignardreagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Das Produkt (+)-7 konnte hierbei nur
mit einem Enantiomerenüberschuß von 38 % erhalten werden (s. Abb. 1.8).78 Da
nach dieser Methodik andere Mannich-Basen mit hoher Enantioselektivität
dargestellt wurden79, ist zu vermuten, daß enantiomerenangereicherte Mannich-
Basen unter Grignardbedingungen partiell racemisieren.

O
O O O O
O O
OCH3 OCH3
N N
H
OCH3
67 % (H3C)2N CH2I

OH 1) THF / verd. HCl O O
O
OCH3
N(CH3)2 2) Extraktion +
N
3) 3 Äq. RMgBr
N(CH3)2
(+)-7, 78 % de
38 % ee

Abb. 1.8: Asymmetrische Festphasensynthese von Tramadol nach ENDERS et al.

11

1.3 Zielsetzung

In einem Tramadol-Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH sind ca. 2000
Strukturanaloga synthetisiert worden. Ziel dieses Projekts ist es, die Opioid-Wirkung
als auch die Wiederaufnahmehemmung in einem enantiomerenreinen oder achiralen
Molekül zu vereinigen. Die vorgenommenen Strukturvariationen lassen sich wie in
Abb. 1.9 dargestellt zusammenfassen.

Einführung zusätzlicher Eliminierung oder Substitution
sekundärer OH-Gruppen der tertiären OH-Gruppe
OH
O
CH3 Aromaten-
N substitution
offenkettige Strukturen H3C CH3 oder -variation

Abb. 1.9: Zusammenfassung der relevanten Strukturvariationen im Tramadol-
Nachfolgeprojekt der GRÜNENTHAL GmbH.

Für die pharmakologische und toxikologische Evaluierung dieser neuen Tramadol-
Analoga müssen, sowohl für die Entwicklung eines einzelnen Enantiomers als auch
für die eines Racemats, beide Enantiomere dargestellt werden.
Tramadol-Analoga sind als Racemate auf der Basis der Tramadol-Syntheseroute
sehr gut darzustellen. Eine alternative asymmetrische Synthese dieser Verbindungen
ist wegen der partiellen Racemisierung der Mannich-Basen bei ihrer Umsetzung mit
Grignard-Verbindungen noch nicht durchführbar. Dies macht eine Racematspaltung
notwendig, die gerade die Bereitstellung beider Enantiomere zu leisten vermag.

Bei der Racematspaltung von Tramadol und seinen Derivaten durch Kristallisation
diastereomerer Salze konnten bisher noch keine allgemeinen Richtlinien zur
Prädiktivität entwickelt werden, da schon geringe strukturelle Variationen häufig zu
einem nicht vorhersagbaren Verhalten in der Umsetzung mit den
Kristallisationsreagenzien führen. Präparative chromatographische HPLC an chiraler
stationärer Phase ist nur bedingt zur Bereitstellung kleiner Substanzmengen (1 bis
10 g) geeignet.


Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, in Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL
GmbH beide Enantiomere von Tramadol-Analoga durch eine Hydrolasen-katalysierte
kinetische Racematspaltung enantiomerenrein darzustellen. Mögliche
Funktionalitäten von Substraten auf Tramadol-Basis, die als Angriffspunkt für eine
Hydrolasen-katalysierte Reaktion dienen können, sind in Abb. 1.10 dargestellt.

Zusätzliche sekundäre tertiäre OH-Funtion
OH-Funktionen
OH phenolische OH-Funktion
O
CH3
N
offenkettige Strukturen H3C CH3
Abb. 1.10: Mögliche Angriffspunkte für eine Hydrolasen-katalysierte kinetische
Racematspaltung von Tramadol-Analoga.

Das solche Tramadol-Analoga Substrate für Hydrolasen sind, konnte bereits in
eigenen Vorarbeiten am Beispiel eines Phenylesters des O-Desmethyltramadols
(rac-15) gezeigt werden.80 Dieses Ergebnis soll als Ausgangspunkt für eine mögliche
Optimierung der Racematspaltung von Phenylestern des O-Desmethyltramadols
dienen. Es sollen ebenfalls Substrate eingesetzt werden, bei denen eine zusätzliche
Hydroxyfunktion in den Cyclohexylring eingefügt ist. Eine Vielzahl unterschiedlich
substituierter, racemischer Cyclohexanole sind bereits als Substrate in der Lipasen-
katalysierten Hydrolyse oder Acylierung untersucht worden.5-8 Diese Gruppe
cyclohexanolischer Substrate sollte somit ideal für eine Hydrolasen-katalysierte
kinetische Racematspaltung sein.

In dieser Arbeit sollen zur Enzym-katalysierten Racematspaltung beide möglichen
Verfahrensweisen eingesetzt werden: die Acylierung von racemischen Alkoholen
oder Phenolen im organischen Medium und die Hydrolyse der entsprechenden Ester.
Im Hinblick auf eine Optimierung der Reaktionsführung sollte der Einfluß
verschiedener Reaktionsparameter untersucht werden. Mögliche Variablen sind:
Lösungsmittel, Acyldonoren, verschieden Additive sowie pH-Wert, Cosolventien und
die Art der Estergruppe. Im Hinblick auf eine mögliche synthetische Anwendung soll
weitergehend untersucht werden, ob sich eine solche Enzym-katalysierte Reaktion in
größeren Maßstäben realisieren läßt.

2 Theoretischer Teil

2.1 Darstellung und Charakterisierung der MPEG/PLE-
Katalysator Präparation

Es ist bekannt, das native PLE im Gegensatz zu Lipasen nur eine sehr geringe
Aktivität im organischen Medium aufweist. Für einige Lipasen ist gezeigt worden, daß
durch Zusatz von Proteinen oder amphiphilen Verbindungen wie Polyethylenglycol
sie vor Änderung ihrer Konformation und somit Verminderung ihrer katalytischen
Aktivität geschützt werden können. GAIS et al. konnten dieses Konzept auf die PLE
erweitern und zeigen, daß eine Aktivierung durch Methoxypolyethylenglycol (MPEG)
möglich ist.81,82,83 Die besten Erfolge wurden hier durch Colyophilisierung von PLE
mit MPEG erzielt, wobei eine aufwendige kovalente Modifizierung des Enzyms nicht
notwendig ist.84 Durch die gemeinsame Gefriertrocknung von PLE und MPEG
werden vermutlich nicht-kovalente Komplexe zwischen Enzym und Polymer gebildet,
die, sofern sie nicht durch Lösungsmitteleinflüsse zerstört werden, zu einer
Aktivitätssteigerung führen. Das MPEG kann weiterhin geringe Mengen Wasser, die
für die katalytische Aktivität des Enzyms benötigt werden und auf der Oberfläche des
Enzyms gebunden sind, bereitstellen.

Das Colyophilisat aus MPEG/PLE wurde nach einer bekannten Methode
dargestellt.84,85 Hierzu wurde die PLE unter Eiskühlung entsalzt und die
zurückbleibende wäßrige Enzymlösung anschließend mit MPEG5000 versetzt. Nach
vollständiger Auflösung wurde die Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren und
danach gefriergetrocknet. Es entstand ein weißes, flockiges und gut handhabbares
Pulver in quantitativer Ausbeute.

Die Standardaktivität von PLE wird im Rahmen dieser Arbeit durch Hydrolyse von
0.25 M Buttersäureethylester fein emulgiert in 0.1 M Phosphatpufferlösung pH 8.0
bei Raumtemperatur bestimmt.86 Um eine direkte Vergleichbarkeit von Standard-
aktivitäten der PLE oder anderen Enzymen zu erhalten, muß gewährleistet sein, daß
diese unter einheitlichen Bedingungen gemessen werden. Häufig variieren aber die
Reaktionsbedingungen bei verschiedenen Quellen. HORGAN et al. berichten

14 THEORETISCHER TEIL

beispielsweise so von einem Aktivitätstest zur Bestimmung der PLE-Aktivität, der
durch Hydrolyse von 0.0125 M Buttersäureethylester bei pH 7.5 und 38 ºC
durchgeführt wird.87

Die beobachtete spezifische Aktivität der colyophilisierten PLE/MPEG war verglichen
mit der Aktivität der PLE-Ammoniumsulfat Suspension ca. 15 % geringer. Bei der
Lyophilisierung nativer PLE wurden im Vergleich dazu Aktivitätsverluste von 30 -
50 % beobachtet.85 In dieser Arbeit wurde auch ein Colyophilisat aus
PLE/BSA/MPEG eingesetzt. Die spezifische Aktivität dieses Katalysators entsprach
der des MPEG/PLE-Colyophilisats.

Eine Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit und auch der Selektivität der
MPEG/PLE-katalysierten Transacylierung vom Wassergehalt der Reaktionslösung ist
bekannt.21,81,82 Hier zeigte sich, daß ein zu großer Wassergehalt in enzymatischen
Transacylierungen zu hydrolytischen Nebenreaktionen führen kann, in denen das
Acylierungsmittel bevorzugt verseift wird.88 Dies führt zu Aktivitätsverlusten, da bei
der enzymatischen Hydrolyse des Vinylesters die entsprechende Carbonsäure
entsteht, die den pH-Wert in der Umgebung des Enzyms drastisch reduziert und so
zur Deaktivierung des Enzyms führt. Weiterhin kann der in der Transacylierung
gebildete Ester vom Enzym hydrolysiert werden. Da in diesem Fall das bevorzugt
gebildete Enantiomer auch bevorzugt hydrolysiert werden würde, würde dies zu einer
Selektivitätserniedrigung führen. Daher ist es notwendig eingesetzte Reagentien
unter dem Aspekt Wassergehalt zu charakterisieren, um Bedingungen, die zu
hydrolytischen Nebenreaktionen in der Transacylierung führen können, zu
vermeiden.

Der Wassergehalt von MPEG/PLE ist bereits durch zwei Methoden bestimmt
worden. Nach der ersten Methode wird MPEG/PLE bei 2.5·10-4 mbar und 120 ºC für
12 Stunden getrocknet und anschließend der Wassergehalt durch den
Gewichtsverlust ermittelt. Hiernach wurde ein Wassergehalt der MPEG/PLE
(colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) von 1 – 2 % bestimmt.84 Die zweite
Methode stellt die Karl-Fischer-Titration der MPEG/PLE dar. Bei der Karl-Fischer-
Titration besteht die Möglichkeit von Fehlern in der Wassergehaltsbestimmung
dadurch, daß fest gebundenes Wasser teilweise zu langsam abgegeben wird und

DARSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER MPEG/PLE-KATALYSATOR PRÄPARATION 15

daß es zu Reaktionen von funktionellen Gruppen des Proteins mit dem Reagenz
kommen kann.89 Nach dieser Methode wurde der Wassergehalt einer vergleichbaren
MPEG/PLE Probe (colyophilisiert bei 0.009 mbar, RT für 48 h) zu 1.2 % bestimmt.
Bei einer Verlängerung der Trocknungsdauer auf 72 h sank der Wassergehalt auf
0.6 %.85 Aufgrund der unterschiedlichen Temperaturen, die bei der Gefriertrocknung
unterschiedlicher Chargen herrschen, können die so erhaltenen Werte aber nur ein
grober Anhaltspunkt sein.90

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch den MPEG/PLE Katalysator keine erheblichen
Wassermengen in die Reaktionslösung eingebracht werden. Der in dem Katalysator
vorhandene Wassergehalt wird wahrscheinlich sogar vom Protein benötigt.


2.2 Darstellung der racemischen Tramadol-Analoga

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche enzymatische
Reaktionswege untersucht: die Enzym-katalysierte Transacylierung racemischer
Alkohole (s. Tabelle 2.1) und die Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester
(s. Tabelle 2.2). Die eingesetzten Substrate lassen sich in zwei Gruppen einteilen.
Die Erste besteht aus Substraten mit einer phenolischen OH-Gruppe und den
entsprechenden Estern, die sich durch O-Demethylierung von Tramadol und
Analogen ableiten lassen. Die zweite Gruppe besteht aus Substraten mit einer
zusätzlichen sekundären Hydroxylgruppe im Cyclohexylgerüst des Tramadols und
den dazugehörigen Estern. Aufgrund der unterschiedlichen Reaktivität der
phenolischen und der sekundären Hydroxylgruppe werden beide Substratgruppen in
den folgenden Abschnitten dieser Arbeit dementsprechend getrennt diskutiert.

Innerhalb der Zusammenarbeit mit der GRÜNENTHAL GmbH wurden Vorstufen zu den
Substraten zur Verfügung gestellt, so daß alle in dieser Arbeit eingesetzten
Verbindungen durch Standardreaktionen aus den zur Verfügung stehenden
Verbindungen zugänglich waren. Auf die einzelnen bei GRÜNENTHAL durchgeführten
Syntheseschritte zur Darstellung der bereitgestellten Substanzen wird in Kapitel 2.2.1
näher eingegangen.

Die racemischen Substrate zur enzymatischen Transacylierung wurden in der Regel
in Form ihrer Hydrochloride, die einfach zu handhaben sind, zur Verfügung gestellt.
Lediglich das Phenol rac-8 wurde in Form des Hydrochlorids der entsprechenden
O-methylierten Verbindung Tramadol (rac-7) bereitgestellt (Tabelle 2.1). Alle
bereitgestellten Hydrochloride waren über Monate bei Raumtemperatur lagerstabil.

Zur Freisetzung der racemischen Basen aus ihren Hydrochloriden werden diese in
einer Emulsion aus dest. Wasser und Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von
äquivalenten Mengen Natronlauge können die freien Basen nahezu quantitativ (97 -
98 % Ausbeute) extrahiert werden (s. AAV 1, S. 176).91

DARSTELLUNG DER RACEMISCHEN TRAMADOL-ANALOGA 17

Tabelle 2.1: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen
Transacylierung

Substrat zur enzymatische Transacylierung Darstellung
(±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-
1. Freisetzen der Base rac-7
cyclohexanol (rac-8):
aus dem Hydrochlorid.
OH
2. O-Demethylierung von rac-7
OH
mit DiBAl-H.
Me2N

(±)-3-(3-Dimethylamino-1-hydroxy-1,2-dimethyl-
propyl)-phenol (rac-11):
Freisetzen der Base aus
OH
dem Hydrochlorid.
OH

Me2N

cyclohexan-1,3-diol (rac-12):
OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N

OH OH
dem Hydrochlorid.
OMe

Me2N

OH
dem Hydrochlorid.
OMe
HO
Me2N

Das phenolische Substrat rac-8 und das zur Synthese des Esters rac-21 benötigte
3-(6-Dimethylamino-methyl-1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenol (rac-20) wurden aus
rac-7 und rac-13 dargestellt, in denen die phenolische Hydroxylgruppe noch als
Methylether vorliegt. Eine bekannte Methode zur Etherspaltung bei Verbindungen


des Tramadoltyps, die starke Basen wie Natrium- oder Kaliumhydrid in Gegenwart
von Thiophenol und Diethylenglycol verwendet92, ergibt jedoch O-Desmethyltramadol
(rac-8) aus rac-7 nur in unbefriedigenden Ausbeuten.91 Zur Etablierung der
phenolischen Hydroxylgruppe wurden daher die Methylether rac-7 und rac-13 durch
Reaktion mit Diisobutylaluminiumhydrid (DiBAl-H) in Toluol unter Rückfluß in guten
bis sehr guten Ausbeuten (88 - 93 %) demethyliert.91 Eine Dealkylierung am
Stickstoff war in keinem Fall zu beobachten.

Die Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse erfolgte
durch Acylierung der entsprechenden Phenole und Alkohole unter den angegeben
Reaktionsbedingungen (Tabelle 2.2).

Tabelle 2.2: Darstellung der racemischen Substrate zur enzymatischen Hydrolyse

Substrat zur enzymatische Hydrolyse Darstellung

(±)-Buttersäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-15): Pyridin katalysierte

OH Veresterung von 8 mit
O Pr Buttersäureanhydrid.
Me2N O

(±)-Essigsäure-3-(2-dimethylaminomethyl-
1-hydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-16): Pyridin katalysierte

O Me Essigsäureanhydrid.
Me2N O

(±)-Buttersäure-3-(3-dimethylamino-1-hydroxy-
1,2-dimethyl-propyl)-phenylester (rac-17): Pyridin katalysierte

O Pr Buttersäureanhydrid.
Me2N O


Fortsetzung Tabelle 2.2:


(±)-Buttersäure-4-dimethylaminomethyl-3-hydroxy-
Darstellung des Alkoholats
3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-18):
aus 12⋅HCl mit KOtBu und
O OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O
chlorid bei RT.
Me2N

3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester (rac-19): Darstellung des Alkoholats
O aus 13 mit KOtBu und
Acylierung mit Buttersäure-
Pr O OH
OMe chlorid bei –10 ºC.

Me2N

(±)-Buttersäure-3-(6-dimethylaminomethyl- 1. O-Demethylierung von 13
1,3-dihydroxy-cyclohexyl)-phenylester (rac-21): mit DiBAl-H zum Phenol 20.
2. Darstellung des Phenolats
OH OH
O Pr aus 20 mit NaHCO3-Lsg.
und Veresterung mit Butter-
Me2N O
säureanhydrid.

OH
OMe Acylierung mit Buttersäure-
Pr O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Hexansäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
OH
OMe Acylierung mit Hexansäure-
C5H11 O chlorid bei RT.
Me2N
O


Fortsetzung Tabelle 2.2:


(±)-Essigsäure-3-dimethylaminomethyl-4-hydroxy-
OH
OMe Acylierung mit Essigsäure-
Me O chlorid bei RT.
Me2N
O
(±)-Buttersäure-3-butyryloxy-4-dimethylamino-
methyl-3-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexylester
Pyridin katalysierte
(rac-25):
O O Veresterung von 13 mit
Pr O O Pr Buttersäureanhydrid.
OMe

Me2N

Allgemein verliefen die Veresterungen mit guten Ausbeuten. Als Nebenreaktion trat
in manchen Fällen in einem geringen Ausmaß eine unerwünschte Acylierung der
tertiären Hydroxylgruppe auf. Lediglich bei der Veresterung von rac-13 mit
Buttersäurechlorid in Gegenwart von Kalium-tert-butylat bei Raumtemperatur ist
diese Nebenreaktion so groß, daß als Hauptprodukt der Diester rac-25 nahezu
quantitativ (96 % Ausbeute) anfällt. Ein Absenken der Reaktionstemperatur auf
-10 ºC liefert aber neben nicht umgesetztem Edukt schon bevorzugt den Monoester
der sekundären Hydroxylgruppe, rac-19, in 58 %iger Ausbeute. Ebenfalls nicht zu
vernachlässigen war die Bildung eines Diesters bei der Darstellung von rac-24. In
diesem Fall ist nach chromatographischer Aufreinigung eine Mischung von
Monoacetat und Diacetat im Verhältnis 4 : 1 (Verhältnis der Signale der Protonen der
Methoxygruppe im 1H-NMR) erhalten worden, die sich nicht weiter auftrennen ließ
und somit in weiteren Reaktionen als Mischung eingesetzt worden ist. Bei einer
erneuten Synthese von rac-24, sollte daher versucht werden die
Reaktionstemperatur herabzusenken, um einer Bildung des Diesters entgegen-
zuwirken.


Zur Synthese des Phenylesters rac-21, wurde eine Methode zur selektiven
Acylierung der phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit einer sekundären benötigt.
Bei einer zunächst versuchten Acylierung von rac-20 mit einem Säurechlorid unter
Phasentransferkatalyse mit Tetrabutylammoniumbromid, wie von ILLI beschrieben93,
konnte lediglich das eingesetzte Edukt zurückgewonnen werden. RICE et al. gelang
bei Untersuchungen zu substituierten 3,14-Dihydroxy-17-methyl-4,5α-epoxy-
morphinanen die selektive Acylierung einer phenolischen OH-Gruppe in Anwesenheit
sekundärer Hydroxylgruppen nach einer modifizierten Methode von WELSH94 et al.95
Analog zu der von RICE beschriebenen Prozedur wurde rac-20 mit 10 Äquivalenten
Buttersäureanhydrid in Gegenwart eines Überschusses an wäßriger NaHCO3-
Lösung in sehr guter Ausbeute (93 %) zu rac-21 umgesetzt.

Bevor die in Tabelle 2.2 vorgestellten Substrate in eine Enzym-katalysierte Hydrolyse
eingesetzt wurden, wurde ihre Hydrolyse-Stabilität unter den verwendeten
Reaktionsbedingungen ohne Zugabe des Katalysators überprüft, um eventuelle nicht
Enzym-katalysierte Reaktionen auszuschließen. Eine nicht-enzymatische
Autohydrolyse würde zu racemischen Produkten führen, die, sollten sie während der
Enzym-katalysierten Reaktion ebenfalls entstehen, einen niedrigeren ee-Wert des
Produkts und damit eine niedrigere Selektivität der enzymatischen Katalyse
vortäuschen würden. Eine Autohydrolyse-Stabilität ist daher eine wichtige
Voraussetzung der zu verwendenden Substrate. Alle in Tabelle 2.2 gezeigten Ester
der Buttersäure waren unter den Reaktionsbedingungen im Bereich von pH 7.0 bis
pH 8.0 stabil gegen eine nicht Enzym-katalysierte Hydrolyse.
Dahingegen zeigten rac-16 und rac-24, beides Ester der Essigsäure, nur eine
unbefriedigende Autohydrolysestabilität. Die Stabilität von rac-16 ist bei
verschiedenen pH-Werten überprüft worden (Tabelle 2.3).

Tabelle 2.3: Überprüfung der Hydrolysestabilität von rac-16 in Phosphatpuffer-
Lösung in Anwesenheit von 10 % tert-Butanol.

pH-Wert Reaktionszeit Hydrolyseprodukt (GC)

7.0 2h 0.1 % rac-8
8.0 2h 1.2 % rac-8
8.0 16 h 15.0 % rac-8


Es zeigte sich, daß bei pH 7.0 innerhalb von 2 Stunden noch tolerierbare Mengen an
Hydrolyseprodukt detektiert worden sind. Bei pH 8.0 wurde allerdings eine merkliche
Autohydrolyse von bereits 1 % nach 2 Stunden und 15 % nach 16 Stunden
beobachtet. Eine Enzym-katalysierte Reaktion erscheint bei diesem pH-Wert wenig
sinnvoll.
Die Hydrolysestabilität des Esters rac-24 wurde in wäßriger Phosphatpufferlösung
(pH 7.5) mit Aceton (16 %Vol) als Cosolvens überprüft. Nach vier Tagen bei
Raumtemperatur konnten 2 % Hydrolyseprodukt detektiert werden. Da der ein-
gesetzte Ester rac-24 noch das Diacetat rac-14 als nicht zu entfernende
Verunreinigung enthält, wurde auf eine detaillierte Untersuchung zur Hydrolyse-
beständigkeit, wie beispielsweise bei verschiedenen pH-Werten verzichtet.

Um die Ansatzgrößen der enzymatischen Transacylierungen möglichst klein halten
zu können und um schnell zuverlässige Daten auch in der enzymatischen Hydrolyse
zu erhalten, wurde die gesamte Analytik der Reaktionsgemische auf gas- und
flüssigchromatographische Analyse aufgebaut. Zur Validierung von Analyse-
bedingungen wurden zunächst separat die reinen racemischen Substrate und
Produkte und danach dieselben als Mischung untersucht. Auf diese Art war eine
eindeutige Zuordnung der Verbindungen in den Chromatogrammen möglich (Abb.
2.1). Um ebenfalls eine zuverlässige, schnelle sowie möglichst einfache Bestimmung
der Enantiomerenverhältnisse von Edukten und Produkten bei den enzymatischen
Reaktionen zu gewährleisten, wurden Mischungen der racemischen Edukte mit den
jeweiligen racemischen Produkten durch Gas- oder Flüssigchromatographie an
chiralen stationären Phasen getrennt. Anschließend wurden unter den erhaltenen
Bedingungen zur eindeutigen Identifizierung der Verbindungen nochmals die
racemische Edukte und Produkte separat analysiert. Bis auf wenige, an
entsprechender Stelle explizit genannte Verbindungen, konnten sowohl die Signale
beider Enantiomere des Substrats als auch des Produkts in einem Chromatogramm
basisliniengetrennt erhalten werden (Abb. 2.2).


OH
OMe
Pr O
Me2N
O
rac-22

OH
OMe
HO
Me2N

rac-14

Abb. 2.1: Gaschromatographische Trennung von (±)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-
methoxy-phenyl)-cyclohexan-1,4-diol (rac-14) und (±)-Buttersäure-3-
dimethylaminomethyl-4-hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester
(rac-22) an einer CP-Sil-8-Säule.

Me2N OH
OMe
O
O
Pr (−)-22
OH
OMe
Pr O
Me2N
Me2N OH
O
(+)-22 OMe

HO
(−)-14
OH
OMe
HO
Me2N
(+)-14

Abb. 2.2: HPLC Trennung von (−)- und (+)-Buttersäure-3-dimethylaminomethyl-4-
hydroxy-4-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexyl Ester ((−)-22, (+)-22) sowie von
(+)- und (−)-2-Dimethylaminomethyl-1-(3-methoxy-phenyl)-cyclohexan-
1,4-diol ((+)-14, (−)-14) an einer OD-H-Säule mit chiraler stationärer
Phase.

Dies ermöglichte es, daß Proben direkt aus der Reaktionsmischung, nach
Abtrennung der hochmolekularen Proteine durch Filtration, ohne weitere


Aufarbeitung analysiert werden konnten. Mittels dieser effektiven Analytik ließen sich
detaillierte Informationen über den gesamten Reaktionsverlauf einer enzymatischen
Reaktion unter Einsatz geringer Substanz- und vor allem Enzymmengen gewinnen.

2.2.1 Synthesewege der von GRÜNENTHAL bereitgestellten Substanzen96

Die von der GRÜNENTHAL GmbH verwendeten Synthesewege zur Darstellung der
cyclohexanoiden Ausgangsmaterialien rac-14⋅HCl97, rac-12⋅HCl98 und rac-13⋅HCl
basieren auf der in Kap. 1.2 beschriebenen Tramadol-Syntheseroute, so daß viele
Erfahrungen aus diesem Produktionsprozeß in die Reaktionen eingebracht werden
konnten.

O CH3 1) BrMg OMe
O
N Cl
H 3C N(Me)2
O THF
O O H 3C Cl O O 2) Trennung der
Diastereomeren
MeCN 3) H

OH OH
OMe NaBH4 OMe
HO
O Me2N Me2N
rac-27 rac-14
Abb. 2.3: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-14.

Zur Einführung der neuen sekundären Hydroxylgruppe wurde anstelle von
Cyclohexanon ein als Monoketal geschütztes 1,4- bzw. 1,3-Diketon in die Mannich-
Reaktion eingesetzt (Abb. 2.3 und Abb. 2.4). Aus der Mannich-Reaktion des
3,3-Dimethyl-1,5-dioxa-spiro[5.5]undecan-8-on (26, Abb. 2.4) wurde nur das
gewünschte 9-Alkylierungsprodukt erhalten. Das unerwünschte 7-Alkylierungs-
produkt wurde wahrscheinlich aufgrund von sterischer Hinderung nicht gebildet. Die
erhaltenen jeweiligen Mannich-Basen wurden danach in einer Grignard-Reaktion mit
dem Grignard-Reagenz des 3-Bromanisols umgesetzt. Es wurden in beiden Fällen
cis /trans Mischungen erhalten, aus denen die gewünschten cis-Isomere abgetrennt
wurden und nach Abspaltung der Ketal-Schutzgruppen mit Mineralsäure die Ketone


rac-27 und rac-28 erhalten wurden. Die Ketone rac-27 und rac-28 wurden
anschließend mit Natriumborhydrid zu den gewünschten Alkoholen reduziert. Im
Falle der Reduktion des Ketons rac-27 konnte unter optimierten Bedingungen das
gewünschte (1RS,2RS,4SR)-konfigurierte 1,4-Diol rac-14 erhalten werden. Eine
Bildung des (1RS,2RS,4RS)-konfigurierten Epimers konnte nicht beobachtet werden.
Im Falle der Reduktion des Ketons rac-28 wurde eine Epimerenmischung aus
(1RS,3SR,6RS)-konfigurierten 1,3-Diol rac-12 und dem (1RS,3RS,6RS)-

konfigurierten Diol rac-13 erhalten, die anschließend getrennt worden sind. Auf
diesem Weg war es möglich beide in dieser Arbeit eingesetzte Epimere aus einer
Reaktion zu erhalten (Abb. 2.4).

1) CH3
O
H 2C N Cl 1) Trennung der
O OH
CH3 Diastereomeren
O OMe
2) 2) H Me2N
O
BrMg OMe
26 rac-28

OH OH OH
NaBH4 OMe OMe
HO +
Me2N Me2N
32 % 45 %
rac-12 rac-13
Abb. 2.4: Syntheseroute der GRÜNENTHAL GmbH zur Darstellung von rac-12 und
rac-13.


2.3 Vorbemerkungen zu Enzym-Katalyse

2.3.1 Kinetische Racematspaltungen

Der Reaktionsmechanismus von Lipasen und Esterasen entspricht weitgehend dem
von Serinproteasen.99 Typisch für diese Enzyme ist eine katalytische Triade im
aktiven Zentrum, die aus in dichter räumlicher Nähe stehendem Serin (Ser), Histidin
(His), Asparaginsäure (Asp) beziehungsweise Glutaminsäure (Glu) und verschieden
stabilisierenden Aminosäureresten gebildet wird. Darüberhinausgehend zeigen alle
bisher untersuchten Lipasen eine ähnliche dreidimensionale Struktur, das
α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv100,101 dessen zentrales Element acht nahezu parallele
β-Faltblätter sind, die von α-Helices an beiden Seiten umgeben werden (Abb. 2.5).102

Abb. 2.5: α/β-Hydrolasen Faltungsmotiv aus
β-Faltblättern (Pfeile 1 bis 8) und α-Helices
(Zylinder A bis F) mit katalytischer Triade
und einem Bereich zur Stabilisierung von
Oxyanionen.

Im Katalysezyklus (Abb. 2.6) wird der primär gebildete Enzym-Substrat-Komplex (A)
nukleophil vom aktiven Serinrest der katalytischen Triade angegriffen. Im
entscheidenden Katalyseschritt bildet sich über einen tetraedrischen
Übergangszustand (B) eine kovalente Bindung zwischen dem Serinrest und dem
Acylrest des Substrates zum Acylenzym (C). Der negativ geladene
Übergangszustand (B) wird durch das Enzym stabilisiert (Oxyanion-Bereich in Abb.

VORBEMERKUNGEN ZU ENZYM-KATALYSE 27

2.5). Die Bildung des Acylenzyms ist eine Gleichgewichtsreaktion und stellt eine
Umesterung zwischen dem Enzym und dem eingesetzten Ester dar.

(A) (B) (C)
Ser Ser Ser

O O O O
H R1 OR2
R1 OR2 R1 O + R2OH

O
Ser Ser Ser

O O O O
R1 OR3 H
R1 O + R3OH R1 OR3

O
(D) (E) (F)
Abb. 2.6: Katalysemechanismus bei Hydrolasen (ping-pong Mechanismus).

Entsprechend reagiert das Acylenzym in einer weiten Umesterung mit einem
Nukleophil, wie einem Alkohol (Transacylierung) oder Wasser (Hydrolyse), zu dem
freien Enzym und dem Produkt einem Ester (Transacylierung) oder Säure
(Hydrolyse) weiter (F). Kinetisch wird diese Reaktionsfolge als ping-pong
Mechanismus bezeichnet.103 In den meisten Reaktionen ist die Deacylierung des
Acylenzyms der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Katalyse.6

Die Hydrolasen-katalysierten Reaktionen lassen sich in zwei prinzipielle
Reaktionstypen unter Beteiligung chiraler Moleküle einteilen: Desymmetrisierung und
kinetische Racematspaltung (s. Abb. 2.7).


Kinetische Dynamische-kinetische
Racematspaltung Racematspaltung Desymmetrisierung
schnell schnell
R P R P schnell P
kR kR

+ + krac + A +

langsam langsam
S Q S Q langsam Q
kS kS
Produkt: 50 % P + 50 % S Produkt: 100 % P Produkt: 100 % P

R, S: Enantiomere des Substrats
P, Q: Enantiomere des Produkts
kR, kS: individuelle Geschwindigkeitskonstanten (kR >> kS)
krac: Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung (krac ≥ kR)

Abb. 2.7: Prinzipien der Racematspaltung und Desymmetrisierung.

In Desymmetrisierungs-Reaktionen104 (s. Abb. 2.7) werden prochirale Substrate
eingesetzt, wie beispielsweise meso-konfigurierte Diester. Diese können entweder
zum Produkt P oder seinem Enantiomer Q umgesetzt werden. Das Verhältnis der
Produkte wird durch die Reaktionsgeschwindigkeiten beider Reaktionen bestimmt.
Es ist somit unabhängig vom Umsatz und wird nur durch den Grad der enantiotopen-
Differenzierung des Enzyms beeinflußt. Daher ist es möglich, Produkte sowohl in
hohen Ausbeuten als auch mit hohen Enantiomerenüberschüssen zu isolieren.
In kinetischen Racematspaltungen (s. Abb. 2.7) dagegen wird ein racemisches
Substrat eingesetzt und in einer Enantiomer-differenzierenden Reaktion vom Enzym
umgesetzt. In dem Idealfall einer hohen Selektivität wird das eine Enantiomer R des
Substrats vollständig umgesetzt und das andere Enantiomer S nicht. In diesem Fall
kann sowohl das nicht-reagierende Enantiomer des Substrats (S) und das
Enantiomer des Produkts (P) mit Ausbeuten bis zu 50 % isoliert werden. Der
entscheidende Nachteil einer kinetischen Racematspaltung ist, daß die theoretisch
mögliche Ausbeute jedes Enantiomers 50 % nicht überschreitet. Zudem ist eine
Trennung des Reaktionsprodukts von dem nicht umgesetzten Substrat notwendig. In
der Mehrzahl der Prozesse ist nur eines der Reaktionsprodukte gewünscht, so daß
das andere racemisiert oder in einer enantiokonvergenten Weise umgesetzt werden
muß, was einen Mehraufwand bedeutet. Wenn möglich wird daher in solchen Fällen
die kinetische Racematspaltung um einen Schritt, eine schnelle in-situ

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