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Reacción en cadena de la polimerasa (pcr

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Reacción en cadena de la polimerasa (pcr

  1. 1. [PCR] PCR DEFINICION DEFINICION CONT REQUISITOS DE PCR ADN MOLD E PRIMERS TAQ POLIMERASA MG d N T P s s o l u c i o n b u f f e r t e r m o c i c l a d o r p a s o s d e p c r d e s n a t u r a l i z a c i o n h i b r i d a c i o n e l o n g a c i o n a m p l i f i c a c i o n a n a l i s i s d e m u e s t r a t i p o s d e p c r a p l i c a c i o n e s v e n t a j a s d e s v e n t a j a s r e f e r e n c i a s
  2. 2. Biología Molecular Bioq. Jans Velarde Negrete
  3. 3. Es una técnica desarrollada por el biólogo Kary Mullis, diseñada para amplificar de forma directa una región específica de DNA o indirecta de un ARN a través de su ADN complementario. Al producto final obtenido de la amplificación se lo denomina Amplicón. Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.
  4. 4. La PCR es una reacción en cadena porque el número de cadenas nuevas de DNA se dobla a cada ciclo, y las nuevas cadenas, junto con las viejas, sirven de molde para el siguiente ciclo.
  5. 5.  DNA molde.  Primers o cebadores.  Enzima DNA polimerasa.  Mg ++  Agua libre de nucleasas.  Solución buffer.  dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)  Termociclador.
  6. 6.  El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble, circular o lineal. En caso de desear amplificar una secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una transcriptasa reversa.  El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.  No necesariamente puro, pero libre de altas concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes.  La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la reacción de PCR.
  7. 7.  Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.  Deben ser específicos.  No deben presentar auto-complementariedad.  No deben ser complementarios entre ellos.  El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%. 5´ 5´ 3´ 3´ Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as)
  8. 8.  Taq ADN polimerasa es aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas termales).  Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de molde.  Necesitan la presencia de Mg para funcionar.
  9. 9.  Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas  La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:  Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacción  Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 % complementarios, afectando la especificidad y el rendimiento de la reacción
  10. 10.  Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que varían entre 200 – 250 μM de c/u.  No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto final
  11. 11.  El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.  pH 8.3 es el óptimo para Taq.  El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es enzimáticamente activa.
  12. 12.  Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
  13. 13.  Desnaturalización.  Hibridación.  Elongación.
  14. 14.  Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.
  15. 15.  Los “primers”, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases.
  16. 16.  Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde
  17. 17.  La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante electroforesis.  Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.  La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV). Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)
  18. 18.  PCR-semicuantitativa  PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo real)  RT-PCR  PCR-multiplex.  PCR-anidada.  PCR-aleloespecífica.  PCR-mutagénesis dirigida
  19. 19.  Rastreo de mutaciones.  Diagnóstico de enfermedades.  Detección de organismos infecciosos.  Medicina forense y determinación de paternidad.  Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en Tiempo Real)  Polimorfismo de secuencia.
  20. 20.  La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de días, en comparación con la clonación basada en células.  El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos también es rápida y económica.  Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de pequeñas muestras de DNA prácticamente indetectables.  También se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o imposible con las técnicas de clonación convencional.
  21. 21.  Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de nucleótidos del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con DNA de otras fuentes, por pequeña que sea, puede causar problemas.  Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos.  Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados cuidadosamente diseñados.
  22. 22.  http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml http://www.slideshare.net/rild27/reaccin-en-cadena-de-la-polimerasa  http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/PCR.p df  http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf  http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3% B3n6.pdf

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