Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
DISRUPCIÓN CELULAR
Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR
1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la
industria para separar y/o purificar productos de
interés.
Objetivo...
Productos de interés liberados
naturalmente al medio
Disrupción celular Lípidos
Proteínas recombinantes
Enzimas
Antibiótic...
Proceso General
Que clase de célula
se quiere destruir?
Cuál es el producto
que queremos
extraer?
Selección del
método de
...
¿Qué es lo que debemos
conocer de la célula a la
hora de diagramar una
disrupción?
Operaciones y Procesos Biotecnológicos ...
Estructura de la Membrana Plasmática
Membrana Plasmática
- Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el...
Las principales funciones de la membrana plasmática son:
Membrana Plasmática
 Servir de sitio estable para la catálisis e...
o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante:
o La pared celular es una estructura rígida y compleja qu...
- La red de mureína (peptidoglicano) esta
muy desarrollada (puede presentar hasta
50 capas).
- Es frecuente la presencia d...
- La red de mureína presenta una sola
capa.
- Contiene únicamente meso-
diaminopimélico y nunca contiene lisina.
- Hasta a...
Pared celular de Hongos y Levaduras
- Es una estructura muy gruesa (100-200 nm)
- La pared celular esta compuesta por dos ...
Pared celular CélulasVegetales
- Pared primaria: mide entre
100 y 200 nm de espesor,
compuesta entre un 9 y un
25% de celu...
Operaciones y Procesos Biotecnológicos II
DISRUPCIÓN CELULAR
Células Animales
Micelios
Bacilos Gram (-)
Bacilos Gram (+)
C...
Métodos de Disrupción Celular
Métodos mecánicos:
- Son inespecíficos.-Suelen ser mas efectivos
que los métodos químicos.
S...
Métodos de Disrupción Celular
Métodos no mecánicos:
- Por sí mismos, estos métodos
no suelen ser muy eficientes.
- Por lo ...
Métodos mecánicos
Homogenizadores de alta presión
Se aplica una elevada presión a una
suspensión de células forzándolas a
...
Métodos mecánicos
Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer)
El mecanismo de disrupción
realizado por...
Métodos mecánicos
Bead mills (molinos a esferas)
- Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las
esfe...
Métodos mecánicos
- Las ondas de ultrasonido crean muchas micro-
burbujas en muchos sitios de nucleación
dentro de la susp...
Métodos no-mecánicos
Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres
sub-clases principales:
3) Métodos enzimátic...
Métodos no-mecánicos
1) Métodos Químicos
Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina)
Interfieren con los enlaces n...
Métodos no-mecánicos
1) Métodos Químicos
Agentes Quelantes (EDTA):
Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LP...
Métodos no-mecánicos
Tratamiento con detergentes
La efectividad del método radica en la
química del detergente, ya que son...
Métodos no-mecánicos
Shock osmótico
- Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper.
- El estrés osmótico ...
Congelamiento/descongelamiento:
Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el
congelamiento, rompen mecánicamen...
Descompresión:
- Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas
presurizado por un tiempo específico. El gas ...
Métodos no-mecánicos
Disrupción Enzimática:
Lisozima
(muramidasa)
- La principal limitación de este método es su elevado c...
Auto-lisis:
Métodos no-mecánicos
- Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es
transformar cepas a fin de hacer ...
Métodos Combinados
Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos
principios de acción, lo que hace f...
Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción
Métodos directos: Consisten en contar el número total de células
...
Conclusiones
- Existen una gran diversidad de métodos de disrupción.
- Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas q...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Disrupcion celular

9,418 views

Published on

  • Este secreto chino ancestral, totalmente natural te pone "DURO COMO EL ACERO" en la cama...  https://tinyurl.com/erecciontotalx
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

Disrupcion celular

  1. 1. DISRUPCIÓN CELULAR Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  2. 2. 1) Estudiar los procesos habitualmente empleados en la industria para separar y/o purificar productos de interés. Objetivos de Operaciones y Procesos Biotecnológicos II: 2) Evaluar las variables que permiten optimizar los procesos habitualmente involucrados en la separación de residuos insolubles, el aislamiento y la purificación de un determinado producto. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  3. 3. Productos de interés liberados naturalmente al medio Disrupción celular Lípidos Proteínas recombinantes Enzimas Antibióticos ? ADN,ARNMicroorganismo Productor Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  4. 4. Proceso General Que clase de célula se quiere destruir? Cuál es el producto que queremos extraer? Selección del método de disrupción celular a emplear Puesta a punto del método seleccionado Evaluación acerca de los rendimientos obtenidos Conclusiones Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  5. 5. ¿Qué es lo que debemos conocer de la célula a la hora de diagramar una disrupción? Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  6. 6. Estructura de la Membrana Plasmática Membrana Plasmática - Actualmente el modelo que describe la membrana plasmática es el del “mosaico fluido”. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  7. 7. Las principales funciones de la membrana plasmática son: Membrana Plasmática  Servir de sitio estable para la catálisis enzimática.  Servir de receptores que reconocen señales de determinadas moléculas y transducir la señal al citoplasma.  Ayudar a la compartimentalización sub-celular .  Protección.  Comunicación intercelular.  Regular el intercambio de sustancias entre el interior y exterior celular (lo que entra y sale de la célula).  Aislar selectivamente el contenido de la célula del ambiente externo. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  8. 8. o El tipo de célula con el que se vaya a trabajar es importante: o La pared celular es una estructura rígida y compleja que protege a la célula del ambiente, manteniendo su forma y presión osmótica. Pared Celular - células vegetales (plantas y algas) - hongos y levaduras - bacterias (Gram positivas y Gram negativas) Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  9. 9. - La red de mureína (peptidoglicano) esta muy desarrollada (puede presentar hasta 50 capas). - Es frecuente la presencia de los aminoácidos L-diaminopimélico o de lisina. - En ella se encuentran ácidos teicoicos y lipoteicoicos. - No presentan lipo-polisacáridos. - Presentan una sola bicapa lipídica. Pared Gram Positiva - Presentan bajo contenido proteico. - Alto contenido de lípidos. Staphylococcus Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  10. 10. - La red de mureína presenta una sola capa. - Contiene únicamente meso- diaminopimélico y nunca contiene lisina. - Hasta ahora no han podido encontrarse ácidos teicoicos o lipo- teicoicos. - Se encuentran grandes cantidades de lipoproteínas y lipo-polisacáridos que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. - Tienen dos bicapas lipídicas. - Presentan porinas en la membranas externa. Pared Gram Negativa E. Coli Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  11. 11. Pared celular de Hongos y Levaduras - Es una estructura muy gruesa (100-200 nm) - La pared celular esta compuesta por dos capas de polisacáridos, una capa interna transparente y amorfa, constituida principalmente de β- 1,3 y β-1,6-glucanos. En la capa externa se encuentran ubicadas las mano-proteínas, ancladas a la capa interna de β-glucanos o bien atravesándola. - Representa del 15-25% del peso celular en base seca. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  12. 12. Pared celular CélulasVegetales - Pared primaria: mide entre 100 y 200 nm de espesor, compuesta entre un 9 y un 25% de celulosa - Laminilla media: Es el lugar que une las paredes primarias de dos células contiguas. - Pared secundaria: (cuando existe) se relaciona con la especialización de cada tipo celular. A diferencia de la pared primaria, contiene una alta proporción de celulosa, lignina y/o suberina. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  13. 13. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR Células Animales Micelios Bacilos Gram (-) Bacilos Gram (+) CélulasVegetales Levaduras Cocos Gram (-) Esporas Dificultad Para la Disrupción Celular
  14. 14. Métodos de Disrupción Celular Métodos mecánicos: - Son inespecíficos.-Suelen ser mas efectivos que los métodos químicos. Se basan en fuerzas de corte (shear stress) que deforman las células hasta el rompimiento de sus cubiertas. - Generalmente son mas fáciles de escalar que los métodos no-mecánicos . - La separación del producto deseado de otros materiales (ac. nucleicos, proteínas, trozos de la pared celular, etc.) puede llegar a ser dificultosa. - Pueden llegar a dañar productos lábiles. - Requieren mucha energía. - Generan elevadas temperaturas. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  15. 15. Métodos de Disrupción Celular Métodos no mecánicos: - Por sí mismos, estos métodos no suelen ser muy eficientes. - Por lo general son menos severos que los mecánicos. Rompen las cubiertas celulares induciendo la lisis celular, a través de medios químicos, físicos o enzimáticos. - No generan grandes daños a las célula, facilitando la posterior purificación del producto de interés. - Son mas específicos. - Pocos métodos no mecánicos pueden llegar a ser escalados exitosamente. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  16. 16. Métodos mecánicos Homogenizadores de alta presión Se aplica una elevada presión a una suspensión de células forzándolas a través de una válvula, sometiendo a las células a un alto estrés de corte, rompiendo las membranas. Es uno de los mas utilizados para disrupción celular a gran escala. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR El mecanismo de disrupción se daría por fuerzas de corte en la región de la válvula, cavitación (debido a las regiones de baja presión generadas) y al impacto contra el anillo.
  17. 17. Métodos mecánicos Homogenizadores Microfluidizadores (microfluidizer homogenizer) El mecanismo de disrupción realizado por este equipo genera partículas de mayor tamaño que el homogenizador de alta presión. En los microfluidizadores, el líquido se divide en dos o más corrientes que se bombean a elevadas presiones (en algunos equipos más de 270 MPa) y grandes velocidades, unas contra otras en un ángulo de 180° cayendo repentinamente la presión tras chocar ambas corrientes. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  18. 18. Métodos mecánicos Bead mills (molinos a esferas) - Aspectos a considerar al trabajar con estos equipos: tamaño de las esferas (0,2-15mm), cantidad y material de las esferas; velocidad de agitación; temperatura de trabajo; velocidad de flujo y concentración de la suspensión a tratar. - Básicamente consiste en un agitador a discos montado sobre un motor central que gira en una cámara central, la cual es cargada con esferas de vidrio, metal u otro material. - Son de los mas utilizados a gran escala. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  19. 19. Métodos mecánicos - Las ondas de ultrasonido crean muchas micro- burbujas en muchos sitios de nucleación dentro de la suspensión celular. Estas micro- burbujas luego colapsan implosionando durante el período de rarefacción (compresión) de la onda. - Este fenómeno, denominado cavitación, produce un shock de ondas muy intenso, generando un fuerte estrés local, deformando al límite las células y produciendo así su consecuente ruptura. - El ultrasonido utiliza frecuencias entre 20 y 50 kHz. Sonicadores (ultrasonido) Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  20. 20. Métodos no-mecánicos Dentro de estos tipos de métodos podemos clasificar tres sub-clases principales: 3) Métodos enzimáticos 2) Métodos físicos 1) Métodos químicos Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  21. 21. Métodos no-mecánicos 1) Métodos Químicos Agentes Caotrópicos (urea, clohidrato de guanidina) Interfieren con los enlaces no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Walls) desorganizando la estructura del agua haciéndola menos hidrofílica, debilitando las interacciones soluto- soluto. Tratamiento con álcalis (hidróxido de sodio e hipoclirito) Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas. Es una técnica muy severa pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de interés sea resistente a la degradación a pH elevados. Tratamiento con solventes orgánicos (cloroformo, tolueno) Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo componentes hidrofóbicos de la pared, como los fosfolípidos de la membrana interna en bacterias Gram (-). Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  22. 22. Métodos no-mecánicos 1) Métodos Químicos Agentes Quelantes (EDTA): Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen los LPS adyacentes haciendo que se liberen parte de los LPS conteniendo proteínas y fosfolípidos de la membrana (Gram -). Antibióticos: Son efectivos contra bacterias Gram (-) (β-lactámicos) . Distintos antibióticos causan la lisis por distintos mecanismos. No se utilizan a gran escala. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  23. 23. Métodos no-mecánicos Tratamiento con detergentes La efectividad del método radica en la química del detergente, ya que son anfipáticos. Se clasifican en tres tipos: catiónicos (sales de tetra-alquil-amonio, pH básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y no-iónicos (Triton-X,). Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR 1) Métodos Químicos Forman micelas con los lípidos de las membranas, desestabilizándolas.
  24. 24. Métodos no-mecánicos Shock osmótico - Las células con paredes celulares son mas difíciles de romper. - El estrés osmótico es generado cuando las células son situadas en medios hiper/hipotónicos. - Es el método químico mas simple. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR 2) Métodos Físicos
  25. 25. Congelamiento/descongelamiento: Los cristales de hielo que se forman y crecen durante el congelamiento, rompen mecánicamente la integridad del interior de la membrana celular, haciéndola mas permeable. Enfriamiento lento Enfriamiento rápido Se ha visto que la congelación lenta no funciona tan bien como la rápida. La congelación rápida lesiona más específicamente las membranas celulares produciendo lisis celular. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR 2) Métodos Físicos Métodos no-mecánicos
  26. 26. Descompresión: - Es un proceso por el cual las células se mezclan con un gas presurizado por un tiempo específico. El gas entra en las células y luego al liberar la presión aplicada el mismo se expande causando la disrupción. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR Termólisis: - Es un proceso bastante común a gran escala. Las células son llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la membrana externa. 2) Métodos Físicos Métodos no-mecánicos
  27. 27. Métodos no-mecánicos Disrupción Enzimática: Lisozima (muramidasa) - La principal limitación de este método es su elevado costo. La inmovilización puede ser una herramienta útil para la reducción de costos - La lisis enzimática es un método muy preciso, pero que requiere de una comprensión precisa de la estructura de las paredes celulares que se desean destruir. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR 3) Métodos Enzimáticos
  28. 28. Auto-lisis: Métodos no-mecánicos - Por sí mismo es un mecanismo lento. Lo que se hace es transformar cepas a fin de hacer estos sistemas auto-líticos mucho mas activos, introduciendo genes que codifican antibióticos y enzimas que degraden mas rápidamente las distintas organelas y membranas celulares. - Es un proceso por el cual las células inducen su propia destrucción. Se produce la activación de señales que activan la liberación de enzimas que degradan las organelas y membranas de las mismas células. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR 3) Métodos Enzimáticos
  29. 29. Métodos Combinados Puede verse que los distintos métodos de disrupción poseen diversos principios de acción, lo que hace factible su combinación de forma sinérgica para aumentar el rendimiento del proceso en un solo método combinado. Métodos no-mecánicos combinados Disrupción mecánica con pre-tratamientos no mecánicos
  30. 30. Evaluación de la eficiencia de los métodos de disrupción Métodos directos: Consisten en contar el número total de células destruidas e intactas. - Recuentos en cámara. - Contadores electrónicos. - Recuentos en placa. - Utilización de centrífugas analíticas. Métodos indirectos: Consisten en determinar el grado de liberación al medio externo de algún metabolito celular luego de que las membranas celulares son destruidas (determinación de proteínas solubles, actividades enzimáticas, etc.). Se determina el rendimiento alcanzado en función de la eficiencia de los métodos realizados, teniendo en cuenta no solo la disrupción celular o el porcentaje de producto recuperado, sino también las condiciones operativas que se necesitaron para llevarlo a cabo. Cálculo del Rendimiento Alcanzado Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR
  31. 31. Conclusiones - Existen una gran diversidad de métodos de disrupción. - Necesidad de desarrollar y poner a punto técnicas que permitan la determinación de la eficiencia de los métodos utilizados. - Cada método posee diferentes principios de acción, por lo que presentan una serie de ventajas y desventajas frente a los demás. - Existen distintas clases de microorganismos productores con una gran diversidad de metabolitos de interés. Operaciones y Procesos Biotecnológicos II DISRUPCIÓN CELULAR - No existen protocolos universales de disrupción celular. ¿CUÁL ES EL MEJOR MÉTODO?

×