TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

1. Jans Velarde Negrete
Técnicas de Biología Molecular

2. Es una técnica desarrollada por el biólogo Kary Mullis, diseñada para
amplificar de forma directa una región específica de DNA o indirecta de un
ARN a través de su ADN complementario. Al producto final obtenido de la
amplificación se lo denomina Amplicón.
Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.

3. La PCR es una reacción en cadena porque el número de cadenas nuevas de
DNA se dobla a cada ciclo, y las nuevas cadenas, junto con las viejas, sirven
de molde para el siguiente ciclo.

4. DNA molde.
Primers o cebadores.
Enzima DNA polimerasa.
Mg ++
Agua libre de nucleasas.
Solución buffer.
dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)
Termociclador.

5. El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble,
circular o lineal. En caso de desear amplificar una
secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una
transcriptasa reversa.
El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000
nucleótidos de longitud.
No necesariamente puro, pero libre de altas
concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar
como quelantes.
La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la muestra
de partida. Demasiada cantidad de ADN puede inhibir la
reacción de PCR.

6. Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
Deben ser específicos.
No deben presentar auto-complementariedad.
No deben ser complementarios entre ellos.
El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as)
5´ 3´
3´ 5´

7. TaqADN polimerasa es aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas
termales).
Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de
molde.
Necesitan la presencia de Mg para funcionar.

8. Mg++ es un cofactor de DNApolimerasas
La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la
polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
 Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el
rendimiento de la reacción
 Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 %
complementarios, afectando la especificidad y el rendimiento de la
reacción

9. Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que varían entre 200 – 250
μM de c/u.
No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando
complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la
enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto
final

10. El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.
pH 8.3 es el óptimo para Taq.
El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es
enzimáticamente activa.

11. Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de
los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.

12. Desnaturalización.
Hibridación.
Elongación.

13. Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en
hebra sencilla.

14. Los “primers”, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares específicos por complementariedad de bases.

15. Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de 5’a
3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNAmolde

17. La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante
electroforesis.
Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que
deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a
distintas concentraciones.
La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio
(lámpara de luz UV).
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)

18. PCR-semicuantitativa
PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo real)
RT-PCR
PCR-multiplex.
PCR-anidada.
PCR-aleloespecífica.
PCR-mutagénesis dirigida

19. Rastreo de mutaciones.
Diagnóstico de enfermedades.
Detección de organismos infecciosos.
Medicina forense y determinación de paternidad.
Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en TiempoReal)
Polimorfismo de secuencia.

20. La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de
días, en comparación con la clonación basada en células.
El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un
programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos
también es rápida y económica.
Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de
pequeñas muestras de DNA prácticamenteindetectables.
También se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente
degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que
están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o
imposible con las técnicas de clonación convencional.

21. Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de nucleótidos
del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con DNA de
otras fuentes, por pequeña que sea, puede causarproblemas.
Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden
contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas
de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos.
Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados
cuidadosamente diseñados.

22. Enzimas de restricción

23. Introducción
• Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en
investigación clínica, desde la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction
fragment length polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación
de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para la
generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina.
• Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan los enlaces
fosfodiéster del ADN en una secuencia especifica denominada secuencia diana. El uso de estas enzimas como
herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las largas cadenas de ADN genómico para manipularse
y analizarse en fragmentos mas pequeños.
• El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como la ligasa, permitio
desarrollar la metodología del ADN recombinante.

24. Origen de las enzimas de restricción
• Las endonucleasas de restricción forman parte de la maquinaria con la que
cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales.
• El ADN de la bacteria que produce la enzima de restricción no se ve afectado por
su propia enzima, ya que las bacterias metilan determinadas secuencias a su
propio ADN para diferenciarlo del ADN viral por medio de una enzima
metiltransferasa en bases especificas, que generalmente son las reconocidas por
sus propias enzimas de restricción.

25. Nomenclatura
1. Tres letras en cursiva que corresponden al nombre científico de la bacteria de donde fue atraída (p. ej., Escherichia
coli (Eco); Haemophilus infl uenzae (Hin), etc.). La primera letra, en mayúscula, corresponde al genero; las otras dos, a la
especie.
2. La cepa o estirpe, si la hubiese (p. ej., EcoR, aislada de la cepa “RY13” de E. coli).
3. En números romanos, un numero para distinguir si hay mas de una endonucleasa aislada de esa misma especie (p. ej.,
EcoRI, EcoRV).
4. Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa, según la función de la enzima, pero
generalmente se omite. Por ejemplo:
Hind III:
H = genero Haemophilus. in = especie infl uenzae. d = cepa DSM 11121. III = tercera endonucleasa aislada en
este organismo.
• Eco RI:
• E = genero Escherichia.
• co = especie coli.
• R = cepa RV 13.
• I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.

26. Clasificación de enzimas de restricción
Tipo I
Las enzimas que pertenecen a este grupo reconocen una secuencia especifica de nucleótidos y hacen un corte
aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de
corte; además tienen la función de metilar su propio genoma.
Tipo II
Son enzimas que reconocen secuencias especificas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de
reconocimiento.
Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas son palindrómicas, es decir, son secuencias que se leen igual en
las dos cadenas de ADN. Por ejemplo: Por ejemplo:
5’ GGATCC 3’GATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’CCTAGG 5’
Tipo III
Estas enzimas reconocen una secuencia especifica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana
(aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del sitio de reconocimiento).

27. Aplicaciones de las enzimas de restricción
• Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética; se
utilizan, entre otros fines, para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas.
• Un mapa de restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con
determinada(s)
• enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos para la caracterizacion
de dicho ADN.
• Esta herramienta es sumamente importante para la clonación con vectores.
• También, en estudios de determinación de polimorfismos, como la técnica de RFLP , según se
presente o no el sitio de corte de una enzima de restricción, se puede establecer la variante
alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos de ADN generado(s) permitirá la
caracterización de la secuencia.
• Asimismo, la construcción de moléculas de ADN recombinante implica el obvio empleo de las
enzimas de restricción para definir y delimitar las secuencias que se insertaran en el constructo
recombinante.

28. Familias de enzimas de restricción
• Una familia de enzimas de restricción esta formada por aquellas que no
necesariamente reconocen la misma secuencia diana, pero producen extremos
cohesivos similares.
• Un ejemplo de familia es: BamHI y BclII, que reconocen las secuencias diana
5’GGATCC3’ y 5’AGATCT3’, respectivamente, pero que generan extremos
cohesivos idénticos: 5’GATC3’.
• BamH I: 5’---G GATCC---3’
• 3’---CCTAG G---5’
• Bgl II: 5’---A GATCT---3’
• 3’---TCTAG C---5’
• Esta característica favorece que dos fragmentos cortados con estas enzimas
puedan recombinarse de manera
• especifica gracias a la complementariedad de sus bases en los extremos
cohesivos generados.

29. Factores que afectan la actividad de las enzimas de
restricción
Entre los factores que mas afectan la actividad de las enzimas de restricción se encuentran:
• La pureza biológica del ADN. Contaminación de la muestra con otros ADN impide el buen
funcionamiento de las enzimas.
• Los contaminantes como detergentes y estabilizadores (docedilsulfato de sódio –SDS–, acido
etilendiaminotetraacetico –EDTA–), ya que concentraciones elevadas de sales y detergentes inhiben la
actividad enzimática.
• Modificaciones en el pH y temperatura de incubación. Variaciones leves en estos parámetros inhiben
enormemente la actividad de las enzimas.
• El grado de metilación del ADN, ya que algunas enzimas son inhibidas por metilación en ciertas
secuencias.

30. Técnicas de hibridación

31. Southern blot
Edwin Southern, en 1975.
Fundamento
Es una estrategia estándar para analizar ADN
previamente digerido con enzimas de restricción.
Se basa en la aplicación de dos procesos
fundamentales:
1. la desnaturalización o separación de las
cadenas complementarias del ADN
2. la hibridación o unión de dos cadenas
complementarias.

34. Utiliza ADN.
Utilizan enzimas de restricción.
PASOS
1. Electroforesis.
2. Desnaturalización.
3. Transferencia
4. Hibridación con una sonda.
Southern blot Northern blot
Utiliza ARN.
No se utilizan enzimas de restricción.
PASOS
1. Electroforesis.
2. Desnaturalización.
3. Transferencia.
4. Hibridación con una sonda.

35. Estudio de los productos de la
transcripción génica (ARNm) y
de su regulación
Estudia las potenciales
variaciones en la abundancia de
especies del ARN.
Identifica genes asociados con
enfermedades de transmisión
genética,
Identifica mutaciones, como
rearreglos, deleciones y dosis
génica en caso de portadores.
También se utiliza para detectar
polimorfismos.
Southern blot Northern blot

36. Hibridación in situ
Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de
la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos
de la inmunología. Los principios de ambos métodos son
semejantes y el resultado final es el mismo: la identificación de
componentes tisulares que pueden observarse al microscopio.
La especificidad de la inmunohistoquímica se basa en la unión
antígeno/anticuerpo, mientras que la especificidad de la
hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una
secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido.
A diferencia de Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ
no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino que en el
mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e
hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar).

37. Aspectos técnicos
El primer paso para la hibridación es la preparación y fijación del tejido, en el cual deben
conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la morfología del tejido y
permitir una accesibilidad suficiente para que la sonda penetre.
La fijación con formalina, seguida de una inclusión con parafina es el procedimiento más usado.
Después de la fijación las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben
desprenderse durante el procedimiento de hibridación.
Normalmente se utiliza gelatina crómica, polilisina o Vectabond® (producto comercial).
Aplicaciones
La hibridación in situ tiene un alto grado de resolución, que permite la localización de secuencias
génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones
cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular.
Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo
cromosómico.

38. Clonación

39. Clonación humana
El desarrollo de tecnologías de clonación de organismos multicelulares ha llevado al hombre a
imaginar hipótesis inspiradas en el deseo de mejorar la especie humana, como son: multiplicar
individuos dotados de un gran ingenio, bellezas excepcionales, selección de individuos sanos e
inmunes a enfermedades genéticas, posibilidad de selección del sexo, obtención de órganos para
trasplantes y reproducción de familiares difuntos.
Aunque por medio de la clonación se obtendrían individuos genéticamente idénticos, el desarrollo
psicológico, la cultura y el ambiente conducen siempre a personalidades diversas, por lo que
clonación no significa identidad del individuo.
Este hecho fue plasmado en el cine en 1978, en la película Los niños del Brasil, del director Franklin
J. Schaff - ner, basada en una novela del escritor Ira Levin.
En dicha historia se generaron más de 90 clones de un individuo; lo interesante de esto es que el
experimento no culmina con la clonación sino que comienza un proceso de adaptación al colocar a
estos clones en el seno de familias muy parecidas a las del individuo clonado.

40. Clonación animal
Como es conocido por todo el mundo, el objetivo principal de la clonación animal es económico:
mejora de la productividad y calidad de la ganadería y la agricultura, así como producción de
proteínas de interés médico mediante la multiplicación de animales transgénicos.
Por mencionar algunos ejemplos, al encontrarse con un espécimen de alta calidad en un rebaño, lo
lógico es que se quisiera tener el mismo ejemplar en grandes cantidades, pero por desgracia junto
con las cualidades también se acarrean ciertas deficiencias.
Cuando se tiene variedad genética en un rebaño y éste se ve afectado por una infección, pueden
resultar afectados un gran número de individuos; sin embargo, si todos son clones, lo más probable
es que se vea afectado todo el rebaño.

41. Clonación de la oveja Dolly
Para lograr clonar a la oveja Dolly se llevaron a cabo los siguientes pasos: se obtuvieron y cultivaron
in vitro células de la glándula mamaria (la ubre) de una oveja adulta de raza Finn Dorset (oveja con
cara blanca); estas células somáticas diferenciadas y en fase G0 de ciclo celular se fusionaron con
óvulos a los que previamente se les había extraído el núcleo (óvulos anucleados), provenientes de
una oveja de raza Scottish Blackface (con cara negra).
A estos óvulos, a los cuales se les introdujo el material genético proveniente del núcleo de células
mamarias, se les activó utilizando una leve descarga eléctrica, induciéndolas a dividirse.
Cuando los embriones llegaron a poseer entre ocho y 16 células (estadio de mórula), se implantaron
en el útero de otras ovejas Scottish Blackface.
Transcurridos 148 días nació un cordero de 0.6 kg de peso, totalmente blanco, al cual
posteriormente se le llamó Dolly, el primer mamífero obtenido a partir de una célula tomada de un
individuo adulto.

42. Terapia génica

43. Terapia génica
Las enfermedades que pueden tratarse con esta estrategia terapéutica son variadas e incluyen
desde las monogénicas hereditarias hasta las poligénicas e infecciosas. Debido a ello, cada
enfermedad requiere un abordaje particular, por lo que las opciones en la manipulación genética
pueden dividirse en los grupos siguientes:
a) Adición génica: consiste en insertar un gen funcional que exprese la proteína terapéutica en el
tejido indicado. Se puede usar para corregir genes defectuosos, insertar genes con funciones nuevas
a células particulares o incrementar la expresión del gen de interés.
b) Supresión génica: el objetivo es disminuir o anular la expresión de algún gen o genes a través de
ARN de ARNi, oligonucleótidos antisentido o ribozimas.
Esta estrategia también se aplica a la generación de animales knockout, mediante mutagénesis
dirigida para generar un gen disfuncional, cuya función estará ausente en el organismo resultante
de la clonación

44. Clasificación: tipos de terapia génica
Según el tipo celular
Según las células a las que se les aplique, la terapia génica puede dividirse en dos categorías:
Terapia génica en células germinales
También denominada terapia eugénica, va dirigida a células germinales (espermatozoides y óvulos).
Al insertar genes en estas células se provoca un cambio genético permanente en el organismo que se deriva de
esa célula, por lo que la modificación genética la adquieren generaciones posteriores.
Este tipo de terapia no se permite en humanos, debido a las enormes implicaciones éticas que conlleva.
Terapia génica en células somáticas
En este tipo de estrategia, uno o más tejidos son sometidos a terapia génica mediante administración
sistémica, tratamiento directo o previa extirpación del tejido.
Además, este procedimiento involucra la transfección de material genético en prácticamente cualesquiera de
las células del organismo y es el que se aplica en los protocolos clínicos.

45. Clasificación: tipos de terapia génica
Según la metodología
Terapia génica ex vivo
Este método se basa en la obtención y el aislamiento de un tipo celular específico del paciente que se va a
tratar; estas células se cultivan en el laboratorio, en donde se les introduce el gen terapéutico con ayuda de un
vector. Una vez que se tiene la certeza de que las células expresan el gen terapéutico se introducen
nuevamente al paciente.
Terapia génica in vivo
Este método consiste en la introducción directa del gen terapéutico al torrente sanguíneo del paciente, que
llegará al órgano blanco, o bien se administra directamente en el órgano o tejido (músculo, piel, etc.) blanco
dentro del organismo.
Terapia génica in situ
Se trata de una microinyección que introduce el ácido nucleico directamente a la célula, para lograr la
obtención de organismos recombinantes. También se aplica en la denominada terapia génica “suicida”, que
expresa los genes sólo en las células malignas.

47. Aplicaciones clínicas de la terapia
génica
El conocimiento de las bases genéticas de algunas enfermedades y la reciente
secuenciación del genoma humano han abierto la posibilidad de esta estrategia
terapéutica.
Esto supone perspectivas para la curación de muchas enfermedades a las que se
pretende combatir mediante los genes, como elementos curativos.
Por ello, en este momento la terapia génica se ve como una nueva forma de
medicina molecular aplicable a la mayoría de las enfermedades, no sólo las
monogénicas sino también las multifactoriales, en cuyo tratamiento puede ser útil
la modificación de la expresión génica.