Cultivo in vitro de tejidos vegetales

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Cultivo in vitro de tejidos vegetales

  1. 1. María Elena Daorden E.E.A. INTA SanPedro CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES
  2. 2. CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de células o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.
  3. 3. Los tejidos vegetales pueden cultivarse in vitro La célula retiene toda la información para regenerar una planta completa
  4. 4. Diferenciación celular La célula adquiere propiedades diferentes a las de la célula que la originó Célula diferenciada Célula desdiferenciada Célula diferenciada Retiene información Desdiferenciación TotipotencialidadTotipotencialidad
  5. 5. Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de células o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas. CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES
  6. 6. Medio nutritivo Las porciones del vegetal que se cultivan in vitro: “explantos” No son autotróficos
  7. 7. Fe Zn B Mn Cu Ni Co Al Mo I N P K Ca Mg S Azúcares Aminoácidos Vitaminas Auxinas Citocininas Giberelinas NutrientesNutrientes MicroMicroMacroMacro Sustancias orgSustancias orgáánicasnicas AguaAgua Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales
  8. 8. Medio nutritivo: Fitohormonas Se disuelven en NaOH 1N Bencil adenina-(BA) Bencilaminopurina (BAP) 2ip Zeatina Tridiazuron Se disuelven en HCl 1N AuxinasAuxinas CitocininasCitocininas 0.01 a 10 mg/l 0.03 a 10 mg/l GiberelinasGiberelinas En cultivo de meristemas y para elongación: Acido Giberélico (GA3) Acido indol Acético (AIA) Acido Indol Butirico (IBA) Acido Naftalén Acético (ANA) 2-4 D
  9. 9. Medio nutritivo Auxinas Citocininas Auxinas Citocininas Parte aérea Enraizamiento
  10. 10. Cultivo in vitro de plantas superiores Cultivo de meristemas Cultivo de yemas Cultivo de protoplastos Cultivo de embrionesCultivo de anteras Modalidades de cultivo in vitro
  11. 11. Tipos de cultivo in vitro Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)
  12. 12. Multiplicación en plantas • Semillas Reproducción sexual Progenie con distinto genotipo •• Vegetativa: bulbos, esquejes, estacas, tubérculos Reproducción asexual Progenie con idéntico genotipo Descendencia uniforme Se transmiten enfermedades
  13. 13. Producción de plantas libres de enfermedades Métodos Tratamientos con calor: para algunos virus y micoplasmas Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.
  14. 14. Cultivo de meristemas Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture)
  15. 15. Obtención de plantas de sanidad controlada (Cultivo de meristemas) “La concentración del patógeno no es uniforme en la planta infectada” Meristema • Sistema vascular poco diferenciado • Elevada actividad metabólica • Elevada concentración de auxinas Por qué el meristema?
  16. 16. Esquema para la obtención de plantas de sanidad controlada Extracción del ápice (0.2-0.5 mm) Cultivo del ápice en un medio adecuado Planta regenerada Planta establecida en sustrato Planta saneada Cultivo libre de virus Cuidadoso control de la humedad Rigurosas evaluaciones (plantas indicadoras, injertos, serología etc) Mantenimiento, multiplicación, Monitoreo de reinfecciones virósicas
  17. 17. Cultivo de meristemas Consideraciones generales • El proceso no ofrece total seguridad • Importancia de las técnicas de diagnóstico • Análisis confiables • Sistemas de detección sensibles • Especificar de qué virus se ha liberado y la técnica de diagnóstico empleada
  18. 18. Producción de plantas libres de enfermedades Métodos Tratamientos con calor: para algunos virus y micoplasmas Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.
  19. 19. Microinjertos Injertar ápices caulinares en un portainjerto Etapas: Germinación in vitro de las semillas del portainjerto Preparación de la plántula para ser injertada Extracción del ápice de la planta infectada Mantenimiento de la plántula injertada en cultivo Mantener la planta obtenida en invernadero Indexar las plantas obtenidas
  20. 20. Microinjertos Plántula especialmente acondicionada Ubicación del ápice en la plántula Published as a special insert to Caliiformia Agriculture, Nov-Dec. 1982 Universtiy of California, Berkeley, California.94720 Dos a cuatro semanas
  21. 21. Microinjertos http://www.ivia.es/germo/Foto1.jpg
  22. 22. Tipos de cultivo in vitro Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)
  23. 23. Influencia del material de partida: Planta madre Capacidad regenerativa Genotipo Edad Estado del órgano o tejido Estado fisiológico Estado sanitario Año Condiciones de crecimiento Posición del explanto Tamaño del explanto Condiciones fisiológicas Según Pierik, R.L.M. In vitro Culture of higher plants
  24. 24. Capacidad regenerativa Genotipo: Dicotiledóneas mejor que monocotiledóneas, y entre ellas las Solanáceas, crucíferas muy fácil regeneración Edad: Partes juveniles mejor que las adultas Estado del órgano o tejido: Mejor no leñosos Estado fisiológico: Partes vegetativas mejor que partes generativas Influencia del material de partida: Planta madre
  25. 25. Capacidad regenerativa Estado sanitario: Las más saludables y vigorosas Año: sobre todo si el material proviene de campo (inviernos severos ó veranos secos) Condiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece en campo que en invernadero Influencia del material de partida: Planta madre
  26. 26. Capacidad regenerativa Posición del explanto: Hay un gradiente de regeneración en la planta Tamaño del explanto: En general a mayor tamaño mayor capacidad regenerativa Influencia del material de partida: Planta madre
  27. 27. Preparación de la planta madre Recomendable que crezca en invernadero o cámara de crecimiento Usar material homogéneo Elegir plantas vigorosas Promover nuevas brotaciones: podas En maceta con sustrato estéril Programa sanitario Controles y manipulación de intensidad de luz, fotoperíodo y temperatura Aplicación de fitoreguladores
  28. 28. Prevenir insectos de cualquier tipo Prevenir hongos y bacterias Regar sólo en la maceta (evitar riegos por encima) Mantener baja la humedad Preparación de la planta madre
  29. 29. Obtención de explanto y desinfección Elementos limpios en la colección Ubicarlos en bolsas identificadas En conservadoras En invernadero
  30. 30. Obtención de explanto y desinfección En laboratorio Agua corriente Se retiran hojas Soluciones desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio) Enjuagues con agua estéril en cabina de flujo laminar Antibióticos y/o fungicidas
  31. 31. Contaminaciones
  32. 32. Micropropagación Segmentos uninodales Fuente: http://www.etsea2.udl.es
  33. 33. Micropropagación Fuente:http://www.etsea2.udl.es
  34. 34. Tipos de micropropagación Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)
  35. 35. Tipos de micropropagación Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.)
  36. 36. Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.) Tipos de micropropagación
  37. 37. Micropropagación: Etapas (Murashige) Etapa II Etapa I Selección y desinfección de explantos Cultivo en medio nutritivo Multiplicación a través de subcultivos Etapa III Enraizamiento
  38. 38. Micropropagación Transplante y aclimatación Planta entera Microtúnel Fuente: http://www.etsea2.udl.es
  39. 39. Micropropagación Transplante y aclimatación Invernadero Fuente: http://www.etsea2.udl.es
  40. 40. Túnel de aclimatación
  41. 41. Plántulas en aclimatación
  42. 42. Plántulas aclimatadas
  43. 43. Tipos de cultivo in vitro Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)
  44. 44. Morfogénesis directa Regeneración en hojas de Violeta africana Fuente: http://www.unizar.es
  45. 45. Tipos de cultivo in vitro Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)
  46. 46. Masas de callos indiferenciados Morfogénesis indirecta Fuente:BooksCole,adivisionofThomsonLearning.Inc
  47. 47. Regeneración a partir de callos
  48. 48. Cultivo de Anteras En qué consiste? Polen inmaduro en medios adecuados para la formación de embriones o callos
  49. 49. Cultivo de Anteras Aplicaciones en fitomejoramiento Cruzamiento A X B Plantas F1 Cultivo de anterasCultivo de anteras Líneas haploides Selección Fuente: Fuente:CultivodetejidosenlaAgricultura.CIAT1991
  50. 50. Cultivo de embriones cigóticos Para qué se usa? Superar dormición Inhibidores en el endosperma Estudios fisiológicos y nutricionales Acortar el ciclo en mejora Rescatar híbridos de cruzamientos
  51. 51. Recuperación de híbridos Barreras a los cruzamientos interespecíficos Precigóticas: el grano de polen no germina o no atraviesa el estilo. Postcigóticas: relacionadas con el desarrollo del embrión Cultivo in vitro de embriones
  52. 52. Cruzamientos interespecíficos Mejoramiento Incompatibilidades Embriones abortivos Embriones cultivados in vitro Cultivo de embriones cigóticos
  53. 53. Cultivo de embriones cigóticos En el género Prunus Duraznero X Almendro Portainjertos resistentes a nematodes P. cerasifera X P. munsoniana Mariana 2624 Resistencia a Ring spot virus P. avium X P. seudocerasus Cultivar Colt (Cerezo)
  54. 54. En la EEA San Pedro En la EEA San Pedro Duraznero x Duraznero Árboles polinizados
  55. 55. Cruzamientos: Metodología Recolección de flores en estado globoso Extracción y tamizado del polen Parental Maculino
  56. 56. Ramas con flores emasculadas Parental femenino
  57. 57. Polinización Ubicación del polen
  58. 58. Embolsado de ramas
  59. 59. Frutos cuajados
  60. 60. Desembolsado de ramas a los 40 días de la polinización
  61. 61. En laboratorio Acondicionamiento del fruto y extracción de semilla
  62. 62. Siembra de embriones en condiciones asépticas
  63. 63. Germinación in vitro
  64. 64. Embrión germinado in vitro In vitro A sustrato Alternativas
  65. 65. Híbridos ambientados
  66. 66. Híbridos injertados sobre portainjertos francos
  67. 67. Híbridos en campo
  68. 68. Híbridos a campo Híbridos en campo
  69. 69. Gracias por su atención! Dra. María Elena Daorden daorden@correo.inta.gov.ar www.inta.gov.ar/sanpedro

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