Libro de sesiones clinicas ugc biotecnologia 2014

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Libro de sesiones clinicas ugc biotecnologia 2014

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Libro de sesiones clinicas ugc biotecnologia 2014

  1. 1. SESIONES CLÍNICAS U.G.C. BIOTECNOLOGÍA. LIBRO I COMPLEJO HOSPITALARIO TORRECARDENAS
  2. 2. COORDINADORA DE LA OBRA Teresa Fernández Sanfrancisco REDACCIÓN DE TEXTOS Autores de cada uno de los capítulos CORRECCIÓN Y MAQUETACIÓN Teresa Fernández Sanfrancisco Juan Manuel García Torrecillas PORTADA Y FOTOGRAFÍA Teresa Fernández Sanfrancisco ©de la obra: Complejo Hospitalario Torrecárdenas. Almería. ©de cada capítulo individual: Autores de cada capítulo. © de la fotografía de portada: Teresa Fernández Sanfrancisco. Edita: Complejo Hospitalario Torrecárdenas ISBN: 978-84-697-0701-2
  3. 3. Quiero agradecer la colaboración de la Unidad de Formación, Docencia e Investigación especialmente a la Dra. Presentación Ataz y al Dr. Juan Manuel García Torrecillas por su ejemplo y por que dispusieran parte de su tiempo proporcionando toda la información y colaboración para la realización de este proyecto, a Mª Ángeles Salido, Bibliotecaria que ha buscado con gran rapidez y acierto lo necesario para documentar cualquier proyecto sesiones, poster… dándome buenos consejos. Por supuesto, a todos los Autores que lo han hecho posible. También a tantas otras personas que sería imposible citar, ellas saben quiénes son. Gracias. Teresa Fernández Sanfrancisco FEA UGC Biotecnología
  4. 4. AUTORES María Aurora Cejudo García UGC de Biotecnología (Unidad de Microbiología) Laura Del Gigia Aguirre UGC de Biotecnología (Unidad de Análisis Clínicos) María Jesús Extremera García UGC de Biotecnología (Unidad de Análisis Clínicos) Teresa Fernández Sanfrancisco UGC de Biotecnología (Unidad de Análisis Clínicos) Emilia García Moreno UGC de Biotecnología (Unidad de Análisis Clínicos) Sergio García Muñoz UGC de Biotecnología (Unidad de Análisis Clínicos) Miguel Martínez Lirola UGC de Biotecnología (Unidad de Microbiología) Mercedes Morales Torres UGC de Biotecnología (Unidad de Microbiología) Javier Muñoz Vico UGC de Biotecnología (Unidad de Inmunología) Armando Reyes Martos UGC de Biotecnología (Unidad de Microbiología) Manuel Ángel Rodríguez Maresca UGC de Biotecnología José Manuel Ruiz González UGC de Farmacia
  5. 5. INDICE Anticuerpos Heterófilos,  Caso clínico……………………………………………………………13 Aplicación  de herramientas moleculares  para el control de  la transmisión de la tuberculosis en Almería…………………………………………………………………………21 Biobancos………………………………………………………………………………………………………33 Citogenética…………………………………………………………………………………………………..41 Copeptina………………………………………………………………………………………………………59 Diagnóstico por componentes moleculares en enfermedades alérgicas…………67 Enfermedad de CHAGAS, una enfermedad olvidada…………………………………...…75 Enolasa………………………………………………………………………………………………………….95 Farmacología del Paludismo………………………………………………………………………..111 Fenilcetonuria, caso clínico…………………………………………………………………………..121 Fiebre Q, caso clínico……………………………………………………………………………………145 Influenza A H1N1 Pmd2009…………………………………………………………….……………157 Multi‐centre evaluation of speed‐oligo® mycobacteria version 2 assay for iden‐  tification of mycobacterium spp. in routine clinica mycobacteriology.............189 Proteómica en la clínica I………………………………………………………………………………167 Proteómica en la clínica II……………………………………………………………………………..181 Protozoos intestinales, caso clínico……………………………………………………………….195 Rosácea vs. Demodex……………………………………………………………………………………201 Síndrome de hiperestimulación ovárica…………………………………………………………221 Toma de muestras para la enfermedad de Hansen……………………………………….235 Tripanosomiasis Africana………………………………………………………………………………243
  6. 6. TÍTULO ABREVIADO DE LA SESIÓN Tripanosomiasis Africana. Farmacología………………………………………………………259 Tularemia. Situación en España……………………………………………………………………265
  7. 7. PRÓLOGO Hoy en día, en los hospitales, no se concibe un diagnóstico acertado sin contar con los Servicios de apoyo, ya que, aunque entrevista, historia clínica, paciencia y un fonendoscopio siguen siendo armas definitivas del quehacer médico, analíticas, pruebas de imagen, biopsias, tiraje de células y demás no pueden ser obviados para hallar, en la medida de lo posible, la máxima certeza diagnóstica que nos lleve al planteamiento pronóstico y terapéutico. La Unidad de Gestión clínica de Biotecnología de nuestro Complejo Hospitalario cumple con creces este cometido. Y, dentro de ella, los Residentes y la docencia en general cumplen un papel no pequeño para seguir aumentando os conocimientos que nos permitan llevar a cabo nuestra labor. Y, fruto del esfuerzo de todos los Docentes de Biotecnología y de los propios Residentes en formación, se publica este Libro de Sesiones que patentiza el esfuerzo, cariño y mimo de este continuo docente del que nos sentimos tan orgullosos. Mención especial a la Tutora de Análisis clínicos, Teresa Fernández Sanfrancisco, joven en nuestra comunidad de estudios pero magnífica en sus planteamientos, en su afán de innovar, en su empeño en alcanzar nuevas metas, como este Primer Libro de Sesiones Clínicas que esta Jefatura de Estudios tiene hoy el orgullo de prologar. Sin ella y sin los que son como ella sería imposible seguir avanzando en tiempos de dificultad como los que vivimos; son las personas las que hacen la ciencia, y no al revés. Espero, y junto conmigo todo el Hospital que represento, prologar muchos mas libros como éste. Por ese afán seguimos adelante, y ése mismo afán nos permite no envejecer intelectualmente. Espero os sirva su lectura como a mi me ha servido. Presentación Ataz López. Psiquiatra y Jefa de Estudios CHT
  8. 8. ANTICUERPOS HETERÓFILOS: CASO CLÍNICO Sergio García Muñoz INTRODUCCIÓN Se denominan anticuerpos heterófilos a determinados grupos de anticuerpos que reaccionan con múltiples antígenos, con baja afinidad, siendo estas reacciones inespecíficas, pudiendo encontrarse en el suero de personas normales o que han sufrido ciertas enfermedades. La razón de su existencia hay que buscarla en los llamados antígenos heterófilos, que aunque proviniendo de diversas fuentes, dan reacciones cruzadas entre sí debido a su semejanza estructural. Muchos de estos antígenos heterófilos son polisacáridos simples. En 1911, Forssman demostró su existencia, al hallar que los extractos de varios tejidos del cobayo, inducían una respuesta de anticuerpos en conejos, capaz de lisar eritrocitos de carnero en presencia de complemento. El antígeno de Forssman es un glucolípido de bajo peso molecular (un hapteno) que además no tiene una estructura única, ya que aunque posee una parte oligosacárida constante, su contenido de ácidos grasos varía según la fuente del antígeno1 . Es posible encontrar anticuerpos anti-Forssman en el suero de pacientes durante el curso de algunas infecciones, en tejidos de muchos otros animales (cobayos, caballos, perros, gatos, ratones, pollos), así como en ciertas bacterias (neumococos y shigellas) y hongos, y en eritrocitos de carnero y humanos (grupos sanguíneos A y AB). Otros ejemplos de antígenos heterófilos son los carbohidratos del grupo sanguíneo A, que dan reacción cruzada con el polisacárido capsular neumocóccico tipo XIV, y los de grupo B, con antígenos de Escherichia coli. Los anticuerpos heterófilos que se producen contra dichos polisacáridos por lo general son de tipo IgM. Se han encontrado en el suero de individuos normales (anticuerpos de Forsmann) y en pacientes que sufren algunas enfermedades, tales como la enfermedad del suero (una reacción de hipersensibilidad tipo III, mediada por complejos inmunes), la mononucleosis infecciosa, así como en pacientes con enfermedades autoinmunes 13
  9. 9. ANTICUERPOS HETERÓFILOS como lupus, diabetes tipo 1, artritis reumatoide etc., y además pueden reaccionar contra inmunoglobulinas propias (factor reumatoide). Los anticuerpos heterófilos también pueden unirse por reacción cruzada con anticuerpos de origen animal (como los empleados en los inmunoensayos), lo cual no es sorprendente, ya que diferentes especies tienen similares fracciones Fc. Estos anticuerpos pueden unirse simultáneamente a los anticuerpos de captura y de detección, generando una señal en ausencia del antígeno, produciéndose un resultado falsamente elevado. Otro tipo de interferencia puede ser causada por anticuerpos dirigidos contra proteínas de animales, especialmente anti anticuerpos de ratón (HAMA). Estos anticuerpos son altamente específicos, producidos como resultado de exposición de personas a proteínas animales en determinadas terapias o en técnicas por imagen, donde inmunoglobulinas animales son introducidas en el paciente como parte del tratamiento. En este capítulo se discute un caso clínico en el que la presencia de anticuerpos heterófilos generó un resultado falso positivo con el consecuente efecto adverso para la salud del paciente. PRESENTACIÓN DEL CASO CLÍNICO2 Hombre de 53 años, sin AP de interés que acude al servicio de urgencias de su hospital debido a un malestar abdominal periódico con disminución en la capacidad de trabajo. Los datos más relevantes de la analítica que se realizó fueron los siguientes: ACTH > 1250 pg/mL (IR < 46 pg/mL), cortisol dentro del IR, resto de parámetros normales. Cuatro semanas después se repitió la medición, confirmando un aumento continuado de ACTH. Descartada la enfermedad de Cushing por producción de ACTH por un tumor hipofisario, o la enfermedad de Addison dados los valores de cortisol normales y la ausencia de anormalidades en pruebas de estimulación, se diagnostica la presencia de una fuente ectópica productora de ACTH3 , siendo las posibles causas el cáncer de pulmón de células pequeñas, un tumor carcinoide bronquial, un feocromocitoma o un tumor neuroendocrino. Se realizan pruebas de imagen, incluyendo TAC, RMN y PET/TAC, evidenciándose en esta última una masa de 3.3 cm en el proceso uncinado 14
  10. 10. ANTICUERPOS HETERÓFILOS del páncreas, diagnosticándose un tumor neuroendocrino productor de ACTH, una rara fuente ectópica de esta hormona. Ninguna prueba convencional de imagen (RMN o TAC) logró confirmar la presencia del tumor, pero debido a la elevación persistente y al resultado del PET/TAC, se le ofrece al paciente tratamiento quirúrgico laparoscópico. En el preoperatorio se completan pruebas de imagen con TAC multifase y una tomografía computarizada por emisión monofotónica (SPECT/TAC), un protocolo bien establecido para la visualización de los tumores neuroendocrinos, la cual no evidenció el supuesto tumor4 . Se solicitaron los datos de la anterior evaluación positiva y se pospuso la cirugía. Se enviaron muestras a otro hospital que confirmaron los resultados elevados de ACTH y cortisol dentro de la normalidad. Así mismo, se encontraron resultados negativos para enolasa neuroespecífica, cromogranina A y metabolitos de serotonina. Esto, unido a la ausencia de signos clínicos como hiperpigmentación de la piel, debida al aumento de la proopiomelanocortina (POMC) precursora de la ACTH, sugería que el resultado elevado podría ser un error de laboratorio, apuntándose a la posibilidad de reacción cruzada por anticuerpos heterófilos5 . DISCUSIÓN La evaluación de estos casos de producción ectópica de ACTH habitualmente no es sencilla, aunque las pruebas de estimulación con ACTH y supresión con dexametasona a menudo revelan una patología del eje hipófiso-suprarrenal. En este caso, al resultado elevado de ACTH se une una prueba positiva de imagen que viene a complicar aún más el diagnóstico, si bien no existían signos clínicos como la mencionada hiperpigmentación de la piel o los trastornos electrolíticos. Sin embargo es importante destacar que la hiperpigmentación está ausente en algunos pacientes con producción de ACTH ectópica, ya sea porque la ACTH se produce independientemente de las malanotropinas o porque el tumor productor de ACTH es tan agresivo que la hiperpigmentación no llega a desarrollarse. Por otro lado, el patrón de los trastornos electrolíticos asociados depende de la causa primaria del aumento de ACTH. La insuficiencia suprarrenal primaria suele causar hiponatriemia e hiperpotasiemia, 15
  11. 11. ANTICUERPOS HETERÓFILOS mientras que los tumores que secretan la ACTH se asocia con la hipertensión resistente al tratamiento y a hipopotasemia. La ACTH normalmente se cuantifica mediante pruebas inmunométricas utilizando un anticuerpo de captura para unir el analito y otro de detección marcado para producir la señal analítica. La presencia de anticuerpos heterófilos puede originar un entrecruzamiento de los anticuerpos de captura y detección originando resultados falsamente positivos en ausencia del analito. Los anticuerpos heterófilos, como se ha mencionado en la introducción se producen en respuesta a un antígeno también heterófilo y están definidos por su marcada falta de especificidad. Si bien se encuentran en individuos con enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, también se pueden producir en individuos sanos. A estos hay que añadir los anticuerpos humanos anti animal producidos en respuesta a las inmunoglobulinas terapéuticas. RESOLUCIÓN DEL CASO La primera estrategia empleada ante la sospecha de presencia de anticuerpos heterófilos consiste en la adición de un agregado de anticuerpo monoclonal murino a las muestras y repetición de la medida. En caso de presencia de anticuerpos heterófilos, estos deberían unirse al anticuerpo murino cesando entonces su efecto sobre los anticuerpos de medida. Sin embargo en este caso la adición del monoclonal no originó ningún cambio en la medición de ACTH. El siguiente paso consiste en el empleo de pruebas inmunométricas sin sentido6 . Concretamente, se empleó un método estándar con un anticuerpo monoclonal murino anti-antígeno carcinoembrionario (T84.66, IgG1) como captura y un anticuerpo monoclonal anti alfa-fetoproteína (K57, IgG1) marcado con europio para la detección. Debido a que en este ensayo se emplean anticuerpos no complementarios, el test sería incapaz de detectar CEA o AFP presentes en la muestra y debería generarse un resultado negativo. Sin embargo, en presencia de anticuerpos heterófilos, el entrecruzamiento entre ambos anticuerpos resultaría en la generación de una señal positiva. En este caso, se obtuvo una señal fuertemente positiva, confirmando la 16
  12. 12. ANTICUERPOS HETERÓFILOS sospecha. Debido a que el test de ACTH empleado está diseñado con un anticuerpo monoclonal murino en combinación con un anticuerpo policlonal de conejo, también se estableció´ una prueba sin sentido con una inmunoglobulina policlonal de conejo como anticuerpo de captura con un marcador monoclonal de ratón, obteniéndose una señal positiva. Sin embargo, es muy importante recordar que la presencia de anticuerpos heterófilos no excluye que realmente hubiera una concentración elevada de ACTH (ambos fenómenos podrían ocurrir simultáneamente). Para comprobar este punto, se añadió inmunoglobulina de conejo agregada por calor, lo cual produjo una reducción drástica en la concentración aparente de ACTH medida al unir los anticuerpos heterófilo. Una comprobación adicional también consistió en el almacenamiento de una alícuota de suero a temperatura ambiente durante una semana y posterior repetición de la medida de ACTH, resultando un valor similar a la muestra recién descongelada, lo cual indica que la identidad del analito medido no es ACTH, la cual es lábil en almacenamiento a temperatura ambiente. Una vez confirmado el resultado falso positivo de ACTH, tuvo que explicarse el hallazgo de la masa tumoral en la cabeza del páncreas identificado por TEP/TAC. Dada la mayor afinidad de los receptores de somatostatina y la mayor resolución espacial de esta técnica, su sensibilidad es superior a la de otras técnicas de imagen en la detección de tumores neuroendocrinos, lo que aumenta la probabilidad de resultados falsos positivos. Mediante una ecografía endoscópica se comprobó la ausencia de evidencias de tumor. Sin embargo, se observó una lesión poco delimitada en la cabeza del páncreas, lo que posiblemente indicaba una leve pancreatitis focal. Las biopsias realizadas con agujas finas no demostraron células tumorales. Finalmente se canceló la cirugía y se informó al paciente sobre la presencia de anticuerpos heterófilos en sus muestras de sangre. Los resultados de la TAC de control seis meses después fueron normales. 17
  13. 13. ANTICUERPOS HETERÓFILOS AUTOEVALUACIÓN 1) Los anticuerpos heterófilos pueden encontrarse en el suero de: a) Individuos normales b) Pacientes con la enfermedad del suero c) Pacientes con mononucleosis infecciosa d) Enfermedades autoinmunes e) Todas las anteriores 2) Posibles causaS de producción de anticuerpos heterófilos por un paciente pueden ser: a) La expansión clonal de una célula plasmática. b) como resultado de exposición de personas a proteínas animales en determinadas terapias o en técnicas por imagen, donde inmunoglobulinas animales son introducidas en el paciente como parte del tratamiento. c) El tratamiento con interferón. d) Todas las anteriores. 3) Las técnicas empleadas para la investigación de anticuerpos heterófilos en una muestra son: a) Adición de un anticuerpo monoclonal de origen animal. b) Pruebas inmunométricas sin sentido c) A y b son correctas. d) Pruebas de inmunodifusión radial 4) En el diagnóstico diferencial de la producción ectópica de ACTH, debemos considerar: a) Enfermedad de Cushing, cáncer de pulmón de células pequeñas, un tumor carcinoide bronquial, un feocromocitoma o un tumor neuroendocrino. b) Enfermedad de Cushing, Addison o tumor neuroendocrino. c) Enfermedad de Cushing, Addison, cáncer de pulmón de células pequeñas, un tumor carcinoide bronquial, un feocromocitoma o un tumor neuroendocrino. d) cáncer de pulmón de células pequeñas, un tumor carcinoide bronquial, un feocromocitoma o un tumor neuroendocrino. 5) La hiperproducción de ACTH se caracteriza clínicamente normalmente por: a) Hiperpigmentación de la piel y alteraciones electrolíticas. b) Hiperpotasemia e hiponatremia c) Elevación de la presión arterial d) Ninguna de las anteriores. Respuestas correctas: 1e, 2b, 3c, 4d, 5a 18
  14. 14. ANTICUERPOS HETERÓFILOS BIBLIOGRAFÍA 1 Neelima Rajvaidya ,Dilip Kumar Markandey. Genetical and Biochemical Applications of Microbiology. APH Publishing, 2006. 2 Bolstad N, Kazaryan AM, Revheim ME, Distante S, Johnsrud K, Warren DJ, Nustad K, Edwin B.A man with abdominal pain: enough evidence for surgery? Clin Chem. 2012 Aug;58(8):1187-90. 3 Wajchenberg BL, Mendonca BB, Liberman B, Pereira MA, Carneiro PC, Wakamatsu A, Kirschner MA. Ectopic adrenocorticotropic hormone syndrome. Endocr Rev 1994;15:752– 87. 4 Kwekkeboom DJ, Kam BL, van Essen M, Teunissen JJ, van Eijck CH, Valkema R, et al. Somatostatin receptor-based imaging and therapy of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Endocr. Relat Cancer 2010;17:R53–73. 5 Bjerner J, Nustad K, Norum LF, Olsen KH, Bormer OP. Immunometric assay interference: incidence and prevention. ClinChem 2002;48:613–21. 6 Boscato LM, Stuart MC. Incidence and specificity of interference in two-site immunoassays. ClinChem 1986;32:1491–5. 19
  15. 15. APLICACIÓN  DE HERRAMIENTAS MOLECULARES   PARA EL CONTROL DE   LA TRANSMISIÓN DE LA TB EN ALMERÍA   Miguel Martínez Lirola    La tuberculosis en Almería  Estrategia de genotipado MTC aplicada   Genotipado poblacional    Identificación de clústeres moleculares                             (transmisión activa de TB)    Estrategia de geolocalización de casos de TB  Identificación de clústeres geográficos                             (Secciones censales con > RR de TB)    1‐ La tuberculosis en Almería  o 1‐a   o Atención diferencial de la TB en los distintos Distritos Sanitarios de LA  provincia.  En el Distrito de Poniente acumula la mitad de los casos  declarados. Tres cuartas partes de estos ocurren en población  extranjera (inmigrantes de origen magrebí o sub‐sahariano). Por  ello existe una Unidad de TB cuya principal actividad es el  seguimiento y supervisión activa de adherencia al tratamiento,  así como la realización de los estudios de contactos.    21
  16. 16. Control de la transmisión de la TB en Almería     22
  17. 17.                                                                           Control de la transmisión de la TB en Almería     1‐b: Evolución  de la incidencia de tuberculosis en Almería y Andalucía 1977‐2011          1‐c: Tuberculosis declarada y confirmada por cultivo  en la Provincia durante el periodo  comprendido entre 2003‐2011.  23
  18. 18. Control de la transmisión de la TB en Almería     El 62% (895‐1444) de la TB declarada se confirmó por cultivo                Evolución del porcentaje según el tipo de población 1977‐201  24
  19. 19.                                                                           Control de la transmisión de la TB en Almería   Distribución geográfica local: Identificamos zonas de mayor incidencia (distribución  geográfica no uniforme)      Pacientes con cultivo positivo MTC          Estrategia de geolocalización de casos de TB  Identificación de clústeres geográficos                             (Secciones censales con > RR de TB)    BACKGROUND  Tuberculosis control worldwide remains to be a serious problem, especially in  regions where the epidemic is maintained by active transmission, which often occurs  outside  the  family  unit.  In  such  contexts,  standard  contact  investigations  to  reduce  transmission are less effective, requiring new approaches to step forth and serve as a  guide to potential public health interventions in the control of tuberculosis (TB).  25
  20. 20. Control de la transmisión de la TB en Almería OBJECTIVE  Identify  the  spatial  and  temporal  distribution  in  a  setting  with  high‐burden  ongoing transmission of the culture‐confirmed TB, as well as local areas where active  transmission is concentrated, by the joint application of the geographic information  system (GIS), SCAN statistics program, and MTC genotyping. SETTING AND DESIGN  Almería  (province  in  the  south  of  Spain)  currently  ranks  as  the  XX  highest  annual TB incidence of Spain and as the first of the Andalusia Community, with a high  proportion of cases among foreigners living in poor socio‐sanitary conditions. In our  study, we try to locate 'hot spot' with greater potential risk of active TB transmission in  this  setting  by:  i)  a  first  stage,  identifying  geographical  locations  with  high  risk  of  occurrence  of  TB  using  a  statistics  spatial  program  (geographical  clustering  (G‐ clusters)); and ii) a second stage, choosing those where the more active transmissions  are  occurring  relying  on  universal MTC  genotyping  and  molecular  clustering  (M‐ clusters))  within  identified  geographic  clusters.  To  enable  this,  data  of  stable  residential  abode  from  culture‐positive  TB  patients  were  geocoded,  and  their  MTC  isolates were genotyped with a version of MIRU‐VNTR targeting 15 loci (MIRU‐15). The  TB G‐clusters were carried out with the statistics spatial SaTScan (V9.0) program and  geographic information systems (GIS) technology created a visual map, locating 'hot  spots'  of  active  transmission  in  this  community.  Additionally,  we  describe  and  geo‐ represent those molecular clusters with a high number of members (majority clusters)  or those having a rapid evolution over time (fast developing clusters). 26
  21. 21.                                                                           Control de la transmisión de la TB en Almería In  such  contexts,  standard  contact  investigations  to  reduce  transmission  are  less effective, requiring new approaches to step forth and serve as a guide to potential  public health interventions in the control of tuberculosis (TB).  Main objective  The  objective  of  this  study  was  to  identify  the  spatial  and  temporal  distribution  of  culture‐confirmed  TB  and  local  areas  where  active  transmission  is  concentrated,  throughout  the  period  2005‐2012  in  the  province  of  Almería  (Spain),  using  the  geographic information system (GIS), SCAN statistics program, and MTC genotyping.   1.1.1. TB geographic cluster detection and identification   Determination  and  identification  of  TB  clusters  were  carried  out  with  the  statistics  spatial SCAN program and calculated with the SaTScan (V9.0) computer package that  obtains statistical significance and the approximate cluster localization. The SaTScan  program  requires  three  files  for  initiation:  cases,  population,  and  geographic  localization files [3]. A Poisson probability model was used with a 25% and 50% search  window for high rates: origin and molecular clustering were the covariables.    Clústeres geográficos  Análisis espacial puro   El proceso consiste en encontrar buffers (en este caso círculos en el mapa),  donde el riego dentro del buffer sea significativamente más alto que fuera. De  esta manera se encuentran los “puntos calientes”    27
  22. 22. Control de la transmisión de la TB en Almería     Proceso de clustering geograf.    Programa informático: SaTScan v9.0.1  (Modelo Poisson discreto)     Requiere la siguiente información:  1. la localización de su dirección (coordenadas cartesianas)  2. N de casos de TB observados / sección censal  3. N Población / sección censal   El programa busca agrupaciones geográficas de casos que no se consideran fruto del  azar.    Identifica:                    Clúster geográfico principal (Riesgo Máximo) y                  Clústeres secundarios (mayor RR significativo)      28
  23. 23.                                                                           Control de la transmisión de la TB en Almería             29
  24. 24. Control de la transmisión de la TB en Almería               30
  25. 25.                                                                           Control de la transmisión de la TB en Almería   Entornos agrícolas‐urbanos                        31
  26. 26. Control de la transmisión de la TB en Almería     Trabajo por realizar    1. Además de estudiar los clusters espaciales, se están estudiando los temporales  y los espacio‐temporales  2. Estudiar las características socioeconómicas de las zonas definidas como  clusters geográficos de alto riesgo de TB  3. Estudiar la asociación entre clusters geográficos y clusters moleculares  Software (libre) utilizado: gvSIG, SaTScan          32
  27. 27. BIOBANCOS Manuel Rodríguez Maresca 1) Legislación. 12945 LEY 14/2007, de 3 de julio, de Investigación biomédica. Disposiciones generales Artículo 1. Objeto y ámbito de aplicación. 1. Esta Ley tiene por objeto regular, con pleno respeto a la dignidad e identidad humanas y a los derechos inherentes a la persona, la investigación biomédica y, en particular: a) Las investigaciones relacionadas con la salud humana que impliquen procedimientos invasivos. b) La donación y utilización de ovocitos, espermatozoides, preembriones, embriones y fetos humanos o de sus células, tejidos u órganos con fines de investigación biomédica y sus posibles aplicaciones clínicas. c) El tratamiento de muestras biológicas. d) El almacenamiento y movimiento de muestras biológicas. e) Los biobancos. «Biobanco»: establecimiento público o privado, sin ánimo de lucro, que acoge una colección de muestras biológicas concebida con fines diagnósticos o de investigación biomédica y organizada como una unidad técnica con criterios de calidad, orden y destino. Ley Orgánica 15/1999, • Artículo 12. Comités de Ética de la Investigación. • Artículo 13. Consentimiento. CAPÍTULO IV • Biobancos • Artículo 63. Interés científico. • Artículo 65. Titularidad. • Artículo 66. Organización del biobanco. • Artículo 67. Registro Nacional de Biobancos. 33
  28. 28. Biobancos • 1. Una vez constituido el biobanco según el procedi-miento anterior, la autoridad competente procederá a su registro en el Registro Nacional de Biobancos para Inves-tigación Biomédica, bajo la dependencia del Instituto de Salud Carlos III. Previamente habrán de inscribirse en la Agencia Española de Protección de Datos, de conformi-dad con la legislación vigente. • Artículo 75. Sanciones. • 1. Las infracciones leves contra lo previsto en esta Ley serán sancionadas con multa de hasta 600 euros, las graves con multa desde 601 euros hasta 10.000 euros, y las muy graves desde 10.001 euros hasta 1.000.000 de euros. • Artículo 88. Institutos y redes de investigación. • El Sistema Nacional de Salud colaborará con otras instituciones y organizaciones implicadas en la investigación para la utilización conjunta de infraestructuras científicas y el desarrollo de proyectos de investigación. A tal efecto, se promoverá la configuración de institutos de investigación biomédica en el seno de los centros del Sistema Nacional de Salud mediante la asociación de grupos de investigación. • 18919 Real Decreto 1716/2011, de 18 de noviembre, por el que se establecen los requisitos básicos de autorización y funcionamiento de los biobancos con fines de investigación biomédica y del tratamiento de las muestras biológicas de origen humano, y se regula el funcionamiento y organización del Registro • Por un lado, el régimen aplicable a los biobancos se caracteriza porque las muestras biológicas que se incorporen a los biobancos podrán utilizarse para cualquier investigación biomédica, en los términos que prescribe la ley, siempre que el sujeto fuente o, en su caso, sus representantes legales hayan prestado su consentimiento en estos términos. • La segunda diferencia que debe subrayarse es la relativa a las posibilidades de cesión a terceros de las muestras: la vocación de servicio público de los biobancos hace imprescindible para su funcionamiento que el consentimiento del sujeto fuente incluya la cesión de las muestras en términos también más amplios que cuando se trata de muestras depositadas en colecciones, puesto que en este último caso es preciso un consentimiento expreso para cada cesión. 34
  29. 29. Biobancos • Artículo 4. Autorización para la constitución y funcionamiento de los biobancos. • 1. La constitución de un biobanco con fines de investigación biomédica exige la previa obtención de la autorización de la autoridad competente. • 2. Las Comunidades Autónomas son competentes para autorizar la constitución y funcionamiento de los biobancos en sus ámbitos competenciales respectivos, sin perjuicio de las competencias atribuidas al Ministerio de Ciencia e Innovación para la creación de Biobancos Nacionales. Corresponde a las Comunidades Autónomas determinar la autoridad competente a estos efectos en su ámbito territorial. • Artículo 24. Tratamiento excepcional de muestras biológicas de origen humano con fines de investigación biomédica en ausencia de consentimiento expreso del sujeto fuente. • Con carácter excepcional, las muestras codificadas o identificadas podrán tratarse con fines de investigación biomédica sin consentimiento del sujeto fuente cuando la obtención de dicho consentimiento no sea posible o represente un esfuerzo no razonable; se entenderá esfuerzo no razonable el que suponga el empleo de una cantidad de tiempo, gastos y trabajo desproporcionado. • En estos casos, el Comité de Ética de la Investigación correspondiente deberá emitir dictamen favorable. • Artículo 28. Comunicación de datos de colecciones y muestras. • Los responsables de colecciones de muestras para fines de investigación biomédica conservadas fuera del ámbito organizativo de un biobanco y quienes conserven muestras biológicas para su utilización en un proyecto de investigación concreto deberán comunicar los datos relativos a las colecciones y a las muestras al establecimiento en cuyas instalaciones se conserven. • CONseJeríA de sAlud y BieNestAr sOCiAl • Decreto 1/2013, de 8 de enero, por el que se regula la autorización para la constitución y funcionamiento de Biobancos con fines de investigación biomédica, se crean el registro de Biobancos de Andalucía y el Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía. b) La creación del registro Andaluz de biobancos con fines de investigación biomédica. 35
  30. 30. Biobancos c) La creación del Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía. • Artículo 13. creación y organización del Biobanco en red del Sistema Sanitario Público de Andalucía 1. De conformidad con lo dispuesto en el artículo 17.1 del real Decreto 1716/2011, de 18 de noviembre, se crea el Biobanco del Sistema Sanitario Público de Andalucía dependiente de la consejería competente en materia de salud, como un biobanco en red, donde se integran aquellas estructuras y unidades de los centros sanitarios públicos, bancos de líneas celulares y otros centros públicos que puedan obtener, procesar y conservar células, tejidos, substancias y muestras biológicas para uso clínico o de investigación, constituidos como nodos del Biobanco. cada nodo del Biobanco contará con una persona que ejercerá la dirección del mismo. 36
  31. 31. Biobancos 3) Cuadro de mandos del Biobanco de Andalucía. 4) Biobanco de Andalucía. Nodo Almería. Por qué Biobanco en Almería. • Es obligatorio para poder investigar • Estará incluido en el contrato programa de 2014 • Ayuda a los investigadores a la gestión, procesamiento y conservación de muestras • Puede dinamizar la investigación con incentivos para los investigadores: – Repercusión económica – Privilegios para acceder a fuentes de financiación y a actividades de investigación • Visión de futuro: constitución de Nodo Biobanco Almería y vinculación con un Instituto de Investigación Biomédica 37
  32. 32. Biobancos Funcionalidad Nodo coordinador Granada-Nodo Almería. SOLICITUDES NODO BIOBANCO GRANADA PETICIONES DE EMPRESAS PETICIONES DE PROYECTOS APROBADOS EN EL COMITÉ ÉTICO INVESTIGACIÓN LOCAL PROVINCIA DE ALMERÍA COLECCIONES DE MUESTRAS NODO BIOBANCO GRANADA NODO ALMERÍA 38
  33. 33. Biobancos Gestión local. Nodo Almería PETICIONES DE EMPRESAS PETICIONES DE PROYECTOS APROBADOS EN EL COMITÉ ÉTICO COLECCIONES DE MUESTRAS REGISTRO DE PETICIONES Y COLECCIONES CONSENTIMIENTOS INFORMADOS PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y/O CONSERVACIÓN GESTIÓN ECONÓMICA DEL BIOBANCO (ANÁLISIS DE COSTES DE LOS PROCEDIEMIENTOS) DINAMIZACIÓN DEL I+D, INCENTIVO A LOS INVESTIGADORES 39
  34. 34. CITOGENÉTICA Emilia García Moreno CASO CLÍNICO Una pareja que acude a la consulta de genética tras llevar 4 años sin posibilidad de tener hijos. Se le solicita el estudio del cariotipo a ambos. Clínica: A destacar en el varón presenta azoospermia, ginecomastia. Fenotípicamente presenta talla alta con proporción anormal del cuerpo y las piernas. Resultados del cariotipo: Cariotipo mujer: 46,XX. Cariotipo hombre: 47,XXY. Diagnóstico: Síndrome de Klinefelter SÍNDROME DE KLINEFELTER El Síndrome de Klinefelter es la causa genética más común de infertilidad masculina humana, pero en muchas ocasiones no se diagnostica por la heterogeneidad clínica. El reconocimiento temprano y el tratamiento hormonal de la enfermedad pueden mejorar sustancialmente la calidad de vida y prevenir consecuencias graves. El síndrome de Klinefelter es la cromosomopatía sexual más frecuente. Existen diferentes formas de presentación: tipo homogénea o pura y el mosaico (no homogéneas). En la de tipo homogénea tenemos la forma clásica (47, XXY) es la más frecuente, pero también se presentan otras formas como son triple X (48, XXXY) y doble X junto con doble Y (48, XXYY). Las manifestaciones clínicas que presentan a nivel endocrinológico son hipogonadismo hipergonadotropo y el fenotipo característico es: talla alta desproporcionada, adiposidad abdominal, ginecomastia, vello púbico, facial y axilar escasos, y testículos pequeños. El diagnóstico en la adolescencia se realiza por falta de desarrollo puberal completo. El retraso neurocognitivo es variable, siendo característico el retraso en la adquisición del lenguaje. En la edad adulta, el motivo de diagnóstico es la infertilidad o la impotencia sexual. Los pacientes con síndrome de Klinefelter tienen mayor riesgo de tumores mediastínicos de células germinales, enfermedades autoinmunitarias, osteoporosis y síndrome metabólico entre muchos otros. 41
  35. 35. Citogenética INTRODUCCIÓN La citogenética es el área de la Genética que estudia todo comportamiento celular, basado en el análisis de la estructura y función de los cromosomas y el núcleo interfásico, encaminado a establecer sus asociaciones con el desarrollo orgánico, físico y poblacional de los organismos. La citogenética es el estudio del cariotipo, los cromosomas y las enfermedades relacionadas, causadas por un número y/o estructura anormales de los cromosomas. Los cromosomas son estructuras complejas localizadas en el núcleo de las células, compuestos por DNA, histonas y otras proteínas, RNA y polisacáridos. Son básicamente los "paquetes" que contienen el DNA. Normalmente los cromosomas no se pueden ver con un microscopio óptico, pero durante la división celular se condensan lo suficiente como para poder ser fácilmente analizados a 1.000 aumentos. Desde mediados del siglo xx se ha producido un enorme avance en el conocimiento del material genético humano. Con el consiguiente avance en las técnicas de estudio de los cromosomas, desde la citogenética convencional a la molecular que puede detectar pequeñas alteraciones como microdelecciones y microduplicaciones. Algunas técnicas son FISH, arrays genómicos y arrays basados en hibridación genómica. CROMOSOMA HUMANO Los cromosomas son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresión dinámica en las distintas fases del ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactación que alcanza su máximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tiñen fácilmente cuando están condensados y pueden ser individualizados con el microscopio óptico. Cada cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas proteínas y el contenido de genes es variable aunque está en relación con su tamaño. Por eso, cualquier alteración en el número o la estructura de los cromosomas puede ser causa de enfermedades1 . Las células humanas somáticas tienen 46 cromosomas (diploides, 2n). Las células sexuales humanas tienen 23 cromosomas (haploides, n). Los cromosomas se agrupan en pares cromosómicos en función de su tamaño y morfología. Existen 23 pares 42
  36. 36. Citogenética cromosómicos (22 pares de autosomas y los cromosomas sexuales, XX en la mujer y XY en el hombre). Los cromosomas del mismo par se llaman cromosomas homólogos, cada miembro del par proviene de un progenitor. En las células germinales, la dotación cromosómica está reducida a la mitad (a través del proceso de meiosis) y cuando se unen óvulo y espermatozoide forma un nuevo ser con la dotación cromosómica diploide característica de la especie humana. El cariotipo es la constitución cromosómica de un individuo y es un estudio de rutina en genética médica. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se señala por separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el número total de cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma. Así, el cariotipo normal de un varón se escribe 46,XY y el de una mujer 46,XX. Figura 1. klinefelter. 46,XXY. Wikipedia Figura 2. Cariotipo, 46,X. Sindrome Turner. Wikipedia Estructura y Morfología Todos los cromosomas alcanzan en la metafase su máximo grado de organización, ordenamiento y compactación. El cromosoma tiene una morfología linear con dos cromátidas que se unen por el centrómero y se divide en un brazo corto o brazo “p” (petite) y un brazo largo o brazo 43
  37. 37. Citogenética “q”. Los extremos de cada cromosoma se denominan telómeros. Algunos cromosomas presentan satélites en el brazo corto. Los cromosomas poseen un patrón de bandas características que se ubican en regiones y se enumeran desde el centrómero hacia el telómero del brazo correspondiente. Una banda se define por el número de cromosoma, el símbolo del brazo, el número de la región y el número de la banda dentro de la región (fig. 3). Hay un Sistema Internacional de Nomenclatura en Citogenética Humana (ISCN)2 , para la estandarización de la descripción del cariotipo normal y patológico. Los cromosomas se clasifican en función del tamaño y la posición del centrómero. En función de la posición del centrómero, tenemos: Metacéntrico: el centrómero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos presentan aproximadamente igual longitud. Submetacéntrico: cuando la longitud de un brazo del cromosoma es algo menor que la del otro. Acrocéntrico: Cuando un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q). Figura 3. Estructura y Morfología de los cromosomas. Fuentes: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/20/Chromosome_9.svg/125px- Chromosome_9.svg.png. http://webs.uvigo.es/mmegias/5-celulas/ampliaciones/imagenes/8- cromosomas-formas.png. 44
  38. 38. Citogenética Telocéntrico: Cuando el centrómero está en un extremo, no existen estos cromosomas en la especie humana. Los cromosomas se clasifican en siete grupos, (tabla I). Tabla 1. Clasificación de los cromosomas en grupos mediante nomenclatura citogenética, según ISCN GRUPOS CROMOSOMAS POSICIÓN CENTRÓMERO A 1,2 Metacéntrico 3 Submetacéntrico B 4,5 Submetacéntrico C 6,7,8,9,10,11,12,X Submetacéntrico D 13,14,15 Acrocéntrico E 16 Metacéntrico 17,18 Submetacéntrico F 19,20 Metacéntrico G 21,22 Acrocéntrico Y Submetacéntrico ALTERACIONES CROMOSÓMICAS Las anomalías cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales y pueden afectar a uno o más autosomas, a los cromosomas sexuales o a ambos simultáneamente3 . • NUMÉRICAS.- Entre las anomalías numéricas cromosómicas se encuentra la euploidía y la aneuploidía (Tabla2). La euploidia (poliploidía) se debe a la alteración del número haploide n (n=23 cromosomas). La triploidía (3n=69 cromosomas) y la tetraploidía (4n=92 cromosomas) son excepcionales en individuos vivos, siendo frecuente en los tejidos abortivos y tumorales. 45
  39. 39. Citogenética La aneuploidía se define como aquellas células que contienen un número de cromosomas no múltiplo de 23 y presentan ganancia o pérdida de cromosomas. Son las anomalías cromosómicas más frecuentes que tiene repercusión clínica, se asocia con trastornos del desarrollo físico o mental. Se trata de monosomías o trisomías que afectan a un cromosoma aunque puede implicar a más de uno. La especie humana tolera mejor las trisomías que las monosomías, pero siempre dependiendo del cromosoma implicado. Pueden afectar a los autosomas o a los cromosomas sexuales. Las monosomías autosómicas son casi siempre letales. En la trisomía 13 o síndrome de Patau y en la trisomía 18 o síndrome de Edwards se producen abortos de forma espontánea en el 95% de los fetos afectados. La trisomía 21 o síndrome de Down es compatible con la vida. Respecto a las aneuplodías de los cromosomas sexuales son compatibles con la vida excepto la completa ausencia del cromosoma X. Por ejemplo, algunos trastornos pueden ser monosomía del cromosoma X (síndrome de Turner), XXY (síndrome de Klinefelter), trisomía X. Tabla 2. Anomalías Cromosómicas Numéricas ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS POLIPLOIDÍA 3N (Triploidía) 69,XXY/69,XXX/69,XYY.. 4N (Tetraploidía) 92,XXXX/92,XXYY… ANEUPLOIDÍA Monosomía Sexual 45,X: S. de Turner Trisomía Sexual 47,XXY: S. de Klinefelter 47,XXX: Supermujer 47,XYY: Superhombre Autosómica 47,XY/XX + 13: S. de Patau 47,XY/XX + 18: S. de Edwards 47,XY/XX + 21: S. de Down 46
  40. 40. Citogenética • ESTRUCTURALES Afectan a la morfología o estructura del cromosoma y pueden ser balanceadas o equilibradas y no balanceadas o desequilibradas (Tabla 3). En las anomalías balanceadas, no existe pérdida o ganancia de material genético y generalmente no hay efecto fenotípico, pero hay riesgo incrementado de anomalía cromosómica en la descendencia. Entre ellas, tenemos traslocaciones, inversiones e inserciones. Las traslocaciones son intercambio de fragmentos cromosómicos y pueden ser recíprocas (entre cromosomas no homólogos) y robertsonianas (entre cromosomas acrocénticos). Las inversiones son una doble rotura de un cromosoma y unión de nuevo tras un giro (inversión de 180°). Las anomalías cromosómicas no balanceadas o desequilibradas, existe pérdida o ganancia de material genético, y por lo tanto suelen tener repercusiones fenotípicas, defectos congénitos asociados y/o retraso mental, siempre dependiendo del grado de anomalía. Entre ellas tenemos, deleciones (monosomías parciales), duplicaciones (trisomías parciales), cromosomas en anillo, isocromosomas y cromosomas dicéntricos. Algunos ejemplos: Síndrome del maullido del gato (deleción del brazo corto del cromosoma 5), Síndrome de Prader-Willi (deleción del brazo largo del cromosoma 15 paterno) y Síndrome de Angelman (deleción del brazo largo del cromosoma 15 materno). Tabla 3. Anomalías estructurales. Abreviaturas citogenéticas (ISCN) ANOMALÍA CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES. Símbología EQUILIBRADAS DESEQUILIBRADAS t translocación t rob translocación robertsoniana t rcp translocación recíproca inv inversión ins inserción del deleción der cromosoma derivado di cromosoma dicéntrico dup duplicación i isocromosoma mar cromosoma marcador upd disomía uniparental 47
  41. 41. Citogenética INDICACIONES CLÍNICAS DEL CARIOTIPO Es importante destacar que la identificación de alteraciones cromosómicas estructurales va a depender de las tecnologías existentes.Hay diferentes situaciones clínicas en las que está indicado el estudio de cariotipo4 (tabla 4). Presencia de un fenotipo específico. Las anomalías cromosómicas pueden ser las responsables de rasgos dismórficos y diversas malformaciones. Problemas de crecimiento y desarrollo tempranos. Pacientes con fallo o retraso en el crecimiento, facies dismórficas, malformaciones múltiples, estatura corta, genitales ambiguos y retraso mental son hallazgos frecuentes en niños con anomalías cromosómicas. Mortinatos y muerte neonatal. La incidencia de anomalías cromosómicas es mucho mayor en mortinatos que en recién nacidos vivos, también en niños que mueren en el periodo neonatal. El cariotipo es esencial para el consejo genético y para el diagnóstico prenatal en embarazos futuros. Problemas de fertilidad. Cariotipo indicado en pacientes que presentan amenorrea y en parejas con antecedentes de infertilidad o abortos de repetición. Antecedentes familiares. Una anomalía cromosómica conocida o sospechada en un pariente de primer grado. Tabla 4. Indicaciones CARIOTIPO2 PERÍODO NEONATAL PERÍODO DE LACTANCIA Malformaciones mayores aisladas Presencia de 3 o más defectos congénitos menores Recién nacido con rasgos dismórficos Recién nacido con genitales ambiguos Parto con producto muerto de causa inexplicable Muerte neonatal de causa inexplicada Dificultad para el aprendizaje Rasgos dismórficos Retraso psicomotor 48
  42. 42. Citogenética PERÍODOS PREESCOLAR- ESCOLAR PERÍODO DE ADOLESCENCIA Trastornos del crecimiento Retraso psicomotor Rasgos dismórficos Ginecomastia Falta de desarrollo puberal Amenorrea primaria o secundaria Retraso mental Rasgos dismórficos PERIODO PRENATAL PERÍODO DEL ADULTO Edad mayor de 35 años Ansiedad materna Triple screening sérico alterado Oligoamnios-polihidramnios Retraso de crecimiento intrauterino (CIR) Sospecha ecográfica de cromosomopatía Antecedentes de cromosomopatía balanceada en un progenitor Padres de niños con anomalías cromosómicas estructurales Abortos de repetición Infertilidad de causa desconocida Comprobación de diagnóstico prenatal Rasgos dismórficos Esterilidad Azoospermia/Oligozoospermia EN TODAS LAS EDADES Procesos malignos (cariotipo constitucional y tumoral) Control de trasplantes de médula ósea. ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS. CITOGENÉTICA La citogenética es el área de la genética que se dedica al estudio de los cromosomas en las metafases, su estructura y su herencia. Las distintas técnicas de citogenética se pueden clasificar en dos grandes grupos: las técnicas de citogenética convencional o de Bandas G y las técnicas de citogenética molecular5-6 . CITOGENÉTICA CONVENCIONAL La citogenética convencional permite estudiar los cromosomas de las células obtenidas tras el cultivo in vitro de las mismas. 49
  43. 43. Citogenética Procedimiento de obtención de muestras y preparaciones cromosómicas: Tipo de muestras. Va a ser cualquier tipo de muestra de células que sean viables y cultivables. • Genética Clínica Postnatal: sangre periférica heparinizada, médula ósea, biopsia de piel, etc. • Diagnóstico Prenatal: líquido amniótico, vellosidades coriónicas, cordocentesis. • Diagnóstico Oncológico: médula ósea, sangre periférica, ganglios linfáticos y biopsias de tumor. Cultivo-Procedimiento En el caso de un cultivo de sangre o médula ósea, el procedimiento que se sigue es el siguiente: Unas gotas de la muestra se ponen en cultivo en un medio de crecimiento con nutrientes, antibióticos, antifúngicos y fitohemaglutinina (agente inductor de la mitosis), y se mantiene a 37ºC durante 24/72h. Tras este periodo de incubación, se añade al medio de cultivo un agente antimitótico (colchicina) que detiene la división celular en metafase. El cultivo se somete a un choque hipotónico que rompe la membrana celular y la suspensión de núcleos se fija. A continuación se utiliza una enzima, denominada tripsina y la tinción posterior con el colorante Giemsa permite generar en los cromosomas un patrón de bandas claras y oscuras (bandas G) que permite identificar cada par cromosómico. El estudio de la morfología cromosómica nos permite estudiar tanto alteraciones numéricas como estructurales. Tipo de Bandeo cromosómico Entre las técnicas de bandeo se clasifican dependiendo del método de tinción de los cromosomas y su patrón carecterístico de bandas: • Bandas Q: Tinción con Quinacrina, aparecen como bandas fluorescentes y brillantes en contraste con otras no fluorescentes. Algunos problemas que presenta son que las bandas sólo se ven con luz ultravioleta y la fluorescencia dura poco tiempo. • Bandas C: se tiñe específicamente la heterocromatina de las regiones centroméricas. 50
  44. 44. Citogenética • Bandas G: Tinción con tripsina-giemsa y da un patrón en forma de bandas transversales claras y oscuras. • Bandas R: Es el patrón reverso de las bandas G. • Bandas T: Resalta las regiones teloméricas • Bandas Ag-NOR: Muestran las regiones organizadoras nucleolares de los cromosomas acrocéntricos (pares 13, 14, 15, 21 y 22). La técnica que se suele utilizar es la tinción de bandas G (de resolución 300-400 bandas), mientras que las C y las Ag-NOR se suelen utilizar para el diagnóstico y/o confirmación de ciertos tipos de alteraciones cromosómicas muy específicas. Dentro de la técnica de bandas G ha ido evolucionando su tecnología dando lugar al cariotipo de mayor resolución, denominándose cariotipo de alta resoluciónor (800 bandas) CITOGENÉTICA MOLECULAR HIBRIDACIÓN IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH) Las técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se basan en la hibridación de una sonda de ADN (fragmento de ADN complementario a la región de interés del genoma) marcada con una sustancia fluorescente (fluorocromo) sobre su secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosómica o en el núcleo de la interfase. Se puede utilizar para identificar los reordenamientos cromosómicos particulares o bien para diagnosticar la existencia de aneuploidías con rapidez. Solamente detecta aquella alteración para la cual está diseñada la sonda de ADN marcada con fluorescencia. La metodología FISH ha dado lugar al desarrollo de técnicas de mayor resolución y diferentes objetivos diagnósticos en función del tipo de sonda utilizada. Algunos ejemplos: • Pintado de cromosomas completos (pintado cromosómico o painting). Sondas que marcan el cromosoma entero o regiones específicas. • Pintado de centrómeros. Marcan únicamente la zona centromérica. • Marcado de la región telomérica y subtelomérica. 51
  45. 45. Citogenética • Sondas de secuencias específicas • Identificación de regiones ADN específicas de pequeño tamaño (microdelecciones) • Cariotipo multicolor o espectral (multi-FISH o SKY-FISH). Tiñe cada cromosoma con un color distintivo utilizando una combinación de 7 o menos fluorocromos diferentes. Se utiliza en investigación. Figura 4. Técnicas Cariotipo espectral (SKY) y M-Banding. HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA (CGH) Esta técnica fue descrita a principio de los 90, es una hibridización genómica comparada (comparative genomic hybridization, CGH). Consiste en hibridar metafases normales con una mezcla de ADN genómico (individuo normal) marcado con un fluorocromo verde y ADN genómico (individuo estudio) marcado con un fluorocromo rojo. Ambos ADNs compiten entre sí para hibridarse con las metafases normales que les sirven de blanco. En aquellas regiones en las que el genoma patológico tenga exceso de dosis (trisomías o polisomías totales o parciales), prevalecerá el color rojo, mientras que en las regiones delecionadas en el genoma patológico prevalecerá el color verde. En el resto del cariotipo que no haya alteración se observará una coloración resultante de la combinación de ambos fluorocromos. El análisis se realiza mediante un software utilizando una gráfica donde muestra la desviación de color para cada par de cromosomas en promedio de un determinado número de metafases. 52
  46. 46. Citogenética La CGH es una técnica de citogenética molecular que nos permite la identificación de ganancia o pérdida cromosómica por rastreo del genoma completo en una simple etapa. Tiene la ventaja de realizar una búsqueda a lo largo de todo el genoma sin disponer de información previa acerca de la anomalía cromosómica en cuestión. Pero también tiene algunas limitaciones, algunas de ellas son: no puede detectar anomalías cromosómicas balanceadas, las anomalías cromosómicas sólo se detectan si existen en la mayoría de las células de la muestra (presenta problemas en casos de presencia de mosaicismo). El nivel de resolución alcanzado depende del tamaño de las metafases que se utilizan como blanco de hibridización. La aplicación de estas técnicas moleculares complementan las técnicas habituales, no se suelen utilizar para realizar screening. Por ejemplo, cuando el cariotipo de alta resolución es normal, pero la clínica del niño hace sospechar alguna de las microdelecciones. También se utilizan cuando los cultivos para realizar el cariotipo no son buenos y se obtienen pocas metafases o son de baja calidad7-8 . CGH ARRAY Recientemente, la metodología de la CGH convencional se ha adaptado a la tecnología de los microarrays, el array-CGH. Con esta estrategia, los DNAs problema y control no se hibridan sobre metafases de linfocitos fijadas en un portaobjetos común, sino que se utiliza un portaobjetos en el que se han adherido secuencias de DNA que cubren todo el genoma. Por tanto, el resultado de la CGH se obtiene evaluando la fluorescencia hibridada en cada uno de los puntos que contiene el microarray9-17 . Otro sistema desarrollado con microarrays es el del array-SNPs, que puede ofrecer un análisis más completo del DNA problema. Esta técnica utiliza un portaobjetos en el que se han adherido secuencias de DNA polimórficas, SNPs (single nucleotide polymorphisms), que se encuentran repartidas por todo el genoma. Con los array- SNPs, no sólo se puede determinar el número de copias de un cromosoma (CNV, copy number variations) , sino que además se obtiene una “huella dactilar” única del DNA analizado, que identifica el genotipo de la muestra problema. En este caso, el DNA control y el problema se hibridan separadamente en distintas áreas de SNPs de un mismo portaobjetos y se puede utilizar el mismo fluorocromo para marcarlos. 53
  47. 47. Citogenética Como ventajas frente al cariotipo convencional, el array-CGH permite una mayor resolución en la detección de alteraciones o cambios de número copia (CNV), caracteriza las CNV de una manera precisa, conociendo en detalle la localización exacta de la alteración, sus límites, tamaño y el contenido en genes. Otra ventajas que el array-CGH no precisa de células en división para la producción de un resultado analizable (pudiendo utilizar fuentes de ADN congelado o incluso fijado); es por tanto una técnica más rápida, similar en respuesta a las técnicas de análisis de aneuploidías. Las principales desventajas del array-CGH son la imposibilidad de detectar reordenamientos balanceados (algo que sí puede detectar el cariotipo) y, debido al aumento de resolución aparecen muchas más alteraciones que no tienen clínica aparente denominándose alteraciones de significado incierto. El array-CGH es, actualmente, una herramienta ampliamente utilizada para la evaluación clínica de pacientes pediátricos, afectos de retraso mental, anomalías congénitas y otros espectros sindrómicos de difícil caracterización, cuyo cariotipo es normal, no se aprecia ninguna alteración. Se está considerando utilizar el array-CGH como primera opción antes que el cariotipo convencional en este tipo de pacientes. 54
  48. 48. Citogenética AUTOEVALUACIÓN 1. En que fase de la mitosis se suelen ver los cromosomas en mayor grado de compactación: a. Anafase. b. Prometafase. c. Metafase. 2. Cuántos cromosomas contienen las células humanas: a. Células autosomas 46 cromosomas. b. Celulas sexuales 23 cromosomas. c. Las células humanas tienen 46 pares de cromosomas. d. A y b son ciertas. 3. Definición de citogenética a. Es el área de la genética que estudia los cromosomas, su estructura y su herencia aplicado a genética médica. b. Es el estudio de los cromosomas mediante citometría de flujo. c. Estudia los onco genes implicados en el cáncer. 4. Como se cita el cariotipo de un individuo a. 46,XX/46,XY. b. Mujer XX, 46 cromosomas / Hombre XY, 46 cromosomas. c. Cariotipo normal ó anormal. 5. En cuantos grupos se dividen los cromosomas y en que se basa a. Se clasifican en 7 grupos (A-D), en función del tamaño y de la posición del centrómero. b. No hay clasificación. c. Solo en función del centrómero. 6. ¿ Como se clasifican las alteraciones cromosomicas? a. Numéricas, cuando afectan al número de cromosomas. Pueden ser euploidías cuando hay alteración en el número haploide o aneuploidías cuando las células contienen un número de cromosomas no múltiplo de 23. b. Estructurales, cuando afectan la morfología o estructura del cromosoma. Pudiendo ser balanceadas o no balanceadas. c. Todo es cierto. 7. Cuando está indicado realizar el estudio del cariotipo a. Niños con retraso mental, rasgos dismórfico y trastorno del crecimiento. b. Mujer embarazada que tiene más de 35 años, presenta el triple screening sérico alterado y sospecha de ecográfica de cromosomopatía. c. Pareja con problemas de fertilidad, abortos de repetición y padres con niños que presentan anomalias cromosómicas estructurales. d. Todas son ciertas. 55
  49. 49. Citogenética 8. Cual es la técnica se utiliza habitualmente en el estudio del cariotipo a. Bandas Q. b. Bandas T. c. Bandas G. 9. Que tipo de sindromes se asocia las siguientes alteraciones a. Sindrome de Down: 46,XX/XY+21. b. Sindrome de Patau: 46,XX/XY+13. c. Sindrome de Edwards: 46,XX/XY+18. d. Todas son ciertas. 10. Dentro de la citogenética molecular: a. FISH, es una técnica de hibridación de una sonda de ADN marcada con fluorocromo. b. CGH, es una técnica de hibridación genómica comparada, se basa en la comparación de ADN normal frente al patológico. Identifica ganancia o pérdida cromosómica. c. Arry-CGH se basa en la hibridación sobre pequeños fragmentos de ADN denominados array y se encuentran adheridos a un portaobjetos. d. Todas son ciertas. RESPUESTAS.- 1c, 2d, 3a, 4a, 5a, 6c,7d, 8c, 9d, 10d. 56
  50. 50. Citogenética BIBLIOGRAFÍA 1. R. L. Nussbaum, R. R. Mclnnes, H. F. Willard. Thompson&Thompson. Genética en Medicina. 7ªEdición. 2. ISCN: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (Cytogenetic & Genome Research). Ed. Shaffer LG, Tommerup N. 2005. 3. Garned RJ, Sutherland GR. Chromosome abnormalities and genetic counselling. Editado: Oxford University, 3ª edición, 2004. 4. Galvez E. Aplicaciones del laboratorio de citogenética a la Clínica. Pediatría Integral. 2002;9:820-30. 5. M.L. Martínez-Fernández, M.D. Sánchez-Izquierdo y M.L. Martínez-Frías. Resumen de la evolución de las técnicas de citogenética y genética molecular para la identificación de las alteraciones genéticas del desarrollo embrionario. Semergen. 2010;36(9):520–525 6. SEQC. C. Alonso Cerezo. Comisión de Genética Molecular. Bases cromosómicas de las alteraciones genéticas humanas. Química Clínica 2007; 26 (4) 224-228. 7. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science. 1992;258: 818–21. 8. Wells D, Sherlock JK, Handyside AH and Delhanty JD. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation. Nucleic Acids Res 1999;27:1214-1218. 9. Le Caignec C, Spits C, Sermon K, De Rycke M, Thienpont B, Debrock S et al. Single-cell chromosomal imbalances detection by array CGH. Nucleic Acids Res 2006;34:e68. 10. Mariona Rius Mas, Laura Marquès Soler y Joaquima Navarro Ferreté. Diagnóstico genético preimplantacional de aneuploidías: Indicaciones, técnicas y estrategias. Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2011 Vol. 16 Nº 1. 57
  51. 51. Citogenética 11. María Eugenia Querejeta, Beatriz Nieva, Juncal Navajas, Juan Cruz Cigudosa, Javier Suela. Diagnóstico prenatal y array-CGH II: gestaciones. Diagn prenat. 2012; 23 (2): 49-55. 12. Pinkel D, Albertson DG. Comparative genomic hybridization. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005;6:331-54. 13. Emanuel BS, Saitta SC. From microscopes to microarrays: dissecting recurrent chromosomal rearrangements. Nat Rev Genet. 2007;8:869-83. 14. Shaffer LG, Bejjani BA. Medical applications of array CGH and the transformation of clinical cytogenetics. Cytogenet Genome Res. 2006;115:303- 9. 15. Beaudet AL. Ethical issues raised by common copy number variants and single nucleotide polymorphisms of certain and uncertain significance in general medical practice. Genome Med. 2010;2:42. 16. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, Biesecker LG, Brothman AR, Carter NP, et-al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010;86:749-64. 17. Manning M, Hudgins L, Professional P, Guidelines C. Array-based technology and recommendations for utilization in medical genetics practice for detection of chromosomal abnormalities. Genet Med. 2010;12:742-5. 58
  52. 52. COPEPTINA COMO NUEVO BIOMARCADOR DE LABORATORIO Laura Del Gigia Aguirre INTRODUCCIÓN La vasopresina es una hormona peptídica sintetizada por el hipotálamo pero almacenada y segregada al torrente circulatorio por la neurohipófisis antes estímulos como la hipovolemia y la hiperosmolaridad, actuando por tanto como un potente homesotático de fluidos, glucosa y sales en sangre. (1) La vasopresina o también conocida como hormona antidiurética (ADH), como otras hormonas, no se sintetiza como tal, sino que como una molécula precursora en las neuronas magnocelulares de los núcleos supraóptico y paraventricular. Esta molécula precursora se presenta como una preprohormona la cual pasará a prohormona y por último a la estructura final de la vasopresina. La molécula de preprohormona se encuentra formada por: un nonapéptido correspondiente con lo que a posteriori será la ADH, un péptido señal que será eliminado en el retículo endoplasmático para la formación de la prohormona, una proteína llamada neurofisina II y un glicopéptido llamado copeptina que es la proteína objeto de estudio de este tema. La forma final de ADH se obtiene tras la escisión en el aparato de Golgi de estas dos últimas formas. Ante situaciones de hipovolemia o hiperosmolaridad la ADH es segregada a plasma con la ayuda de la vasopresinasa viajando unida a una proteína transportadora específica para llegar a su lugar de acción. Otras situaciones que desencadenan su secreción son el stress, infecciones, acidosis, hipoxia. Entre los efectos se encuentran: - En la porción final del túbulo distal y en los tubos colectores renales provoca la reabsorción de agua dando lugar a la disminución del volumen de la diuresis, disminución de la osmolaridad plasmática así como a un aumento del volumen sanguíneo. Esta acción es llevada a cabo a través de unos receptores específicos situados en las células del túbulo distal y colector llamados V2. Esta unión desencadena la cascada del AMPc permitiendo la apertura de las 59
  53. 53. Copeptina llamadas acuoporinas que como su nombre indica son canales que permitirán la reabsorción de agua provocada por la ADH. (2) - En el musculo liso y en menor medida en hígado, riñón y cerebro existen receptores V1a cuya activación desencadena la acción vasoconstrictora de la ADH.(2) - En el hipotálamo existen receptores V1b cuya activación está relacionada con la secreción de corticotropina. (2) - Otras funciones fisiológicas incluyendo efectos en la memoria, ciclos del sueño, regulación de la temperatura, hemostasia, liberación de insulina. (2) FASE PREANALITICA: LIMITACIONES EN LA DETERMINACIÓN DE VASOPRESINA - Entre la limitación más destacada se encuentra el gran porcentaje que se encuentra unido a plaquetas (>90%), por tanto la eliminación no completa de las plaquetas de la muestra y el almacenamiento prolongado de la misma puede conducir a resultados falsamente elevados. - Otra limitación seria la corta vida media que presenta, unos 15 minutos. - La falta de ensayos inmunoquímicos tipo sándwich también dificultan la medición. Actualmente solo se dispone de métodos competitivos los cuales requieren un mayor tiempo y además presentan menor sensibilidad analítica. - Es inestable a temperatura ambiente e incluso cuando se conserva a -20 C. (3) VENTAJAS EN LA DETERMINACIÓN DE LA COPEPTINA La copeptina es un péptido glicosilado de 39 aminoácidos con un segmento “core” rico en leucina. Es secretada por la neurohipófisis en un ratio equimolecular a la vasopresina presentando una cinética similar a la ADH. Existen inmunoensayos tipo sándwich para su determinación utilizando un anticuerpo policlonal humano de preprovasopresina fijado a una superficie sólida y un segundo anticuerpo policlonal dirigido a los aminoácidos de la preprovasopresina correspondiente a la copeptina marcado para su detección por quimioluminiscencia. El tiempo necesario para estos inmunoensayos es de aproximadamente 3 horas mientras que para los inmunoensayos competitivos disponibles para la determinación de ADH se requieren hasta 12-24 horas. 60
  54. 54. Copeptina La copeptina responde rápidamente a los cambios de volumen y osmolaridad plasmática considerándose una “hormona de estrés” dado que se libera inmediatamente durante la aparición de un evento agudo. Los niveles de copeptina reflejan de una forma más sutil los niveles de estrés frente al cortisol. Se encuentra en mayor concentración debido a que no se une a las plaquetas ni presenta un aclaramiento tan rápido como en la ADH. Las hormonas que inicialmente se secretan estequiométricamente, sus péptidos precursores son secretados en mayor concentración respecto a los péptidos maduros. (4) Presenta una mayor estabilidad en plasma. El volumen necesario para su determinación es menor: es suficiente con 50 μL de plasma o suero frente a 1 ml de plasma que se requiere para la determinación de ADH. APLICACIONES CLÍNICAS DE LA COPEPTINA 1. PRONÓSTICO DE LAS INFECCIONES DEL TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR INCLUIDO NEUMONIAS Se ha comprobado en varios estudios que los niveles de copeptina eran más altos en pacientes con infecciones del tracto respiratorio inferior frente a individuos sanos, así pacientes con neumonía adquirida en la comunidad con mayor grado de severidad también presentaban valores más elevados que pacientes con menor grado. Otros autores como Muller y cols. estudiaron la relación entre niveles de copeptina en pacientes con este tipo de infecciones y el riesgo de sepsis encontrando resultados desfavorables para pacientes con niveles aumentados. Además los pacientes que fallecieron también presentaban niveles más elevados de copeptina en el momento del ingreso hospitalario frente a los que sobrevivieron. (5) 2. MARCADOR DE SEPSIS En un estudio prospectivo observacional de 101 pacientes críticos realizado por Morgenthaler y cols se observo que los niveles de copeptina fueron más elevados en los pacientes con shock hemorrágico y sepsis. Al igual que en los pacientes con 61
  55. 55. Copeptina infecciones del tracto respiratorio inferior, se observaron en el momento del ingreso hospitalario valores de copeptina mayores en los pacientes que fallecieron a causa de la sepsis frente a los que sobrevivieron. (6) 3. INSUFICIENCIA CARDIACA CRÓNICA En la insuficiencia cardiaca crónica se produce una activación de la ADH relacionándose sus niveles con la gravedad de la enfermedad. En un estudio llevado a cabo por Alehagen se estudió la relación entre la copeptina y NT-proBNP en pacientes de edad avanzada con insuficiencia cardiaca crónica donde se llegó a la conclusión de que valores elevados de copeptina así como la combinación de copeptina y NT-proBNP implican un mayor riesgo de mortalidad. (7) Otro estudio llevado a cabo por Tentzeris et al. concluyeron que el estudio de la copeptina junto con hs-cTnT puede predecir la evolución clínica de los pacientes con insuficiencia cardiaca crónica estable. (8) 4. PRONÓSTICO EN PACIENTES CON ACCIDENTE CEREBROVASCULAR AGUDO La copeptina ha resultado ser un buen marcador pronóstico en comparación con otros biomarcadores en cuanto a la evolución funcional al cabo de un año y al riesgo de mortalidad a largo plazo en la escala de NIHSS. En un estudio de Urwyler y cols. se concluyó que los niveles de copeptina son una herramienta útil y complementaria para predecir el resultado funcional y la mortalidad al año después de sufrir un accidente cerebrovascular (9). 5. INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO La copeptina responde a cambios en la osmolaridad y en la volemia por tanto ante el cambio hemodinámico que tiene lugar durante el infarto agudo de miocardio se produce una elevación en los valores de copeptina. Por otra parte el considerarlo como marcador de estrés endógeno agudo es otra causa por la cual se eleva al inicio del infarto agudo de miocardio. Comparandola con la troponina, la prohormona de la ADH se encuentra elevada hasta 12 horas desde su pico máximo frente a las 6 horas que se mantiene la troponina desde el evento. 62
  56. 56. Copeptina Presenta utilidad como marcador temprano de necrosis cardiaca ya que se encuentra elevado en la primeras horas del evento a diferencia de los demás marcadores cardiacos clásicos que requieren de varias horas hasta su elevación. En un estudio de Gu y cols. la medición conjunta de copeptina y de la troponina T cardíaca (cTnT) mejoró la precisión diagnóstica al ingreso de pacientes con dolor torácico en el servicio de urgencias, mejorando el valor predictivo negativo de los pacientes con síntomas con menos de 3 horas de inicio. Peacock et al. realizaron un estudio comparando la copeptina y proadrenomodulina frente a NT- proBNP y hs- cTNT en pacientes con Infarto agudo de miocardio concluyendo que la copeptina y proadrenomodulina, solos o en combinación, mejoraban la predicción del riesgo de mortalidad en pacientes con infarto agudo de miocardio. (10) 6. DIABETES INSIPIDA Una de las indicaciones clínicas más evidentes para el uso de copeptina es el diagnóstico de diabetes insípida. En la actualidad no se utiliza la ADH para el diagnóstico de diabetes insípida, la medición de copeptina se podría utilizar como parámetro de utilidad diagnostica en estudios posteriores. (11) 7. DIABETES MELLITUS Enhörning y cols. han demostrado que un aumento en los niveles de copeptina predicen un mayor riesgo para desarrollar diabetes mellitus de manera independiente a los factores de riesgo clínicos establecidos, incluyendo la glucemia y la insulina en ayunas. (12) DISCUSIÓN La medición de copeptina supone un método fiable y estable para evaluar el eje hipotálamo-neurohipofisis implicado en la secreción de la ADH. Hay que tener en cuenta que a pesar de las ventajas que presenta la copeptina con respecto a la ADH en cuanto a su estabilidad en los fluidos biológico, la disponibilidad de una técnica más precisa y sus implicaciones clínicas existen ciertas consideraciones a la hora de su determinación. Existen fármacos que pueden interferir en su 63
  57. 57. Copeptina producción tales como los corticoesteroides los cuales inhiben su síntesis. Los pacientes con insuficiencia renal presentaran valores más elevados debido a su excreción renal mayoritaria. Como todo biomarcador innovador es necesario validar tanto los procedimientos analíticos para su determinación como los valores de referencia establecidos y su valor clínico. AUTOEVALUACIÓN 1. La copeptina: a) Forma parte solo de la prehormona de la vasopresina. b) Es un glicopéptido de 41 aminoacidos con un segmento core rico en histidina. c) a y b son correctas. d) Ninguna es correcta. 2. Entre los estimulos que desencaden la secreción de vasopresina y por tanto de copeptina no se encuentra: a) Hipovolemia b) Hiperosmolaridad c) Dolor abdominal d) Ninguna 3. Entre los efectos desencadenados por la ADH están: a) Reabsorción de agua libre de soluto en los tubulos renales. b) Vasoconstricción. c) Secreción ACTH. d) Todas las anteriores. 4. Las ventajas de laboratorio en la medición de copeptina son: a) Mayor estabilidad en plasma. b) Menor volumen de muestra. c) Diponibilidad de inmunoensayos tipo sándwich. d) Todas las anteriores. 5. Las implicaciones clínicas de la copeptina son: a) Marcador pronóstico en infecciones del tracto respiratorio inferior. b) Marcador pronósito de sepsis. c) Marcador pronóstico en enfermedades cerebrovascular. d) Todas las anteriores. Respuestas.- 1d, 2c, 3d, 4d, 5d 64
  58. 58. Copeptina BIBLIOGRAFÍA 1. Vander, A.J., Renal Physiology, McGraw-Hill, 1991hormonas 2. Kasper L. D, Braunwald E, Fauci S. A, Hauser L. A, Longo L. D, Jameson J. L, Isselbacher J. K, Eds. Harrisson. Principios de medicina interna. 16 ed. 2005; 319: 2306- 14. 3. Malagamba-Monjarás, M., Pla-Casamitjana, C. F., Noffal-Nuño, V. M., & Alcázar- González, G. A. Copeptina como biomarcador predictivo de gravedad y mortalidad en pacientes de terapia intensiva. 4. Dabla PK, Dabla V, Arora S. Copeptin: Role as a novel biomarker in clinical practice. Clin Chimica Acta 2011; 412: 22–28. 5. Müller B, Morgenthaler N, Stolz D, et al. Circulating levels of copeptin, a novel biomarker, in lower respiratory tract infections. Eur J Clin Invest. 2007; 37:145-42. 6. Morgenthaler NG, Muller B, Struck J, Bergmann A, Redl H, Christ- Crain M. Copeptin, a Stable Peptide of the Arginine Vasopressin Precursor, Is Elevated in Hemorrhagic and Septic Shock. Shock. 2007;28(2): 219-226. 7. Alehagen U, Dalhstrom U, Rehfeld JF, Goetze JP. Association of copeptin and N- Terminal pro BNP concentrations with risk of cardiovascular death in older patients with symtoms of heart failure. JAMA.2011;305(20); 2088-2095. 8. Tentzeris I, Jarai R, Farhan S, Perkmann T et al. Complementary role of copeptin and high-sensitivity troponin in predicting outcome in patients with stable chronic heart failure. European Journal of heart failure 2011; 13: 726-733. 9. Urwyler S, Schuetz P, Fluri F, et al. Prognostic Value of Copeptin One-Year Outcome in Patients With Acute Stroke. Stroke. 2010; 41: 1564-67. 10. Peacock WF, Nowak R, et al.Short-term mortality risk in emergency department acute heart failure. Acad Emerg Med. 2011; 18(9): 947-58. 11. Katan M, Morgenthaler NG, Dixit KCS, et al. Anterior and posterior pituitary function testing with simultaneous insulin tolerance test and a novel co-peptin assay. J Clin Endocrinol Metab 2007; 92: 2640–3. 12. Enhorning S, Struck J, Wirfalt E et al. Plasma Copeptin, A Unifying Factor behind the Metabolic Syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2011,96(7);E1065-E1072. 65
  59. 59. DIAGNÓSTICO POR COMPONENTES MOLECULARES EN ENFERMEDADES ALÉRGICAS Francisco Javier Muñoz Vico ¿QUÉ SON LOS COMPONENTES ALÉRGICOS? Una reacción alérgica está provocada por sustancias (normalmente proteínas), llamadas alergenos, que proceden de organismos vivos de nuestro entorno. Una vez que estas proteínas penetran en nuestro organismo, se unen a moléculas de IgE localizadas en la superficie de determinadas células (basófilos y mastocitos). Esta unión desencadena la liberación de sustancias (histamina, prostaglandinas, citoquinas…) capaces de inducir una reacción inflamatoria (vasodilatación, extravasación de líquido, quimiotaxis de células inflamatorias, etc.) responsable de la sintomatología característica de estas reacciones. Los organismos que pueden provocar reacciones alérgicas son muy variados y pertenecen prácticamente a todos los reinos de la naturaleza (plantas, animales, hongos…). La vía de entrada habitual es la aérea (neumoalergenos) y la digestiva (alimentos) aunque hay algunos alergenos que inducen reacciones por vía parenteral o cutáneo/mucosa. Ya en 1880 se conocían estas reacciones y se realizaron las primeras pruebas de provocación cutánea (origen de las pruebas de provocación, patrón de oro en el diagnóstico de estas afecciones), pero no fue hasta 1967, fecha del descubrimiento de la IgE, cuando se sentaron las bases del diagnóstico de reacciones alérgicas por el laboratorio El diagnóstico se basa en la historia clínica, pruebas in vivo (cutáneas –prick test, pruebas de provocación oral, etc.), y tests in vitro, realizados en el laboratorio. Entre estos últimos, el método más utilizado consiste en medir la concentración en sangre de IgE específica frente a alergenos concretos (1), mediante técnicas de inmunoensayo (quimioluminiscencia o fluorescencia). Los antígenos utilizados para estas determinaciones han sido clásicamente extractos purificados procedentes del organismo causante de la reacción; su composición por tanto es muy compleja ya que contienen numerosas proteínas en cantidades variables. Un resultado positivo en la 67
  60. 60. COMPONENTES ALẾRGICOS pruebas de IgE específica frente a un extracto alergénico indica reacción frente a una fuente alergénica (sensibilización), y apoya el diagnóstico de alergia en caso de existir clínica compatible; sin embargo, no revela la naturaleza de las moléculas sensibilizantes. A finales del siglo pasado se pudo obtener proteínas en estado puro, mediante técnicas de biología molecular (DNA recombinante) o mediante técnicas de extracción y purificación molecular. De cada organismo capaz de inducir una respuesta alérgica pueden caracterizarse determinados componentes moleculares responsables de dicha respuesta; estos componentes pueden ser utilizados como antígenos para la determinación de IgE específica, caracterizando de esta manera la reactividad, no frente a un organismo completo y bioquímicamente muy complejo (fuente antigénica), sino frente a proteínas individuales que son las verdaderas responsables de la reacción alérgica. A estas proteínas puras se les denomina “componentes”, y a la caracterización molecular de la reactividad y procedimientos diagnósticos derivados de ella, “diagnóstico por componentes alérgicos” (CRD) (2). Estos componentes están siendo también utilizados para la inmunoterapia específica (desensibilización), con la ventaja sobre los extractos clásicos de conseguir una desensibilización muy específica. Por todo ello, los componentes alergénicos están dando lugar a un cambio de paradigma en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades por hipersensibilidad mediada por IgE la alergia: de una “Alergia” a un organismo natural particular, se ha pasado a entender estas enfermedades como productos de una “Sensibilización” a una proteína específica de un organismo. NOMENCLATURA La IUIS (International Union of Immunological Societies) ha establecido una nomenclatura unificada para designar los componentes alérgicos (3). Básicamente consiste en los siguientes elementos: - Tres primeras letras de la primera palabra del nombre científico del ser vivo- fuente alergénica (género) - Una o dos primeras letras de la segunda palabra (especie) - Un número arbitrario para cada una de las moléculas alergénicas detectadas en esa especie 68
  61. 61. COMPONENTES ALẾRGICOS - Letras y números adicionales indicando variantes moleculares Por ejemplo, el Ole e 1 corresponde a una proteína del grupo 5 del polen de olivo (Olea europaea) FAMILIAS DE COMPONENTES ALÉRGICOS Se han descrito cerca de 7000 alergenos moleculares (4), que se agrupan en múltiples familias (hasta 186) (5). Cada familia está integrada por alergenos que presentan características químicas comunes que les confieren unas propiedades alergénicas particulares. El grado de estabilidad, por ejemplo, se conserva dentro de cada familia: proteínas lábiles son fácilmente degradadas por el procesamiento, cocinado, o por enzimas digestivas, y por tanto, la clínica que van a dar lugar es básicamente local (síndrome de alergia oral o SAO). Por el contrario, las proteínas estables llegan a la circulación de forma más o menos intacta, y por tanto serán capaces de provocar reacciones sistémicas. Las familias con más relevancia en clínica alérgica humana son (2): - Proteínas de almacenamiento: se encuentran en las semillas, y constituyen la materia prima para su crecimiento. Son específicas de especie, por lo que son muy útiles para determinar la fuente biológica responsable de una reacción alérgica. Son estables y resistentes al calor, por lo que incluso alimentos cocinados pueden provocar reacciones sistémicas graves. Algunos ejemplos son: Ara h1 (globulina 7S del cacahuete), Cor a 9 (Globulina 11S de la avellana), Ole e 1 (proteína del grupo 5 del olivo) - Proteínas transportadoras de lípidos (LPT). Son componentes principales de muchas frutas (melocotón, manzana, albaricoque), aunque están ampliamente distribuidos por todo el reino vegetal (pólenes). Son estables al calor y digestión, por lo que pueden dar lugar a reacciones sistémicas a frutas y vegetales, generalmente en el Sur de Europa. - Proteínas PR-10 (homólogos a Bet v 1-abedul). Son lábiles al calor, por lo que los alimentos cocinados son tolerados, y producen casi exclusivamente síntomas locales. Están asociados a reacciones a frutas y vegetales en el Norte de Europa. 69
  62. 62. COMPONENTES ALẾRGICOS - Profilinas: proteínas ubicuas del reino vegetal, presentes en polen, semillas, hojas, etc., muy homólogas entre sí (más de un 70%) y causantes de reacciones cruzadas. Son lábiles y por tanto rara vez causan reacciones graves - Componentes de origen animal: lipocalinas (proteínas epiteliales muy estables), tropomiosina (marcadores estables de reactividad cruzada entre crustáceos), parvalbúmina (elergeno principal en peces), etc. Los componentes de cada familia presentan reactividad cruzada entre sí, es decir, la IgE frente a uno de ellos reacciona con otros de la misma familia (6). Esto se debe a que están codificados por genes homólogos, y por tanto comparten una estructura tridimensional similar, con epítopos conservados. El caso paradigmático es el de las profilinas, cuya similitud de secuencia hace que no se puedan distinguir serológicamente las profilinas en función de la especie de origen (7) DIAGNÓSTICO BASADO EN COMPONENTES ALÉRGICOS (Component-resolved diagnostics –CRD-) En el campo del diagnóstico, el estudio de la sensibilización a alergenos moleculares permite: Obtener perfiles de reactividad individualizados Este objetivo es fundamental para conseguir un tratamiento apropiado y específico. Aun cuando empleando extractos parezca que todos los sensibilizados a un alergeno parezcan homogéneos, cada paciente tiene un perfil particular de sensibilización a nivel de componente; por ejemplo, dos alérgicos al polen de olivo indistinguibles clínicamente entre sí pueden estar sensibilizados a componentes distintos, uno a Ole e 1 (componente mayoritario) y otro a Ole e 10 (minoritario) (8). Los diferentes perfiles de reactividad a los componentes de una fuente alergénica pueden indicar diferencias geográficas y distintas vías de sensibilización. Este hecho queda ilustrado por la alergia a la manzana (9): La sensibilidad a la manzana en el norte de Europa es posterior a una sensibilización al polen de Abedul, ambas mediadas por proteínas PR-10 lábiles (Mal d 1 y Bet v 1 respectivamente), y dando lugar por tanto a reacciones orales leves a la manzana (SAO) en alérgicos al polen de Abedul. En cambio, en el Sur de Europa, la sensibilización a la manzana es primaria, por vía digestiva, y mediada por proteína LTP estable Mal d 1, por lo que da lugar a síntomas 70
  63. 63. COMPONENTES ALẾRGICOS sistémicos graves, y a la posterior sensibilización a otras frutas con proteínas LTP (melocotón, Pru p 3). La caracterización individual de la reactividad ha permitido mejorar el rendimiento del diagnóstico clásico de alergia mediante extractos. Por ejemplo, la gran mayoría de los alérgicos al cacahuete están sensibilizados frente a Ara h 2; la IgE específica frente a Ara h 2 tiene mejor sensibilidad y especificidad que la IgE frente al extracto (f15) (10). En otros casos se han obtenido marcadores útiles combinando ambas IgE específicas: el logaritmo del cociente entre la IgE anti-gliadina ω5 (componente del trigo) y la IgE anti-extracto de trigo parecen ser un marcador útil de alergia al trigo (11) Discriminar entre cosensibilización genuina y reactividad cruzada La cosensibilización consiste en una reacción frente a epítopos no compartidos entre dos fuentes diferentes (son realmente dos –o más- sensibilizaciones), mientras que la segunda indica una reacción frente a un alergeno único que reconoce una proteína similar en otra fuente. Antes de la introducción del estudio de componentes alérgicos no se podía distinguir entre ambos fenómenos. Se han identificado algunos síndromes alérgicos asociados a la sensibilización frente a diferentes fuentes alergénicas que contienen proteínas homólogas, por lo que se trata en realidad de reacciones cruzadas. Así tenemos el síndrome “Sazae“ (reactividad frente a profilinas de artemisa, zanahoria, apio y especias) o el síndrome LTP (alergia a proteínas LTP de melocotón, trigo, avellana y ciertas malezas como artemisa o parietaria) (12) Los CCD son determinantes carbohidratos presentes en muchas glicoproteínas (presentes en pólenes, alimentos, látex, veneno de himenópteros, etc.) que inducen la producción de IgE (2). La exposición a cualquiera de estas glicoproteínas puede dar lugar a IgE anti-CCD, que reaccionarán inespecíficamente con todas las fuentes alergénicas que contengan estos determinantes; este fenómeno se evidencia en el laboratorio cuando se obtienen IgE específicas positivas frente a fuentes alergénicas no relacionadas entre sí. Esta reactividad es diferente de la reactividad genuina frente al alergeno, pero se confunde con ella: se trata por tanto de falsos positivos sin relevancia clínica, ya que estas reactividades espurias no se asocian a síntomas clínicos. Para identificar los IgE anti-CCD y distinguirlos de las reactividades genuinas se emplea como antígeno en el laboratorio una proteína muy glicosilada, la Bromelina. Hay que 71
  64. 64. COMPONENTES ALẾRGICOS tener en cuenta, sin embargo, que un resultado positivo para CCD no descarta completamente una sensibilización genuina y por tanto una reacción alérgica. Estudio multiplexado de la reactividad alérgica Se han diseñado plataformas, basadas en microarrays, que permiten analizar el perfil global de reactividad IgE de un enfermo. En ellas se puede estudiar la sensibilidad de un enfermo a cientos de alergenos simultáneamente, lo que puede ser útil para confirmar (o descartar) un diagnóstico de polisensibilización, para clarificar alergias en casos complejos, o para fines epidemiológicos. EL CRD EN LA INMUNOTERAPIA ESPECÍFICA (ITE) En el campo de la inmunoterapia el CRD permite (13): Seleccionar pacientes para la ITE Al determinar el perfil de sensibilización de un paciente, si éste muestra sensibilización a los componentes principales se puede prever una buena respuesta a ITE con extractos comunes, que contienen gran cantidad de estos componentes. Por el contrario, si el enfermo está sensibilizado a componentes secundarios (minoritarios), la ITE será con toda probabilidad ineficaz, e incluso es posible que con ella induzcamos yatrogénicamente nuevas sensibilizaciones. Por otra parte, si el enfermo es sensible a componentes específicos obtendrá un mejor resultado con la ITE que si es sensible a componentes que presentan reacción cruzada. Monitorizar la respuesta inmunológica Con el CRD podemos determinar la evolución de la concentración de IgE e IgG4 frente a los componentes principales (con una ITE eficaz, la IgE debe reducirse, e incrementarse la IgG4), así como detectar posibles sensibilizaciones a componentes secundarios por reacción cruzada. 72
  65. 65. COMPONENTES ALẾRGICOS BIBLIOGRAFÍA 1. Cox L, et al. Pearls and pitfalls of allergy diagnostic testing: report from the American College of Allergy, Asthma and Immunology/American Academy of Allergy, Asthma and Immunology Specific IgE Test Task Force. Ann Allergy Asthma Immunol. 2008;101:580-92. 2. Individual Recombinant/Purified Allergen Molecules and Allergen Microarray testing. Isacology, Marzo 2010. Consultado en 31-5-2014 de http://www.dhm.com.au/media/8605737/isacology_newsletter_2010.pdf 3. http://www.allergen.org/ 4. http://www.allergome.org 5. AllFam (http://www.meduniwien.ac.at/) 6. Steinman H, Ruden S. Native and recombinant allergen components. ISBN 91- 970475-6-2. Phadia AB. Uppsala, Suecia. 2008. Pág. 5-9 7. Hauser M, et al. Panallergens and their impact on the allergic patient. Allergy Asthma Clin Immunol 2010; 6:1 8. Duffort O, et al. Variability of Ole e 9 allergen in olive pollen extracts: relevance of minor allergens in immunotherapy treatments. Int Arch Allergy Immunol, 2006, 140: 131 9. Fernandez-Rivas M, et al. Clinically relevant peach allergy is related to peach lipid transfer protein, Pru p 3, in the Spanish population. J Allergy Clin Immunol, 2003; 112:789 10. Nicolaou N, et al. Quantification of specific IgE to whole peanut extract and peanut components in prediction of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol, 2011; 127: 684 11. Park HJ et al. Diagnostic value of the serum-specific IgE ratio of ω-5 gliadin to wheat in adult patints with wheat-induced anaphylaxis. Int Arch Allergy Immunol, 2012; 157-147 12. Pascal M, et al. Lipid transfer protein syndrome: cliinical pattern, cofactor effect and profile of molecular sensitization to plant-foods and pollens. Clin Exp Allergy, 2012; 42: 1529 13. http://www.thermoscientific.com/phadia.es 73
  66. 66. ENFERMEDAD DE CHAGAS. UNA ENFERMEDAD OLVIDADA. Emilia García Moreno CASO CLÍNICO Varón de 42 años llega a Urgencias por presentar varios episodios sincopales precedidos de mareo. No presenta dolor torácico ni palpitaciones. Anamnesis. El paciente procede de una zona rural de Perú. Reside en España desde hace 6 años, su mujer y sus hijos siguen en Perú. No presenta antecedentes cardiológicos previos pero refiere tener 5 familiares directos (padre, hermanos, sobrino) fallecidos de muerte súbita a edad temprana sin diagnóstico previo. Estudio Cardiológico: Se realiza ecocardiografía, electrocardiograma y cateterismo cardíaco. Estudio laboratorio: Se solicita el estudio de serología y PCR de Trypanosoma cruzy. Resultados: En la ecocardiografía se observan ventrículos de volúmenes aumentados, función ventricular severamente deprimida en ausencia de aneurismas ventriculares y asincronía ventricular. Los resultados de la serología son positivos para Trypanosoma Cruzi siendo IgG positivo 1:512 y IgM negativo. El diagnóstico final: MIOCARDIOPATÍA CHAGÁSICA. 75
  67. 67. Enfermedad de Chagas Discusión. La enfermedad de Chagas ha estado confinada, hasta hace pocos años a los límites geográficos del continente americano, pero el incremento de los viajes al extranjero especialmente de los movimientos migratorios, han provocado un importante cambio epidemiológico. España se ha convertido, después de EEUU, en el segundo país receptor de latinoamericanos. Todo esto ha hecho que la infección por T. cruzi se convierta en una enfermedad emergente en países donde no existe la transmisión vectorial, pero sí la posibilidad de transmisión por otras vías diferentes. Es importante sospechar la enfermedad de Chagas en todo paciente procedente de zonas endémicas con sintomatología cardíaca y/o digestiva. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas, también llamada tripanosomiasis americana, es una enfermedad potencialmente mortal causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi. Descrita en 1909 por Carlos Chagas, descubre la presencia de T. cruzi en heces de insectos hematófagos durante una campaña de lucha contra la malaria en el estado de Minas Gerais, Brasil. Es una enfermedad asociada a la pobreza y a las malas condiciones de vivienda se encuentra ampliamente difundida, principalmente, en las áreas rurales de todo el continente latinoamericano. Está considerada como la enfermedad parasitaria con mayor carga económica en América Latina debido a su prolongada cronicidad. En general, los programas de control se han centrado hacia la eliminación de los insectos vectores más asociados al hábitat humano, y el paciente infectado ha sido relegado a un segundo plano. Se encuentra sobre todo en zonas endémicas de 21 países de América Latina, donde se transmite a los seres humanos principalmente por las heces de insectos triatomíneos conocidos como vinchucas, chinches o con otros nombres, según la zona geográfica (fig. 1). Por lo general, éstos viven en las grietas y huecos de las casas mal construidas en las zonas rurales y suburbanas. Normalmente permanecen ocultos durante el día y por la noche entran en actividad alimentándose de sangre humana. 76
  68. 68. Enfermedad de Chagas Figura 1. Familia Hemiptera reduviidae. Triatomino, vinchuca. El principal mecanismo de transmisión es vectorial, por hemípteros (chinches), de la Subfamilia Triatominae (con alimentación hematófaga). Las personas se infectan cuando un insecto infectado deposita las heces en la piel mientras duerme y la persona cuando se frota las picaduras, introduce accidentalmente las heces en la herida, un corte abierto, los ojos o la boca. Otras modalidades de transmisión son por transfusiones de sangre, congénita y trasplantes de órganos. Se calcula que en el mundo hay entre 7 y 8 millones de personas infectadas, la mayoría de ellas en América Latina, donde la enfermedad de Chagas es endémica. Con una incidencia anual de 28.000 casos en la región de las Américas, la enfermedad de Chagas afecta de unos 6 a 8 millones de personas y provoca, en promedio, alrededor de 12.000 muertes al año. Aunque la mortalidad ha disminuido de manera significativa, la enfermedad puede causar consecuencias irreversibles y crónicas en el corazón, tubo digestivo y sistema nervioso. Se estima que 65 millones de personas en las Américas viven en áreas de exposición y están en riesgo de contraer esta enfermedad. La enfermedad de Chagas se encuentra principalmente en América Latina, pero en las últimas décadas se ha observado con mayor frecuencia en los Estados Unidos de América, Canadá, muchos países europeos y algunos del Pacífico Occidental. Esto obedece sobre todo a la movilidad de la población entre América Latina y el resto del mundo (fig.2). 77

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