CÈL·LULES MARE I MEDICINA REGENERATIVA Begoña Aran Banc de Línies Cel·lulars Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona
CÉLULAS MADRE <ul><li>   Se trata de células   indiferenciadas   que  se han localizado en  la masa celular interna del  ...
células madre adultas <ul><li>son células  indiferenciadas  que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capac...
células madre adultas <ul><li>su frecuencia   es   baja,   son difíciles de   identificar y purificar,   su proliferación ...
células madre fetales <ul><li>se trata de  tipos celulares primitivos  que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse...
células madre embrionarias <ul><li>son las que derivan de la  masa celular interna  (MCI) de un blastocisto (día +5/6 de d...
In vitro In vivo
 
HISTORIA <ul><li>   1878   Intentos de Fecundación  in Vitro ovocitos de mamífero </li></ul><ul><li>   1959  1º éxito de...
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad Autorenovación Diferenciación Division asimétrica
Modelo de enfermedades y desarrollo de fármacos Terapia celular Estudio del desarrollo y organogénesis
<ul><li>ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR  POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM </li></ul><ul>...
 
<ul><li>Consentimiento informado de las parejas </li></ul><ul><li>Aprobación del Comité Ético </li></ul><ul><li>Aprobación...
Eliminación de la    zona pellucida - 5mg/ml pronasa - Ac. Tyrode’s  Eliminación del trofectodermo  mediante inmunocirugía...
Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de ...
Derivación ES [2] p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x) p1 d2 (4x) p1 d6 (4x ) p0 d12 (10x)
 
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS <ul><li>CULTIVO </li></ul><ul><li>Bajo condiciones adecuadas de cultivo (cultivo sobre fibrobla...
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS <ul><li>DERIVACIÓN Y CULTIVO </li></ul><ul><li>Es imprescindible para poder utilizar las líneas...
Fosfatasa alcalina cariotipo Microsatélites & HLA  Actividad Telomerasa Immunocitoquimica  para marcadores de diferenciaci...
cariotipo
 
 
CARACTERIZACIÓN :  Diferenciación  in vitro Embryoid bodies  <ul><li>3 líneas germinales: </li></ul><ul><li>Ectodermo: neu...
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vitro Ectodermo: beta-tubulina
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vitro Endodermo: Alfa-feto proteina
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vitro Mesodermo: alfa-actinina
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vivo Teratomas <ul><li>Ratones SCID de 8 semanas </li></ul><ul><li>1millón células </...
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vivo Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio) Endodermo (epitelio resp...
CARACTERIZACIÓN:  Diferenciación  in vivo
DIFERENCIACIÓN  Quedan por establecer los   factores genéticos y/o ambientales   que controlan el desarrollo de las CME y ...
Diferenciación de las CME <ul><li>ADIPOCITOS </li></ul><ul><li>ASTROCITOS </li></ul><ul><li>CARDIOMIOCITOS </li></ul><ul><...
<ul><li>PROBLEMAS TÉCNICOS   </li></ul><ul><li>Diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación: control del crecim...
TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO <ul><li>Como evitarlo? </li></ul><ul><li>Uso de fármacos inmunosupresores </li></ul...
<ul><li>   CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA DE NÚCLEO   </li></ul><ul><li>Producción de un individuo genéticamente idéntico po...
<ul><li>   Nacimiento  del primer mamífero superior a partir de una célula de un individuo  adulto </li></ul><ul><li>   ...
CLONACIÓN TRANSFERENCIA DE NUCLEAR (SCNT) embrión Transferencia a oveja portadora Dolly célula de glándula mamária Transfe...
Transferencia nuclear <ul><li>Pluripotentes </li></ul><ul><li>Paciente-compatibles (mitocondria?) </li></ul><ul><li>No aún...
 
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
Reprogramación de células somáticas (IPS) <ul><li>Paciente-compatible </li></ul><ul><li>No problemas éticos </li></ul><ul>...
KIPS: Generación a partir de keratinocitos Aasen, 2008 Nat Biotech.  Keratinocitos Dia 0 Pequeña colonia ES-like 10 días  ...
BANCOS DE IPS  Daley Q. et al. Cell 2008 <ul><li>Las iPS paciente-específicas podrían representar modelos experimentales p...
 
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CèL·Lules Mare Sunion

  1. 1. CÈL·LULES MARE I MEDICINA REGENERATIVA Begoña Aran Banc de Línies Cel·lulars Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona
  2. 2. CÉLULAS MADRE <ul><li> Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto , en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos. </li></ul><ul><li> Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados. </li></ul><ul><li> Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular </li></ul>
  3. 3. células madre adultas <ul><li>son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen. </li></ul><ul><li>algunas pueden ser pluripotentes. </li></ul><ul><li>se encuentran en hígado, médula osea, pancreas, piel, cerebro, sangre… </li></ul>
  4. 4. células madre adultas <ul><li>su frecuencia es baja, son difíciles de identificar y purificar, su proliferación es limitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado. </li></ul>
  5. 5. células madre fetales <ul><li>se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitores </li></ul><ul><li>de islotes pancreáticos . </li></ul>
  6. 6. células madre embrionarias <ul><li>son las que derivan de la masa celular interna (MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo, </li></ul><ul><li> 150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo . </li></ul>MCI
  7. 7. In vitro In vivo
  8. 9. HISTORIA <ul><li> 1878 Intentos de Fecundación in Vitro ovocitos de mamífero </li></ul><ul><li> 1959 1º éxito de Fecundación in Vitro (FIV) (conejo) en USA </li></ul><ul><li> 1968 1º intento de FIV en humanos </li></ul><ul><li> 1978 1º nacimiento de FIV en humanos (Edwards y Steptoe-Louise Brown) </li></ul><ul><li> 1984 Nacimiento España (Victoria Anna) </li></ul>
  9. 10. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS
  10. 11. Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad Autorenovación Diferenciación Division asimétrica
  11. 12. Modelo de enfermedades y desarrollo de fármacos Terapia celular Estudio del desarrollo y organogénesis
  12. 13. <ul><li>ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM </li></ul><ul><li> Alteraciones neurodegenerativas </li></ul><ul><li> Accidentes vasculares </li></ul><ul><li> Lesiones medulares </li></ul><ul><li> Fallo cardíaco </li></ul><ul><li> Diabetes mellitus </li></ul>
  13. 15. <ul><li>Consentimiento informado de las parejas </li></ul><ul><li>Aprobación del Comité Ético </li></ul><ul><li>Aprobación de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III (Madrid) </li></ul><ul><ul><li>Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B] </li></ul></ul><ul><ul><li>Centros de Reproducción Asistida </li></ul></ul>Proyecto: Derivación de CME en condiciones libres de xenobiòticos y caracterización in vivo de su pluripotencialidad
  14. 16. Eliminación de la zona pellucida - 5mg/ml pronasa - Ac. Tyrode’s Eliminación del trofectodermo mediante inmunocirugía (anticuerpos) Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC) , en placas cubiertas de gelatina (0.1%) Feeders cells Descongelación embriones Cultivo hasta blastocisto D+5/6 Derivación células madre embrionarias
  15. 17. Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%) Derivación células madre embrionarias CULTIVO KO-DME Medium supplementado con: 2 mmol/l Glutamax 0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF) 1% non-essential amino acids 20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin 37ºC y 5%CO2
  16. 18. Derivación ES [2] p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x) p1 d2 (4x) p1 d6 (4x ) p0 d12 (10x)
  17. 20. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS <ul><li>CULTIVO </li></ul><ul><li>Bajo condiciones adecuadas de cultivo (cultivo sobre fibroblastos de ratón - humanos, Matrigel, Fibronectina), las CME mantienen su estado indiferenciado indefinidamente . </li></ul>
  18. 21. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS <ul><li>DERIVACIÓN Y CULTIVO </li></ul><ul><li>Es imprescindible para poder utilizar las líneas celulares establecidas que los cultivos se lleven a cabo con métodos libres de soporte animal (anticuerpos y complemento inmunocirugia, feeders, suero, etc) </li></ul>
  19. 22. Fosfatasa alcalina cariotipo Microsatélites & HLA Actividad Telomerasa Immunocitoquimica para marcadores de diferenciación In vitro Formación de cuerpos embrioideos Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo (formación teratomas) Caracterización Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad
  20. 23. cariotipo
  21. 26. CARACTERIZACIÓN : Diferenciación in vitro Embryoid bodies <ul><li>3 líneas germinales: </li></ul><ul><li>Ectodermo: neuronas </li></ul><ul><li>Endodermo: miocardiocitos </li></ul><ul><li>Mesodermo: tejido glandular </li></ul>
  22. 27. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Ectodermo: beta-tubulina
  23. 28. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Endodermo: Alfa-feto proteina
  24. 29. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina
  25. 30. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Teratomas <ul><li>Ratones SCID de 8 semanas </li></ul><ul><li>1millón células </li></ul><ul><li>intramuscular </li></ul><ul><li>subcutáneo </li></ul><ul><li>en algunos órganos </li></ul><ul><li>2 meses </li></ul>
  26. 31. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio) Endodermo (epitelio respiratorio) Mesodermo (Cartilago)
  27. 32. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
  28. 33. DIFERENCIACIÓN Quedan por establecer los factores genéticos y/o ambientales que controlan el desarrollo de las CME y su importancia durante los distintos estadíos de diferenciación
  29. 34. Diferenciación de las CME <ul><li>ADIPOCITOS </li></ul><ul><li>ASTROCITOS </li></ul><ul><li>CARDIOMIOCITOS </li></ul><ul><li>CONDROCITOS </li></ul><ul><li>CÉL. HEMATOPOYÉTICAS </li></ul><ul><li>CÉL. DENDRÍTICAS </li></ul><ul><li>CÉL. ENDOTELIALES </li></ul><ul><li>KERATINOCITOS </li></ul><ul><li>HEPATOCITOS </li></ul><ul><li>PRECURSORES LINFOCITOS </li></ul><ul><li>MASTOCITOS </li></ul><ul><li>NEURONAS </li></ul><ul><li>OLIGODENDROCITOS </li></ul><ul><li>OSTEOBLASTOS </li></ul><ul><li>ISLOTES PANCREÁTICOS </li></ul><ul><li>MÚSCULO LISO </li></ul><ul><li>MÚSCULO ESTRIADO </li></ul><ul><li>TROFECTODERMO </li></ul>*gametos (ratón)
  30. 35. <ul><li>PROBLEMAS TÉCNICOS </li></ul><ul><li>Diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación: control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular para asegurar procesos estables </li></ul><ul><li>Desarrollo tisular inadecuado </li></ul><ul><li>Aparición de tumores </li></ul><ul><li>Aislamiento y purificación </li></ul><ul><li>Rechazo inmunológico </li></ul><ul><li>Funcionalidad y viabilidad </li></ul><ul><li>Condiciones de cultivo (GMP) </li></ul>
  31. 36. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO <ul><li>Como evitarlo? </li></ul><ul><li>Uso de fármacos inmunosupresores </li></ul><ul><li>Uso de células HLA compatibles: bancos de CM </li></ul><ul><li>Inducción de inmunotolerancia: administración previa de material embrionario o hematológico del donante </li></ul><ul><li>CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear </li></ul>
  32. 37. <ul><li> CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA DE NÚCLEO </li></ul><ul><li>Producción de un individuo genéticamente idéntico por transferencia del núcleo de una célula somática a un ovocito del cual se ha eliminado el núcleo </li></ul>
  33. 38. <ul><li> Nacimiento del primer mamífero superior a partir de una célula de un individuo adulto </li></ul><ul><li> Oveja, macaco, cerdo, vaca, gato, ratón, conejo, mula, ciervo, caballo, cabra, perro </li></ul>TRANSFERENCIA NUCLEAR Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells I. Wilmut, A. E. Schnieke * , J. McWhir, A. J. Kind *  & K. H. S. Campbell Roslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK * PPL Therapeutics, Roslin, Midlothian EH25 9PP, UK Dolly y su madre portadora   Nature 385 , 810 - 813 (27 February 1997)                                                                                                
  34. 39. CLONACIÓN TRANSFERENCIA DE NUCLEAR (SCNT) embrión Transferencia a oveja portadora Dolly célula de glándula mamária Transferencia a ovocito enucleado
  35. 40. Transferencia nuclear <ul><li>Pluripotentes </li></ul><ul><li>Paciente-compatibles (mitocondria?) </li></ul><ul><li>No aún en humanos </li></ul><ul><li>Problemas éticos </li></ul>Ovocito MII Enucleación Transferencia nuclear y activación Blastocisto Derivacion CME Byrne et al., 2007
  36. 42. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
  37. 43. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
  38. 44. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
  39. 45. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad
  40. 46. Reprogramación de células somáticas (IPS) <ul><li>Paciente-compatible </li></ul><ul><li>No problemas éticos </li></ul><ul><li>Disponible en humanos </li></ul><ul><li>Pluripotentes ? </li></ul><ul><li>Integración medianter vector (virus) </li></ul><ul><li>Segura? Activación oncogenes, transmisión línea germinal?) </li></ul>Fibroblastos Células ES-like Takahashi et al., 2007 Nakagawa et al., 2007 Park et al., 2007 Integración genes (virus)
  41. 47. KIPS: Generación a partir de keratinocitos Aasen, 2008 Nat Biotech. Keratinocitos Dia 0 Pequeña colonia ES-like 10 días post-infección Típica colonia iPS 20 días post-infección Colonias iPS AP positivas
  42. 48. BANCOS DE IPS Daley Q. et al. Cell 2008 <ul><li>Las iPS paciente-específicas podrían representar modelos experimentales para estudiar distintas enfermedades, ensayar tratamientos y posibles terapias génicas. </li></ul><ul><li>Se han generado ya 11 líneas distintas de iPS procedentes de pacientes con enfermedades graves: enfermedades neurodegenerativas, metabólicas, cardiovasculares, diabetes. </li></ul>
  43. 50. Moltes gràcies per la vostra atenció [email_address]

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