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Simón López Carvajal
Jaime Andrés Mejía Sánchez
UPB
INTRODUCTION
POMPE DISEASE
• ↓ acid α-glucosidase → ↑ of glycogen lysosomal.
• Incidence: 1/40.000 births.
• Children die from cardiore...
ANTIBODIES
• Y - shaped protein.
• Produced by B cells as a primary immune defense.
• Neutralize pathogens such as bacteri...
GLYCOGEN
• Multibranched polysaccharide.
• Serves as a form of energy storage in humans, animals and fungi.
Lysosomal Cytoplasmic
THERAPY
• Use of recombinant humanGAA
(rhGAA)
• Receptor: Manose-6-phosphate
receptor (M6PR)= delive...
FLOWCHART
OBJECTIVE
Examine the cell penetration and intracellular processing of the
antibody-rhGAA fusion (FabGAA) and determine it...
MATERIALESY
MÉTODOS
FabGAA y rhGAA
• FabGAA fue suministrado porValerionTherapeutics
• La rhGAA fue obtenida de un médico que tuvo un paciente...
Captación de FabGAA en cultivos
• La captación de FabGAA fue realizada en cultivos de mioblastos L6
de ratones y en fibrob...
Inmunofluorescencia
• Uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia
fluorescente para demostrar la presencia de u...
Tratamiento de ratones GAA KO
con FabGAA
Ratones jóvenes
• Administración semanal de dosis
molares iguales de FabGAA (30
m...
Recolección de la muestra tisular
• Sacrificaron a los ratones 48 horas después de la ultima inyección,
luego de un ayuno ...
Tinción de glucógeno tisular
Se hizo una tinción periódica acido-schiff (PAS).
Medicion de glucógeno tisular,
actividad de GAA y el Hex 4 urinario
Homogenizar
tejidos
congelados en
agua fría
Centrifuga...
Western Blot
• Técnica que sirve para identificar proteínas especificas en una
mezcla compleja de proteínas como extractos...
Determinación de la capacidad de
FabGAA para degradar glucógeno in
vitro a ph neutro.
• Los autores hicieron varias soluci...
RESULTADOS
DISCUSSION
Author What they said… Student’sOpinion
Grifin JL(1984) Muscule fiber destruction after lysosomal
rupture. Hypothesis that...
CONCLUSIONS
• Fab is efficient to deliver the protein to the cytoplasm but a
protection mechanism is needed to prevent the protein des...
• From the tests shown between old and young mice, we can see
that it is better to start applying the therapy at an early ...
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Pompe Disease

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Research of a treatment for pompe disease through the implementation of an antibody-mediated enzyme replacement therapy

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Pompe Disease

  1. 1. Simón López Carvajal Jaime Andrés Mejía Sánchez UPB
  2. 2. INTRODUCTION
  3. 3. POMPE DISEASE • ↓ acid α-glucosidase → ↑ of glycogen lysosomal. • Incidence: 1/40.000 births. • Children die from cardiorespiratory failure in the first year of life. • Characterized by muscle weakness, hypotonia, hyporeflexia and a hypertrophic cardiomyopathy in newborns.
  4. 4. ANTIBODIES • Y - shaped protein. • Produced by B cells as a primary immune defense. • Neutralize pathogens such as bacteria and viruses recognizing it by the antigen, via Fab.
  5. 5. GLYCOGEN • Multibranched polysaccharide. • Serves as a form of energy storage in humans, animals and fungi.
  6. 6. Lysosomal Cytoplasmic THERAPY • Use of recombinant humanGAA (rhGAA) • Receptor: Manose-6-phosphate receptor (M6PR)= delivery of the rhGAA to the lysosomes of target cells. • Fusion between the GAA and Fab of the monoclonal anti-DNA autoantibody 3E10. • Receptor: equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2)= It recognizes the Fab. It´s an ideal vehicle for cytoplasmatic delivery of therapuetic GAA in muscle tissues of Pompe disease.
  7. 7. FLOWCHART
  8. 8. OBJECTIVE Examine the cell penetration and intracellular processing of the antibody-rhGAA fusion (FabGAA) and determine its efficacy in enzyme replacements therapy in GAA-KO mice.
  9. 9. MATERIALESY MÉTODOS
  10. 10. FabGAA y rhGAA • FabGAA fue suministrado porValerionTherapeutics • La rhGAA fue obtenida de un médico que tuvo un paciente con Pompe que murió durante un tratamiento de reemplazo enzimático.
  11. 11. Captación de FabGAA en cultivos • La captación de FabGAA fue realizada en cultivos de mioblastos L6 de ratones y en fibroblastos GSD ll del paciente.
  12. 12. Inmunofluorescencia • Uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula. • En este estudio la inmunofluorescencia se uso para observar el Fab de los ratones y así poder ver la actividad de FabGAA.
  13. 13. Tratamiento de ratones GAA KO con FabGAA Ratones jóvenes • Administración semanal de dosis molares iguales de FabGAA (30 mg/kg, 6 ratones) o de rhGAA (20 mg/kg, 5 ratones) • La administración fue durante 4 semanas • Ratones control: ratones de la misma edad que no fueron tratados, eran 6 • Difenhidramina: se inyecto de 10 a 15 min antes de cada administración para prevenir reacciones anafilácticas. Ratones viejos • Bajas dosis • Administacion intravenosa (no especifican donde) de FabGAA 30 mg/kg una vez por semana durante 8 semanas • 7 ratones UT(no tratados) se dejaron como control, tenían la misma edad seguramente pero ahí no dice. • Altas dosis • 7 ratones con 49 semanas de edad, administración intravenosa de 90mg/kg de FabGAA una vez por semana durante 4 semanas. 7 ratones UT(no tratados) que seguramente tenían la misma edad fueron usados como control • Todos los ratones de este estudio eran machos.
  14. 14. Recolección de la muestra tisular • Sacrificaron a los ratones 48 horas después de la ultima inyección, luego de un ayuno nocturno. • A cada ratón le cogieron la orina y midieron el tetrasacarido de glucosa urinario HEX 4, biomarcador de pompe. • Cogieron una porción pequeña de cada tejido y la fijaron en un buffer neutral de formalina al 10% para estudios histológicos, el resto lo congelaron instantáneamente en hielo seco y lo guardaron a -80° hasta el uso para análisis bioquímico.
  15. 15. Tinción de glucógeno tisular Se hizo una tinción periódica acido-schiff (PAS).
  16. 16. Medicion de glucógeno tisular, actividad de GAA y el Hex 4 urinario Homogenizar tejidos congelados en agua fría Centrifugación Lisados claros obtenidos fueron usados para las pruebas para medir el glucógeno y el GAA. El Hex 4 se midió con cromatografía liquida y espectrometría de masas tándem.
  17. 17. Western Blot • Técnica que sirve para identificar proteínas especificas en una mezcla compleja de proteínas como extractos celulares o tejidos. • La técnica consta de tres etapas: separación por tamaño, transferencia a un soporte solido y visualización mediante la marcación de proteínas usando anticuerpos. • En este estudio sirvió para poder ver el rhGAA, FabGAA y sus interacciones con ENT2 y M6PR.
  18. 18. Determinación de la capacidad de FabGAA para degradar glucógeno in vitro a ph neutro. • Los autores hicieron varias soluciones de glucógeno con los buffers citrato y fosfato, con valores de ph que van de 3,5 a 7,0. • A cada ph se realizaron reacciones triplicadas que contenían solución de glucógeno y FabGAA y fueron incubadas a temperatura ambiente por una hora. Las cantidades de glucosa generadas en las reacciones fueron cuantificadas usando un kit de glucosa oxidasa. • La actividad glucosidasa de FabGAA se expreso en nmol de glucosa liberada / minuto / mg de proteína (nmol/min/mg).
  19. 19. RESULTADOS
  20. 20. DISCUSSION
  21. 21. Author What they said… Student’sOpinion Grifin JL(1984) Muscule fiber destruction after lysosomal rupture. Hypothesis that suggests that with disease progression, movement and increased myofibril rigidity during contraction cause enlarged lysosomes to rupture and release glycogen and lytic enzymes into the cytosol, which subsequently cause damage to the structure of muscle cells. We agree, because this could explain why the patients show muscular weakness. Raben N et al M6PR is the major cell-surface receptor through which therapeutic rhGAA is delivered from the circulating system to lysosomes in cells during ERT of Pompe patients. We agree, because for example in the liver, the AGG concentrations were higher in the lysosome and the liver has very high levels of M6PR. Hansen JE et al, Pennycooke M et al The unique monoclonal antibody 3E10 and its fragments are capable of penetrating living cells to deliver functional proteins to the cytosol and nuclei via ENT2, a cell-surface transporter that is highly expressed in human skeletal and cardiac muscle. We agree, because when they measured the FabGAA in GSD ll fibroblast with the M6P competitive inhibitor, the amount of lysosomal forms of GAA decreased, but the amount of FabGAA didn’t decrease. Weisbart RH et al Fab fragment has been shown to be able to deliver a 305 kDa protein efficiently into cultured cells. We certainly disagree, because it was showed that fab did deliver the protein to the cytoplasm but the protein was destroyed there because of its instability, so it is not very efficient since Fab doesn’t protects the protein.
  22. 22. CONCLUSIONS
  23. 23. • Fab is efficient to deliver the protein to the cytoplasm but a protection mechanism is needed to prevent the protein destruction related to its instability. • The enzyme replacement therapy is not efficient to treat the muscular weakness because it decreases the lysosomal glycogen but not the cytoplasmic, which causes the damage of the muscular fiber.
  24. 24. • From the tests shown between old and young mice, we can see that it is better to start applying the therapy at an early age, since at an older age there is a bigger ineffectiveness of the treatment and therefore we have to apply higher doses, due to muscle wasting. • An in vivo experiment should be performed to evaluate the effectiveness of FabGAA at a more basic pH, such as cytoplasmic, to corroborate the results that were given in vitro.

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