Estructura cristalina del dominio n quinasa de la gne acetil-manosa-amina

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Estructura cristalina del dominio n quinasa de la gne acetil-manosa-amina

  1. 1. Docente: MsC QF. ANGELICA MINAYAINTEGRANTES: CONTRERAS CASTAÑEDA, NANCY SALINAS PARDO, JESSICA GERRA CHUQUILLANQUI, JESSICA VASQUEZ CIEZA, MARITZA GONSALES CUADROS, ANAMELVA PONCE ISIDRO , ELIZABETH TERESA
  2. 2. ÁCIDO SIÁLICO El ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico es unmonosacárido acido derivado del ácido neuramínico (un compuesto base de 9 átomos de carbono) mediante acetilación. El ácido siálico está presente en los gangliósidos Se encuentra en la membrana plasmática de las células de los ganglios del SNC
  3. 3. BIOSÍNTESIS DEL ÁCIDOSIÁLICO Uridina difosfato Ácido N- N- acetilneuramínic acetilglucosamina o
  4. 4.  Se sintetiza mediante la epimerización de la UDP- N-acetilglucosamina en N-acetilgalactosamina, que acaba dando lugar a N-acetilmanosamina-6- fosfato. Esta última reacción es catalizada por la enzima UDP-GlcNAc 2-epimerasa/ManNAc 6- quinasa (GNE).
  5. 5. UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa ENZIMA BIFUNCIONAL IMPORTANTE PARA LA FORMACIÓN DEL ÁCIDO SIÁLICO GNE: Tiene 2 dominios Dominio C- Dominio N- terminal de terminal epimerasa quinasa Participa en la EPIMERASA síntesis del ácido Enzima que siálico utiliza ATPEs una enzima que convierte unamolécula en otro.
  6. 6. DOMINIO convierte UDP- GlcNAc a N-EPIMERASA acetylmannosamine (ManNAc) Fosforilado en posición 6 Al grupo DOMINIO ROK QUINASA (Represor, pertenece ORF, la quinasa)Conjunto de proteínasbacterianas
  7. 7. BIOSÍNTESISDEL ÁCIDOSIÁLICO Forma activa de Neu5Ac Citidina –monofosfato deacido n- acetil –(CMP –Neu5Ac)
  8. 8. Responsable de la formación Isoforma 1 básica de los ácidos siálicosTres isoformas de proteínas GNE Se han Isoformas 2 y 3 reducido las Para uso actividades de humano epimerasa Puede ajustar la Pero las actividades producción de quinasa permanecen casi ácidos siálicos intactas
  9. 9. CLONACION DE ADNLa clonación del ADN puede definirse como larecombinación in vitro de un fragmento deADN con un vector de ADN con capacidad dereplicación.El fragmento de ADN sereplicará junto con el vector de ADN en lacélula hospedadora y así será posible obtenerloen un número elevado de copias.
  10. 10. CLONACION DE ADN
  11. 11. OBTENCIÓN DEL ADNEl ADN podrá obtenerse mediante laextracción a partir de la célula, generalmente conla finalidad de construir una genoteca. Básicamente consiste en una lisis celular y la purificación del ADN,con la finalidad de que este resulte libre de contaminantes. Luego cromatografía y cristalografía
  12. 12. FRAGMENTACIÓN DEL ADN Las endonucleasas son enzimas que tienen como función reconocer y cortar el ADN foráneo. El ADN de la célula no se corta y esto es porque la secuencia que reconocería la enzima se encuentra metilada y por tanto no podrá actuar.
  13. 13. FRAGMENTACIÓN DEL ADN El conjunto formado por la metilasa y la endonucleasa es lo que se denomina sistema de modificación - restricción. Aunque los enzimas varían en algunos aspectos de sus condiciones de actuación, se ha observado que todos ellos requieren Mg y actúan a un Ph óptimo de entre 7.2 y 7.8.
  14. 14. FRAGMENTACIÓN DEL ADN
  15. 15. FRAGMENTACIÓN DEL ADNUna vez que se ha fragmentado el ADN,podemos separar el fragmento que nosinteresa mediante una electroforesis en gelde agarosa. Sin embargo debido a ladigestión obtendremos numerososfragmentos de distintos tamaños, por ello esmucho más práctico construir, antes declonar nuestro fragmento, una librería deADN
  16. 16. AMPLIFICACIÓN POR PCR La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que nos permite obtener artificialmente y de una forma más rápida, múltiples copias de nuestro fragmento de DNA. A medida que se repiten los ciclos los productos de DNA unidos a los cebadores se amplifican en proporciones geométricas: 2,4, 8, 16…
  17. 17. UNIÓN DEL ADN CLONADO AL VECTORUn vector es una molécula de DNA conun origen de replicación autónomo y Se utilizan elque posee zonas donde pueden vector(virusintroducirse fragmentos de ADN bacteriófagos)exógeno. Así, el ADN exógeno se pET28replica como parte del vector en la ósea virus decélula receptora y hospedadora. bacteria. Como todos los virus,La infección viral permite que un fago se hacecada célula hospedadora reproducir porcontenga muchas copias del la célula a lagen exógeno y que éste se cual infectaexprese abundantemente
  18. 18. TRANSFORMACIÓN DE LA CÉLULA HOSPEDERACuando el ADN exógeno ha sidoligado en el vector, debe entoncesintroducirse en la célula hospedadora.Las más usada es E. coli.Mediante este paso se puede formarnuevas copias de ADN o permitir lasíntesis de las proteínas cuyainformación contiene el ADN clonado.
  19. 19. EXTRACCIÓN DE LA PROTEÍNA HEPES o ácido 4 (2- hidroxietil), 1- piperazin- ethano-sulfónicoEn el presente trabajo, la E. coli fue cultivada enTerrífic Broth y después congeladas en nitrógenolíquido .Posteriormente fueron descongeladas yresuspendidas en tampón HEPES antes de laextracción de las proteínas. Las proteínas formadas por E. coli a partir del ADN clonado en su genoma, se extraen mediante lisis de su membrana celular y centrifugación. Con el propósito de separar las moléculas según su tamaño molecular.
  20. 20. PURIFICACION DE PROTEINASLas proteínas obtenidas mediantecentrifugación son captadas medianteperlas de níquel Ni, y luego son eluidasantes de pasar a la cromatografía deexclusión molecular.
  21. 21. PROCEDIMIENTOS1.Seleccionar al ADN2. Fragmentación del ADN 3. Amplificación del ADN con PCR. 4. Introducción del ADN en un vector. 5. Infección de bacterias E. coli con el vector. 6. Cultivo de E. Coli en Terrífic Broth. 7. Extracción de las proteínas.
  22. 22. PROCEDIMIENTOS8. Cromatografía de exclusión. 9. Cristalización con método de sitting-drop 10. Análisis cristalográfico.
  23. 23. CRISTALIZACION Es un proceso mediante el cual las moléculas se van a ordenar y van a formar los cristales.
  24. 24. GOTA COLGANTE
  25. 25. GOTA SENTADA
  26. 26. CRISTALIZACIÓN PORDIFRACCIÓN DE RAYOS X
  27. 27. Instrumentos Reactivoscristalización de difusión del vapor 5mM DE ADP19ID LINEA SE LUZ DE LA 1:100 quimiotripsina (w/w)Y 0.5ulADVANCED PHOTON SOURCE solución de proteína también(APS) EN NA LONG. DE ONDA DE contiene 15% de glicol0.9792ANSTRON polietileno(PEG)400COOTREFMAX de acetato de amonioPHENIX citrato de sodio 0.1 M, pH 5.6.MOLPROBITYADVANCED PHOTON SOURCE cristal SeMet se cultivo 14.555(APS) PEG4000,acetato de amonio0.2 M, 0.1M de citrato de sodio
  28. 28. ESTRUCTURA DEL DOMINIOQUINASA DE LA GNE  La estructura general adopta una tipica arquitectura bilobal.  Tanto el lóbulo –N como el lóbulo –C tienen la doble α/β.  Cada lóbulo consta de una β-hoja central flanqueada por alfa- hélices en ambos lados de la hoja.
  29. 29. ESTRUCTURA DEL DOMINIOQUINASA DE LA GNEEl dominio quinasa GNE contiene un motivo unido al zinc de tipo I que forma un tipo de dedo de zinc HC3 con residuos H569 y C579 y C581 y C586. El motivo de unión al zinc es un rasgo característico de todos los miembros de la familia ROK.El dominio de la quinasa también contiene un tipo de motivo DxGxT que se une al ATP y está localizado en la hendidura entre los dos lóbulos.
  30. 30.  El dominio quinasa de GNE es responsable de la dimerización, mientras que un segmento de los residuos entre la epimerasa y dominios quinasa, residuos 360- 382, es un sitio potencial para la trimerización. Datos obtenidos por filtración en gel muestran que el dominio quinasa existe principalmente como un dímero en la solución, con pequeñas cantidades de monómero y un oligómero de orden superior. El peso molecular aparente del oligómero se ajusta a un hexámero del dominio quinasa, aunque no se puede descartar la posibilidad de un tetrámero.
  31. 31. DÍMERO DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNE A: Representación del dímero del dominio quinasa de la GNE B: Vista ortogonal de la superficie de un monómero
  32. 32. ANÁLISIS OLIGOMÉRICO DEL DOMINIO QUINASA DE LA GNEA: Hexámerocristalográfic o obtenido por rotaciónde un trímero.
  33. 33. HEXÁMERO CRISTALOGRÁFICO DE LA GNE B: Vista desde abajo del hexámero cristalográfico tras un giro de 90 grados.
  34. 34.  La búsqueda de homología estructural del dominio quinasa de la GNE con el FatCat del servidor reveló los cuatro primeros éxitos no redundantes como los códigos PDB 2aa4, 1xc3, 1z05 y 1z6r.Todas estas estructuras contienen el característico motivo vinculado a zinc de la familia de los ROK.
  35. 35.  A: Alineación estructural de la quinasa de GNE (rojo, 3eo3) con la glucoquinasa de E. coli + complejo de glucosa (gris, 1sz2).
  36. 36.  B: Alineación estructural del segmento vinculado al azúcar en las dos proteínas (GNE y glucoquinasa de E. coli). Se indican los residuos clave (verde), los residuos unidos al zinc (azul) y los residuos cuya mutación está implicada con el HIBM (rojo).
  37. 37. Al comparar la GNE con la glucoquinasade E. coli (AP: 1sz2), la más cercanaestructura homóloga según la base dedatos PDB, se observa que los cincoresiduos implicados en la unión deazúcar se conservan en GNE (N516,D517, E566, H569, E588, numeraciónde GNE). Dos residuos, H569 y E588,están situados en el motivocaracterístico vinculado a zinc de lafamilia ROK y H569 directamentecoordina el ion zinc.
  38. 38. ANALISIS ESTRUCTURAL DE MUTTACIONES PUNTIFORMESASOCIADASA HIBM EN EL DOMINIO QUINASA DE GNE
  39. 39. MUTACIONES PUNTIFORMESTIPO I EN EL DOMINIO QUINASADE LA GNE• Está formado por los residuos I557, G559, V572 y G576; los dos últimos se encuentran en la interfase de dimerización del lóbulo -C y la mutación de estos residuos pueden interferir con la dimerización del dominio quinasa.• La dimerización del dominio quinasa no afecta la accesibilidad disolvente de G576, indicando que G576 no está directamente implicada en la dimerización.
  40. 40. MUTACIONES PUNTIFORMES TIPO II EN EL DOMINIO QUINASA DE LA GNE El segundo grupo de residuos incluye los situados en las hélices interfaciales entre el lóbulo -N y el lóbulo-C, es decir, N519, A524, F528, G708, y M712. Como éste es el sitio de unión al ATP y los hidratos de carbono, la mutación de estos residuos puede cambiar el movimiento interlobular durante la catálisis y por lo tanto afectar a la actividad de la quinasa de la proteína.
  41. 41. MUTACIONES PUNTIFORMES TIPOIII EN EL DOMINIO QUINASA DE LAGNE El tercer grupo incluye al residuo P511, el cual tiene la mayor accesibilidad relativa como disolvente (> 40%) de los 23 sitios de mutación y está situado en una región de bucle de la estructura. La mutación de una prolina a cualquier otro tipo de residuo, va a cambiar la flexibilidad de la región de bucle alrededor de este residuo y podría cambiar el alosterismo de longitud completa de GNE en el estado oligomérico de orden superior.
  42. 42. MUTACIONES PUNTIFORMES TIPO IV EN EL DOMINIO QUINASA DE LA GNE El cuarto grupo de residuos incluye todo el resto de los sitios de mutación. Todos tienen cadenas laterales hidrófobas y de baja accesibilidad a solventes, y se encuentran dentro de los elementos estructurales secundarios. Las mutaciones de estos residuos podrían interferir con las interacciones hidrofóbicas de los elementos de la estructura secundaria que estabilizan la estructura de la proteína cuaternaria.
  43. 43. Son trastornos neuromuscularescaracterizados por debilidad muscular esmás común en la etapa del adultoEn lo cual se ve comprometiendolos cuádriceps y los flexoresprofundos de los dedos de lamano.
  44. 44. INCLUSIÓN MIOPATÍA HEREDITARIA DEL CUERPO (HIBM)Miopatías hereditarias comprenden tanto autonómicarecesiva y autonómica dominante de trastornosmusculares que tienen una expresión variable( fenotipo ) en los pacientes individuales
  45. 45. CLASIFICACIO NUna forma autosómica dominante (IBM1), dondelos cuádriceps son uno de los primeros músculos que sedebiliten.Una forma autosómica recesiva como Nonaka miopatía distal
  46. 46. MIOPATIA DISTAL TIPO NONAKAGenéticamente la miopatía distal de Nonaka se heredaen forma autosómica recesiva y el defecto genético seha localizado en el cromosoma 9p1-q1(23Se caracteriza por ser una Enfermedad de los músculosdistales porque afectan sobre todo a las extremidades.
  47. 47. COMO SE MANIFIESTALa afectación se manifiestan presentando debilidad muscular en elcompartimento anterior de las piernas, y en los músculos extensores. Lospacientes presentan pie caído con mucha dificultad de flexionar. tambiénpuede originar deformaciones articulares. Posteriormente se ven afectadoslos muslos y los miembros superiores.
  48. 48. ¿CUAL ES LA CAUSA?La miopatía de Nonaka está asociada a la alteración del gen GNE(UDP-N-acetilglucosamina-2-epimera-sa/N-acetilmanosaminaquinasa) ) implicada en la ruta biosintética del ácido siálico .es deciroriginando carencia de acido sialico
  49. 49. SIGNOS Y SINTOMAS• Calambres• Dificultad para caminar sobre los talones• Dificultad para correr• Pérdida de equilibrio.• Miotonia• Fatiga
  50. 50. DIAGNOSTICOEl diagnóstico clínico de la HIBM seconfirma:• Estudio electrofisiológico (EMG)• Examen de sangre para la creatina quinasa sérica (CK o CPK)• Biopsia muscular• Resonancia Magnética (RM) o tomografía computarizada (TC)
  51. 51. CONCLUCIONESEl dominio Quinasa de la Proteína GNE esla única proteína humana conocida queforma parte del grupo de proteínasbacterianas ROK Al comparar la proteína GNE con otras proteínas estudiadas como las proteínas ROK, se revelo que hay sitios en común que son básicamente los Sitios de Unión a Sustrato ubicados en la Fisura Interlobular y también en lo referido al Motivo unido al Zinc
  52. 52. CONCLUCIONESSe han encontrado MutacionesPuntiformes asociadas con la MiopatíaHereditaria con Cuerpos de Inclusión(HIBM). La estructura cristalina del dominio Quinasa de la GNE es la base para comprender las Mutaciones causantes de enfermedades como la Miopatía de Cuerpos de Inclusión (HIBM

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