Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
‫استخراج ‪ mRNA‬از بافت غده زهری عقرب ایرانی ادونتوبوتوس دوریه‬
‫(‪ ،)Odonthobuthus doriae‬تهیه ‪ cDNA‬از آن و انجام ‪PCR‬...
‫مقدمه‬

‫3‬
‫‪ o‬اهمیت مطالعات ژنتیکی:‬
‫- انجام پروژهای بی شمار و صرف میلیاردها دالر‬

‫ اهمیت کلون نمودن و تهیه مقدار کافی سموم جدا ...
‫عقربها (‪)scorpions‬‬
‫‪‬‬

‫رده عنکبوتیان، متعلق به شاخه بند پایان (‪ ، )Arthropoda‬ابتدائی ترین جانواران موجود در جهان...
‫‪ Bothriuridae‬و ‪:Chactidae‬‬

‫در دسته بندی خانواده عقربها‬

‫چندان مورد توجه قرار نگرفته اند.‬

‫‪Nebo hierichonticus‬...
‫مهمترین جنس های عقرب در پزشکی‬
‫‪‬‬

‫تقریبا اکثر این جنس ها در تیره بوتیده هستند.‬

‫‪‬‬

‫بوتوس )‪: (Buthus‬‬

‫‪ But...
‫‪ ‬سنتروئیدس (‪: )Centruroides‬‬
‫این جنس شامل گونه های مهم متعلق به نسل جدید عقرب ها می باشد ‪,C.sculpturatus‬‬
‫‪ C.su...
‫مهمترین گونه های پزشکی عقربهای دنیا،سمیت(05‪ )LD‬و ناحیه پراکندگی آن‬

‫9‬
‫پراكندگي عقرب ها جهان‬

‫01‬
‫عقربهای ایران‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬

‫‪‬‬

‫انواع عقربهای ایران در 2 تیره (‪ 2 )family‬زیر تیره (‪ 17 )Subfamily‬جنس (‪23 )Genus‬...
:‫عقرب های متعلق به تیره بوتیده در ایران‬
Androctonus crassicauda
Apistobuthus petryqus
Buthatus alticola
Buthatus jayacar...
‫عقرب های متعلق به خانواده اسکورپیونیده در ایران:‬

‫‪‬‬

‫١- حبیبال گیالری ‪Habibela‬‬
‫‪gilardi‬‬

‫‪‬‬

‫٢- حبیبال پر...
‫خصوصیات کلی عقربها‬
‫‪‬‬

‫عقربها گوشت خوارند و همنوع خواری به مقدار زیادی در بین آنها رایج است. مقاومت این‬
‫جانوران در...
‫دستگاه سمی عقربها‬
‫‪ ‬دستگاه سمی عقربها در انتهای دم قرار گرفته و شامل دو غده سمی است که در پوشش ضخیم کیتینی قرار‬
‫دار...
16
‫عقرب ادونتوبوتوس دوریه‬
‫‪‬‬

‫از میان این 44 گونه ، 7 گونه عقرب ایران خطرناک و دارای اهمیت پزشکی‬
‫هستند که عقرب ادونتو...
‫پراکندگی:‬
‫‪‬‬

‫این عقرب بیشترین میزان پراکندگی شناخته شده در میان عقربهای ایران را داراست و‬
‫در مناطق مرکزی ، جنوب و...
‫ویژگی های زهر عقرب‬
‫‪‬‬

‫زهر زیر گروهی از سم می باشد که برای ایجاد اثرات مخرب باید از یک ارگانیسم‬
‫به ارگانیسم دیگر ت...
‫خصوصیات و اجزای زهر عقرب‬
‫‪‬‬

‫‪‬‬

‫زهر عقرب ماده ای پروتئینی است که در حالت تازگی و خلوص ، شفاف و بی رنگ و‬
‫با ‪ p...
‫‪ ‬از فاکتورهای سمی دیگر زهر عقرب می توان به آنزیم ها اشاره کرد. تنها آنزیمی که از نظر کمی به مقدار‬

‫قابل توجهی در زهر...
‫تقسیم بندی سموم عقرب‬
‫‪‬‬

‫در جامع ترین تقسیم بندی سموم بر اساس سنجش بیولوژیک (‪ )Bioassay‬به هنگام خالص سازی‬
‫، توکس...
‫‪‬‬

‫از لحاظ تاثیر بر روی نوع کانالها ، می توان سموم پپتیدی عقرب به 4 گروه عمده تقسیم‬
‫کرد:‬

‫1)پپتیدهایی با 07-06 اس...
‫2)گروه دوم شامل دو زیر گروه یکی با زنجیره کوتاه 04-03 و دیگری با زنجیره بلند 46-06 اسید آمینه با 3تا‬
‫4 پیوند دی سولفیدی...
‫کانال های سدیمی‬
‫‪‬‬

‫کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ مسئول ایجاد پتانسیل عمل در سلولهای‬
‫تحریک پذیر مثل سل...
‫کانال سدیمی‬

‫62‬
‫انواع نروکسین های اثر کننده بر کانال های سدیمی‬
‫‪ ‬آلفا توکسین ها‬
‫آلفا توکسین ها ، توکسین های پلی پپتیدی هستند که هر ...
‫بتا توکسین ها‬
‫‪‬‬

‫‪‬‬

‫‪‬‬

‫بتا توکسین ها پلی پپتیدی هایی با 56-06 توالی اس ی آمینه می باشند که مستقل از پتانسیل...
‫گاما توکسین ها‬
‫‪‬‬

‫گاما توکسین ها ، در عقرب برزیلی تیتیوس سروالتوس یافت شده است و هر دوی این عملکردها‬
‫دارا می باشن...
‫عملکرد نروتوکسین های سم عقرب‬
‫‪ ‬عملکرد آلفا توکسین ها:‬
‫‪‬‬

‫آلفا توکسین ها ی عقرب به گیرنده نوع 3 در کانال های سدی...
‫عملکرد بتا توکسین ها‬
‫‪‬‬

‫‪‬‬

‫بتا توکسین ها معموال در گونه های عقرب دنیای جدید (مانند سنتروروئیدس و تیتیوس) یافت ش...
‫کاربردهای درمانی سم عقرب‬
‫‪ ‬علی رغم آثار زیان بار سم عقرب در بدن از سال 0791 میالدی به بعد که محققان موفق به خالص‬
‫سا...
‫‪‬‬

‫دانشمندان در مجله آکادمی ملی آمریکا مدعی شده اند که در سم عقرب موادی وجود دارد که‬
‫قابلیت سرکوب سیستم ایمنی مربوط...
‫‪ OD1 ‬اولین سم شبه آلفا جدا شده از زهر عقرب ایرانی موثر بر روی کانالهای سدیم‬
‫وابسته به ولتاژ)‪VGSCS‬‬

‫) پستانداران ...
‫افزایش ورود یون سدیم توسط 1‪ OD‬می تواند منجر به‬
‫دپالریزاسیون غشاء )‪ (in vivo‬باقیمانده کانالهای 7.1 ‪ Nav‬در‬
‫حالت غ...
‫ویژگی های 1‪OD‬‬
‫‪ ‬خصوصیات بیوشیمي- بیوفیزیك1‪:OD‬‬
‫تعداد اسيد آمينه: 56‬
‫وزن مولكولي: 1.5127 دالتون‬
‫نقطه ايزو الك...
‫تعداد و درصد تركيبات اسيد آمينه آن:‬

‫73‬
‫‪ ‬تعداد اسید آمینه باردار منفي (‪7 :)Asp+Glu‬‬
‫‪ ‬تعداد اسید آمینه باردار مثبت (‪8 :)Arg+ Lys‬‬
‫‪ ‬تركیبات اتمي 1‪:...
‫مقایسه ترتیب اسید آمینه 1‪ OD‬با سموم عقرب مشابه:‬
‫‪ ‬مقایسه ساختمان اولیه تعدادي از سموم آلفا، شبه آلفا و سموم حشرات ع...
‫مقایسه ترتیب اسید آمینه 1‪ OD‬با سموم مشابه است. در سمت راست، درصد مشابهت اسید‬
‫آمینه سم با 1‪ OD‬بر حسب درصد آمده است. ...
‫به بيان برخي تفاوتهاي موجود در ساختمان شبه آلفا 1‪ OD‬در مقايسه با برخي سموم‬
‫شناخته شده:‬
‫‪ -1 ‬اسيدهاي آمينه آروماتي...
‫‪-4 ‬جایگزیني موقعیت 46 (اغلب هیستیدین (5.0+) در سموم شبه آلفا) با اسید‬
‫آمینه فاقد بار آالنین در 1‪ BmK M‬سبب كاهش اتص...
‫‪ -6 ‬موتاسیون ‪ K8/D‬در ‪( LqhαIT‬كه در 1‪ OD‬و 1‪ BmK M‬وجود دارد) سبب تاثیر‬
‫باالئي بر محل اتصال كانال حشرات و تغییر...
‫مواد و روش ها‬

‫44‬
‫مواد و محلولهای استفاده شده:‬

‫54‬
‫فهرست دستگاه های مورد استفاده:‬

‫64‬
‫آنزیم های مورد استفاده شده:‬

‫‪ ‬مارکر‬
‫مارکر ‪ )1/0μg/μl( 50bp‬که محصول شرکت ‪ Fermentase‬بود، در این پژوهش مورد استف...
‫طرز تهیه ی محلول ها و بافر های مورد استفاده:‬
‫‪‬‬

‫آب تیمار شده با ‪DEPC‬‬

‫‪ DEPC‬یک عامل بسیار قوی در غیر فعال سازی...
‫‪‬‬

‫ژل آگارز 1/5 درصد‬
‫73/. گرم آگارز در 52 میلی لیتر از بافر ‪ 1X TBE‬حل شده و استفاده می شود.‬

‫‪ ‬محلول رنگ اتید...
‫روش ها:‬
‫‪ ‬نمونه گیری‬
‫محل نمونه گیری به خوبی توسط الکل ضد عفونی شد و پنس و قیچی های مورد استفاده به همراه نوک سمپلر ...
‫مراحل استخراج ‪ Totol RNA‬از غده ی سمی عقرب 1‪OD‬‬
‫‪‬‬

‫1- به اندازه ی 03 میلی گرم از بافت تازه حیوانی جدا شد( نباید ب...
‫‪‬‬

‫6- به اندازه ی حجم محلول رویی به آن اتانول 07% اضافه شد. حجم آن بین ‪ 350-600lμ‬بود. حجم‬
‫اتانول به حجم محلول روی...
‫‪‬‬

‫7- از مخلوط به دست آمده به اندازه ی ‪ 700lμ‬یا بیشتر برداشته و در یک ستون ریخته شد. ستون در‬
‫یک تیوب 2 میلی لیتری...
‫‪‬‬

‫31- مجددا ً ‪ 500lμ‬از بافر ‪ RPE‬به ستون اضافه شده مرحله ی قبل تکرار شد.ولی مدت سانتریفوژ‬
‫به 2 دقیقه افزایش داد...
‫تهیه ‪cDNA‬‬
‫‪‬‬

‫الگوی ‪RNA‬می تواند به عنوان هدف در تکنیک ‪ RT-PCR‬به کار گرفته شود به شرطی که ‪RNA‬ی استخراج‬
‫شده ...
‫مراحل سنتز ‪ cDNA‬از ‪:Total RNA‬‬
‫‪‬‬

‫1-‪ RNA‬ی الگو پس از در آوردن از فریزر 07- درجه ی سانتی گراد روی یخ قرار داده ...
‫تکثیر ژن 1‪ OD‬توسط واکنش ‪PCR‬‬
‫)‪(polymerase chain reaction‬‬
‫‪‬‬

‫تکنیک ‪ PCR‬در اواسط دهه 0891 بوسیله کری مولیس م...
‫آغازگرها طولی حدود ‪ 17-24 bp‬دارند. دو آغازگر رفت و برگشت نباید مکمل باشند زیرا در طی مراحل‬
‫‪ PCR‬تشکیل پرایمر – دایمر...
‫مواد الزم جهت انجام هر واکنش ‪PCR‬‬

‫95‬
‫شرایط دمایی واکنش ‪:PCR‬‬
‫در واکنش ‪ PCR‬سه دمای مختلف به کار می روند. ابتدا دمای واسرشت سازی که‬
‫حدود 59-29 درجه سانتی...
‫الکتروفورز‬
‫به منظور بررس ی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز، 01 میکرولیتر از نمونه با 02 میکرولیتر بافر‬
‫بارگذاری ‪ 6X‬مخ...
‫استخراج ‪RNA‬‬
‫با استفاده از کیت استخراج ، ‪ RNA‬از نمونهها جداسازی شد. ‪ RNA‬استخراجی در یخچال 07- درجه‬
‫سانتیگراد نگه...
(A)- Alignment of Amino acid sequence of OD1 Toxin with other toxins in the
gene bank NCBI.
The nomers indicate the access...
)C(-PRIMER SEQUENCES:
OD1-VF: 5- TNCGNGAYGCNTAYATHGCNGAYGAY-3
OD1-VR: 5- AYTTNCCNGGDATNCGDATNGGN-3
(D)- Degenerate alphabe...
‫تفسیر نتایج‬
‫‪‬‬

‫نتیجه ای که از گرادیان دمایی ‪PCR‬حاصل شد مطابق شکل 1 در دو دمای 65 و85 درجه فقط اسمیر مشاهده‬
‫شد، ...
‫‪‬‬

‫و طبق عکس شماره 2 در دو دمای 65و85 درجه عالوه بر باند مورد نظر چندین باند کاذب دیگر نیز مشاهده شد. به‬
‫همین منظور...
‫بحث و نتیجهگیری‬

‫76‬
‫برای بررسی مکانیسم اثر زهر عقرب ایرانی ‪ Odonthobuthus doriae‬تاکنون 3 سم پلی پپتیدی‬
‫از زهر این عقرب جداسازی، شناسایی و...
‫‪ ‬تعداد ‪ 195bp‬الیگونوکلئوتد برای سنتز ‪ DNA‬کدکننده 1‪ OD‬استفاده شد.‬
‫طراحی این الیگو نوکلئوتیدها براساس ترتیب اسید...
‫در این پژوهش، با توجه به اینکه قطعه ‪ cDNA‬تکثیر یافته، در محدودة مورد انتظار‬
‫( ‪ )195bp‬قرارگرفته بود و از آنجا که این...
‫‪‬‬

‫همچنین چهار بتاتوکسین جداشده از سم این عقرب، پلیپپتیدهایی با طول 27-96 توالی اسیدآمینه‬
‫هستند که ‪cDNA‬هایی با طو...
‫‪‬‬

‫پیشنهادات‬

‫‪ ‬با توجه به نتایج بدست امده از پژوهش حاضر،پیشنهاد می شود که:‬
‫1. تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعه ‪ cD...
73
Presentation1
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Presentation1

3,181 views

Published on

Published in: Health & Medicine
  • Be the first to comment

Presentation1

  1. 1. ‫استخراج ‪ mRNA‬از بافت غده زهری عقرب ایرانی ادونتوبوتوس دوریه‬ ‫(‪ ،)Odonthobuthus doriae‬تهیه ‪ cDNA‬از آن و انجام ‪PCR‬‬ ‫از ژن 1‪ OD‬با استفاده از پرایمرهای دژنراتیو‬ ‫اساتید راهنما: دکترامیر جاللی، دکتر حمید گله داری‬ ‫استاد مشاور: دکتر عباس زارع میرک آبادی‬ ‫2‬
  2. 2. ‫مقدمه‬ ‫3‬
  3. 3. ‫‪ o‬اهمیت مطالعات ژنتیکی:‬ ‫- انجام پروژهای بی شمار و صرف میلیاردها دالر‬ ‫ اهمیت کلون نمودن و تهیه مقدار کافی سموم جدا شده از زهر جانوران سمی به ویژه عقرب و‬‫به ویژه عقرب و حلزون های سمی دریائی (‪،)conus‬‬ ‫ تهیه داروهائی با قیمت تمام شده پائین در مقایسه با روشهای قبلی (با توجه به شواهد‬‫به شواهد فارماکولوژیک و فیزیولوژیک گزش)‬ ‫ در دو سال اخیر دو داروی آن یعنی ®‪ Zincotide‬و ®‪ ، Exanta‬به بازار معرفی و‬‫بازار معرفی و تعداد زیادی نیز در مرحله کارآزمائی بالینی می باشد‬ ‫4‬
  4. 4. ‫عقربها (‪)scorpions‬‬ ‫‪‬‬ ‫رده عنکبوتیان، متعلق به شاخه بند پایان (‪ ، )Arthropoda‬ابتدائی ترین جانواران موجود در جهان با بیش از‬ ‫0051 جنس مختلف ، متشکل از 9 خانواده مهم و با پراکندگی جهانی باال ، از لحاظ تاکسونومی ، شش خانواده‬ ‫از این عقرب ها تا کنون تشخیص داده شده اند:‬ ‫‪ :Buthidae‬مهمترین جنسهای خطرناک:‬ ‫آندرو کتونوس (‪)Androctunus‬‬ ‫لیوروس (‪) Leiurus‬‬ ‫متعلق به دنیای قدیم عقربها‬ ‫بوتوس (‪)Bothotus‬‬ ‫هترومتروس (‪)Heterometrus‬‬ ‫و‬ ‫پارابوتوس )‪(Parabuthus‬‬ ‫سنترورویدس )‪(Centruroides‬‬ ‫متعلق به دنیای جدید‬ ‫تیتیوس )‪.(Tityus‬‬ ‫5‬
  5. 5. ‫‪ Bothriuridae‬و ‪:Chactidae‬‬ ‫در دسته بندی خانواده عقربها‬ ‫چندان مورد توجه قرار نگرفته اند.‬ ‫‪Nebo hierichonticus‬‬ ‫‪ :Diplocentridae‬به استثناء عقرب‬ ‫سایر گونه های این خانواده چندان مورد توجه نیستند.‬ ‫‪ :Scorpionidae‬به استثناء عقرب ‪Hemiscorpios‬‬ ‫‪lepturus‬سایر گونه های این خانواده چندان مورد توجه‬ ‫قرار نگرفته اند.‬ ‫‪ : Vaejovidae‬اهمیت کمتری نسبت به بوتیده دارند. گزش گونه های‬ ‫.‪ Vaejovus sp‬و .‪ Hadrurus sp‬تنها با اثرات موضعی و درد در محل گزش‬ ‫همراه است.‬ ‫6‬
  6. 6. ‫مهمترین جنس های عقرب در پزشکی‬ ‫‪‬‬ ‫تقریبا اکثر این جنس ها در تیره بوتیده هستند.‬ ‫‪‬‬ ‫بوتوس )‪: (Buthus‬‬ ‫‪ Buthus occitanus‬مهمترین گونه این جنس است.‬ ‫‪‬‬ ‫مزوبوتوس (‪:)Mesobuthus‬‬ ‫گزش ‪Mesobuthus tamulus‬یا عقرب قرمز هندی عمدتا باعث مشکالت قلبی عروقی ( ازدیاد‬ ‫فشار خون ، آریتمی ، آدم ریوی) می شود .‬ ‫‪ ‬لیوروس (‪:)Leiurus‬‬ ‫‪:Leiurus quinquestriatus‬یکی از شناخته شده ترین عقربهای سمی دنیا است.گزش آن‬ ‫بسیار خطر ناک است.‬ ‫‪ ‬پارابوتوس (‪: )Parabuthus‬‬ ‫مهمترین گونه های آن در افرقای جنوبی و زامیبیا یافت می شود. درد در موضع و اثرات سیستمیک و‬ ‫گزش‬ ‫با‬ ‫تواند‬ ‫می‬ ‫مرگ‬ ‫حتی‬ ‫‪P.transvaalicus,P.pallidus,P.liosoma,P.granulatus‬و ‪P. fulvipes‬‬ ‫اتفاق بیفتد.‬ ‫7‬
  7. 7. ‫‪ ‬سنتروئیدس (‪: )Centruroides‬‬ ‫این جنس شامل گونه های مهم متعلق به نسل جدید عقرب ها می باشد ‪,C.sculpturatus‬‬ ‫‪ C.suffusus ,Centruroides suffuses‬مهمترین گونه های این جنس که اندازه برخی از‬ ‫آنها تا 9 سانتیمتر نیز می رسد و دارای رنگ زرد تا قهوه ای تیره هستند.‬ ‫‪ ‬تیتیوس (‪: )Tityus‬‬ ‫این جنس بیش از 001گونه دارد که مهمترین گونه آن ‪T.serrulatus‬بومی برزیل است.‬ ‫8‬
  8. 8. ‫مهمترین گونه های پزشکی عقربهای دنیا،سمیت(05‪ )LD‬و ناحیه پراکندگی آن‬ ‫9‬
  9. 9. ‫پراكندگي عقرب ها جهان‬ ‫01‬
  10. 10. ‫عقربهای ایران‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫انواع عقربهای ایران در 2 تیره (‪ 2 )family‬زیر تیره (‪ 17 )Subfamily‬جنس (‪23 )Genus‬‬ ‫گونه (‪7 )Species‬زیر گونه و 4 فرم وجود دارد.‬ ‫عقربها گاها ً دارای یک نام محلی و یا با یک مشخصه اصلی نامیده می شود. به عنوان مثال‬ ‫عقرب سیاه به جنس آندروکتونوس (‪ )Androctonus‬گفته می شود. انواع بوتاکوس‬ ‫(‪ )Buthacus‬و ادونتوبوتوس (‪ )Odonthobuthus‬به عقرب جراره معروفند. به‬ ‫عقربهای پوشیده از پرز یعنی انواع بوتاکوس (‪ )Buthacus‬و سیمونوئیدس‬ ‫(‪ )Simonoides‬عقرب پشمالو میگویند. همی اسکرپیوس لپتوروس نیز گادیم یا عقرب‬ ‫هفت دم نامیده می شود .‬ ‫در ایران دو خانواده از عقرب ها به نامهای بوتیده و اسکورپیونیده وجود دارد.‬ ‫11‬
  11. 11. :‫عقرب های متعلق به تیره بوتیده در ایران‬ Androctonus crassicauda Apistobuthus petryqus Buthatus alticola Buthatus jayacari Campsobuthus matheiensi Campsobuthus rogolostus Cryplina palpater Lyobuthus kesleri Mesobuthus eupeus Ondontobuthus doriea Ondontobuthus odunthurus Lierus cocasicus Orthocirus scrobicolosus Razianus zarodni Sasanitus zarodni Simonohdes farzanpay 12 ‫1- آندرکتونوس کراسیکودا‬ ‫٢- آپیستوبوتوس تریگوسرکوس‬ ‫٣- بوتاتوس آلتی کوال‬ ‫٤- بوتاتوس شاخ‬ ‫٥- کمپسوبوتوس ماتهزینی‬ ‫٦- کمپسوبوتوس روگولوستوس‬ ‫٧- کریپلینا پالپاتر‬ ‫٨- لیوبوتوس کسلری‬ ‫٩- مزوبوتوس اوپیوس‬ ‫٠١- ادونتوبوتوس دوریه‬ ‫١١- ادونتوبوتوس ادونتوروس‬ ‫٢١- لیوروس کوکاسکیوس‬ ‫٣١- ارتوشیروس اسکروبی کولسوس‬ ‫٤١- رازیانوس زاردونی‬ ‫٥١- ساسانیدوس زاردونی‬ ‫٦١- سیمونوئیدوس فرزان پی‬                
  12. 12. ‫عقرب های متعلق به خانواده اسکورپیونیده در ایران:‬ ‫‪‬‬ ‫١- حبیبال گیالری ‪Habibela‬‬ ‫‪gilardi‬‬ ‫‪‬‬ ‫٢- حبیبال پرسیکوس ‪Habibela‬‬ ‫‪persicus‬‬ ‫‪‬‬ ‫٣- همی اسکورپیوس لپتوروس ‪Hemiscorpius‬‬ ‫‪‬‬ ‫٤-‬ ‫اسکورپیوموروس‬ ‫‪lepturus‬‬ ‫‪Scorpiomaurus‬‬ ‫31‬
  13. 13. ‫خصوصیات کلی عقربها‬ ‫‪‬‬ ‫عقربها گوشت خوارند و همنوع خواری به مقدار زیادی در بین آنها رایج است. مقاومت این‬ ‫جانوران در مقابل گرسنگی زیاداست و قادرند چند ماه حتی یکسال بدون غذا زنده بمانند.‬ ‫عقربها پوست اندازی می کنند . این عمل در محل تاریک و یا در شب انجام می شود. نیاز به‬ ‫اکسیژن این جانور کم است و معموال به سن ، جنس و شرایط محیط زیست آنها بستگی دارد.‬ ‫‪‬‬ ‫در عقربها جنس نر از جنس ماده جداست و گاها ً اختالف ظاهری چندا نی بین نرو ماده دیده‬ ‫نمی شود جفت گیری در آنها معموال در فصل بهار صورت می گیرد و زنده زا می باشند.‬ ‫‪‬‬ ‫تعداد نوزادان بر حسب نوع عقربها متفاوت و از 6 تا 9 عدد گزارش شده است.‬ ‫41‬
  14. 14. ‫دستگاه سمی عقربها‬ ‫‪ ‬دستگاه سمی عقربها در انتهای دم قرار گرفته و شامل دو غده سمی است که در پوشش ضخیم کیتینی قرار‬ ‫دارد. این پوشش در انتها، نیش تیزی را تشکیل می دهد. دو غده سمی اغلب در سطح داخلی به یکدیگر‬ ‫چسبیده اند. هر غده معموال دارای کانال خروجی مستقلی است. هر یک از دو کانال کمی خمیده و دارای‬ ‫مجرای کوچکی هستند که در نزدیکی نوک نیش ، در قسمت خارجی و طرفین آن بوسیله سوراخی بیض ی‬ ‫شکل به بیرون باز می شوند.‬ ‫‪ ‬بافت ترشحی غده ها از جنس اپی تلیوم ساده ای است که دو دسته سلول در آن دیده می شود. یک دسته‬ ‫سلولهای کوچک غیر فعال به شکل نیمه مکعب که الیه نازکی را تشکیل می دهند و بعدا جایگزین سلولهای‬ ‫اصلی و فعال ترشحی می شوند. دسته دوم سلولهای اپی تلیال فعالند که دارای نوکلئوس و گرانولهای سمی‬ ‫قابل رویت هستند.‬ ‫‪ ‬شکل ساختمان غده سمی در تیره های مختلف ، اختالف هایی را نشان می دهند. سلولهای مولد سم در‬ ‫عقربها از نوع آپوکرین می باشند و تا وقتی سیتوپالسم در آنها وجود داشته باشد و نوکلئوس در آنها فعال‬ ‫باشد سم ترشح می شود‬ ‫51‬
  15. 15. 16
  16. 16. ‫عقرب ادونتوبوتوس دوریه‬ ‫‪‬‬ ‫از میان این 44 گونه ، 7 گونه عقرب ایران خطرناک و دارای اهمیت پزشکی‬ ‫هستند که عقرب ادونتوبوتوس دوریه (‪ )O.doriae‬یکی از آنهاست. این عقرب‬ ‫متعلق به خطرناکترین خانواده عقربها یعنی ‪ Buthidae‬جنس ‪ Buthus‬با دو زیر‬ ‫گونه ‪ doriae‬و ‪ Odonthurus‬است که در ایران وجود دارند. رنگ این عقرب‬ ‫زرد و دارای اندازه حدود 8 سانتیمتر در حالت بلوغ میباشد‬ ‫71‬
  17. 17. ‫پراکندگی:‬ ‫‪‬‬ ‫این عقرب بیشترین میزان پراکندگی شناخته شده در میان عقربهای ایران را داراست و‬ ‫در مناطق مرکزی ، جنوب و شمال شرقی ایران بیشتر یافت می شود.‬ ‫81‬
  18. 18. ‫ویژگی های زهر عقرب‬ ‫‪‬‬ ‫زهر زیر گروهی از سم می باشد که برای ایجاد اثرات مخرب باید از یک ارگانیسم‬ ‫به ارگانیسم دیگر تزریق شود. سم به تمام موادی اطالق می شود که بر مبنای‬ ‫تغییرات بیوشیمایی باعث بروز صدمه در موجودات زنده می گردد.‬ ‫‪‬‬ ‫بطور دقیق تر ، زهر ترکیب پیچیده ای از موادی است که برخی از آنها سمی اند و‬ ‫بقیه به عنوان حامل ، توزیع کننده و هضم کننده در ساختمان زهر به کار رفته اند.‬ ‫زهر معموال توسط سلولهای اپی تلیال ترشح می شود و در قسمت لومینای غدد‬ ‫اگزوکرین ذخیره می گردد‬ ‫91‬
  19. 19. ‫خصوصیات و اجزای زهر عقرب‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫زهر عقرب ماده ای پروتئینی است که در حالت تازگی و خلوص ، شفاف و بی رنگ و‬ ‫با ‪ pH‬خنثی تا اسیدی است. پودر آن سفید تا کرم روشن و کریستال آن زرد رنگ است.‬ ‫فاکتورهای فعال و خالص زهر عقرب در محلولهایی از قبیل متانول یا اتانول ، اتر ،‬ ‫کلرفورم ، بنزن ، گزیلن ، غیر قابل حل است. در صورتی که در آب به راحتی حل می‬ ‫شود. محلول این فاکتور ها در حرارت 001 درجه سانتی گراد به مدت 03-51 دقیقه ،‬ ‫تنها بخشی از فعالیت خود را از دست می دهد.‬ ‫اجزای تشکیل دهنده زهر عقرب و مقدار آنها به نوع عقرب و شرایط بوم شناسی محیط‬ ‫بستگی دارد. توکسین ها مهمترین اجزاء زهر عقرب بوده که اساسا پروتئین های بافری‬ ‫پایین در حدود 0007 دالتون هستند. پایداری باالی این سموم نیز به علت وزن مولکولی‬ ‫باشد. در ساختمان این توکسین ها ، یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد با 3-4 پل دی‬ ‫این پروتئین ها را فاکتور های سمی از قبیل نرو توکسین ، کاردیوتوکسین ، هموتوکسین‬ ‫می دهند.‬ ‫02‬
  20. 20. ‫‪ ‬از فاکتورهای سمی دیگر زهر عقرب می توان به آنزیم ها اشاره کرد. تنها آنزیمی که از نظر کمی به مقدار‬ ‫قابل توجهی در زهر عقرب یافت شود ، آنزیم هیالورونیداز می باشد ، گرچه در بعض ی از گونه ها نظیر‬ ‫بوتوس تامولوس ، فعالیت فسفودی استراز قابل توجه می باشد. انواع دیگر آنزیم ها با کمیتهای متفاوت‬ ‫در زهر انواع مختلف عقرب دیده می شود از جمله : فسفولیپاز 2‪ ، a‬فسفومنواستراز و 5’ نوکلئونیداز ،‬ ‫لیستیناز ، استیل کولین استراز و آنزیم های با اثر انعقادی و ضد انعقادی.‬ ‫‪ ‬در زهر عقرب اسیدهای آمینه آزاد و ترکیبات حلقوی هتروسیکل نظیر آمین ها نیز مشاهده می شود. از این‬ ‫ترکیبات می توان به هیستامین و سروتونین اشاره نمود .‬ ‫‪ ‬مطالعات نشان می دهد که سروتونین که جزیی از زهر عقرب می باشد ، باعث انقباض رگهای خونی در‬ ‫پستانداران می شود. با توجه به اینکه سروتونین باعث افزایش برانگیختگی ماهیچه ها می گردد، لذا‬ ‫موجب ایجاد درد می شود.‬ ‫‪ ‬هم چنین سروتونین موجود در زهر عقرب باعث انقباض رحمی و در نتیجه سبب سقط جنین در موش‬ ‫صحرایی می گردد. لذا عامل سقط جنین خود به خودی در سه ماهه اول بارداری در زنان عقرب گزیده را به‬ ‫سروتونین نسبت می دهند.‬ ‫12‬
  21. 21. ‫تقسیم بندی سموم عقرب‬ ‫‪‬‬ ‫در جامع ترین تقسیم بندی سموم بر اساس سنجش بیولوژیک (‪ )Bioassay‬به هنگام خالص سازی‬ ‫، توکسینهای عقرب به سه گروه ذیل تقسیم شده اند(52) :‬ ‫1. سموم موثر بر پستانداران (‪)Mammalian toxins‬‬ ‫2.‬ ‫سموم موثر بر حشرات (‪)Insect toxins‬‬ ‫3.‬ ‫سموم موثر بر سخت پوستان(‪)Crustaceous toxins‬‬ ‫‪‬‬ ‫در خانواده بوتیده که مهمترین عقربهای سمی دنیا در این خانواده قرار دارند ، تاکنون دو گروه اصلی‬ ‫از توکسین ها پیدا شده اند:‬ ‫1-پپتیدهایی که حاوی 07-16 اسید آمینه هستند (سموم موثر بر کانالهای سدیمی).‬ ‫2-پپتیدهایی که حاوی 93-63 اسید آمینه هستند (سموم موثر بر کانالهای پتاسیمی).‬ ‫22‬
  22. 22. ‫‪‬‬ ‫از لحاظ تاثیر بر روی نوع کانالها ، می توان سموم پپتیدی عقرب به 4 گروه عمده تقسیم‬ ‫کرد:‬ ‫1)پپتیدهایی با 07-06 اسید آمینه که دارای 4 پیوند دی سولفیدی هستند و بر روی کانالهای‬ ‫سدیمی تاثیر می گذارند(سموم ‪ α‬و سموم‪.)β‬‬ ‫سموم ‪ α‬باعث آهسته تر شدن روند غیر فعال سازی کانالهای سدیمی می شوند. این‬ ‫توکسینها بر روی کانالها ی سدیمی تاثیر می گذارند و سبب :‬ ‫الف) غیر فعال شدن جزیی کانال سدیم در حالت باز (طوالنی شدن پتانسیل عمل) و‬ ‫افزایش ورود یون سدیم به داخل سلول می شوند.‬ ‫ب) باعث تغییر کینتیک جریان ورود یون سدیم می شوند.‬ ‫سموم ‪ β‬عقرب 06-56 اسید آمینه با چهار باند دی سولفیدی دارند. این سموم باعث‬ ‫تغییر وابستگی به ولتاژ فعالسازی کانالهای سدیمی (شیفت منفی) و کاهش دا منه پیک‬ ‫جریان سدیمی می شوند‬ ‫32‬
  23. 23. ‫2)گروه دوم شامل دو زیر گروه یکی با زنجیره کوتاه 04-03 و دیگری با زنجیره بلند 46-06 اسید آمینه با 3تا‬ ‫4 پیوند دی سولفیدی است که کانالهای پتاسیمی را مهار می کنند (سموم‪ .)β‬این سموم باعث تغییر‬ ‫فعالیت وابسته به ولتاژ کانال به سمت هیپر پالریزاسیون می شوند.‬ ‫3)گروه سوم سموم پپتیدی ، بیشتر دارای 04-63 اسید آمینه با 4 پیوند دی سولفیدی هستند که می توانند‬ ‫کانالهای کلری را مهار می کنند.‬ ‫4)گروه 4 سموم عقرب ، پپتیدی موثر بر کانالهای کلسیمی حساس به رایونودین‬ ‫(‪ )Ryanodine- sensitive ca+2 channels‬هستند که ساختمان دقیق آنها تاکنون شناسائی‬ ‫نشده است.‬ ‫42‬
  24. 24. ‫کانال های سدیمی‬ ‫‪‬‬ ‫کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ مسئول ایجاد پتانسیل عمل در سلولهای‬ ‫تحریک پذیر مثل سلول های ماهیچه های اسکلتی ، اعصاب و سلول های قلبی هستند. کانال‬ ‫های سدیمی پروتئین های سرتاسری غشایی هستند که مسئول نفوذ پذیری وابسته به ولتاژ‬ ‫سدیم هستند که پتانسیل عمل را آغاز می کند. کانال های سدیم از یک زیر واحد آلفا سازنده‬ ‫ی منفذ با وزن ملکولی ‪ 260 KD‬به همراه 2 یا 3 زیر واحد کمکی 1‪ β3, β2,β‬تشکیل شده‬ ‫اند.‬ ‫‪‬‬ ‫زیر واحد آلفا از 4 ناحیه مشابه )‪(I-IV‬تشکیل شده است که هر کدام دارای 6 قطعه‬ ‫سرتاسری غشایی )6‪(S1-S‬و یک قطعه داخل شونده (2‪ )SS1/SS‬می باشند که با لوپ‬ ‫های پلی پپتیدی داخلی و خارجی ارتباط دارند.‬ ‫نروتوکسین هایی که بر روی کانال های سدیمی عمل می کنند ، توکسین هایی زنجیره بلند با‬ ‫67-06 توالی اسید آمینه و چهار پیوند دی سولفیدی درون زنجیره ای می باشند. این توکسین‬ ‫ها به سه دسته آلفاتوکسین ها ، بتاتوکسین ها و گاماتوکسین ها تقسیم می شوند.‬ ‫‪‬‬ ‫52‬
  25. 25. ‫کانال سدیمی‬ ‫62‬
  26. 26. ‫انواع نروکسین های اثر کننده بر کانال های سدیمی‬ ‫‪ ‬آلفا توکسین ها‬ ‫آلفا توکسین ها ، توکسین های پلی پپتیدی هستند که هر کدام از 07-06 توالی اسید آمینه با 4 پیوند‬ ‫دی سولفیدی تشکیل شده اند.‬ ‫آلفا توکسین ها را می توان بر حسب اثر بر روی موجودات به چهار گروه تقسیم کرد:‬ ‫1- آلفا توکسین های کالسیک ، که برای پستانداران خیلی اختصاص ی هستند.‬ ‫2- آلفا توکسین های حشرات ، که بر روی حشرات اثر دارند.‬ ‫3- شبه آلفا توکسین ها ، که بر روی هر دوی پستانداران و حشرات عمل‬ ‫می کنند.‬ ‫4- آلفا توکسین های بینابینی، که هم بر روی حشرات و هم بر روی پستانداران موثر هستند اما اثر آنها‬ ‫بر روی پستانداران بیشتر است‬ ‫72‬
  27. 27. ‫بتا توکسین ها‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫بتا توکسین ها پلی پپتیدی هایی با 56-06 توالی اس ی آمینه می باشند که مستقل از پتانسیل غشا، به‬ ‫گیرنده نوع 4 کانال های سدیمی متصل می شوند و بر فعال شدن این کانال ها تاثیر می گذارند. بتا‬ ‫توکسین های عقرب ، هم تغییر در وابستگی ولتاژی فعال شدن کانال سدیم در هیپرپالریزه شدن‬ ‫مستقیم و هم کاهش دامنه جریان سدیم را القا می کنند.‬ ‫از میان بتاتوکسین ها دوگروه مجزای توکسین های تحریکی و تضعیفی به حشرات اختصاص دارند.‬ ‫توکسین های تحریکی سبب یک فلجی سریع در حیوانات و القا تحریک مکرر اعصاب در حشرات می‬ ‫شوند. که همراه با کمی افزایش در هدایت سدیم و کند شدن روند غیر فعالسازی کانال سدیم می‬ ‫باشد.‬ ‫توکسین های تضعیفی سبب بلوک پتانسیل عمل های منتقل شده می شود و یک فلجی ضعیف‬ ‫ناش ی از دپالریزاسیون غشای عصبی و توقف انتقال سدیم در آکسون ها ایجاد می کند‬ ‫82‬
  28. 28. ‫گاما توکسین ها‬ ‫‪‬‬ ‫گاما توکسین ها ، در عقرب برزیلی تیتیوس سروالتوس یافت شده است و هر دوی این عملکردها‬ ‫دارا می باشند ، یعنی باز شدن و بسته شدن کانال های سدیمی را مهار می کنند.‬ ‫92‬
  29. 29. ‫عملکرد نروتوکسین های سم عقرب‬ ‫‪ ‬عملکرد آلفا توکسین ها:‬ ‫‪‬‬ ‫آلفا توکسین ها ی عقرب به گیرنده نوع 3 در کانال های سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ متصل‬ ‫می شوند . این محل اتصال در لوپ خارج سلولی بین قطعات 3‪ S‬و 4‪ S‬در ناحیه ‪ IV‬کانال های‬ ‫سدیمی قرار دارد. این محل گیرنده با محل گیرنده توکسین های شقایق دریایی و توکسین های‬ ‫عنکبوت فانل وب مشترک است. نکته مشترک بین این توکسین ها این است که سبب کند شدن‬ ‫روند غیرفعال سازی در کانال های سدیمی و در نتیجه طوالنی شدن پتانسیل عمل می شوند. از‬ ‫نظرمکانیکی روند غیر فعال شدن کانال سدیم عمدتا از جفت شدن وابسته به ولتاژ روند فعال‬ ‫شدن توسط حس گرهای ولتاژی (قطعات 4‪)S‬حاصل می گردد.‬ ‫03‬
  30. 30. ‫عملکرد بتا توکسین ها‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫بتا توکسین ها معموال در گونه های عقرب دنیای جدید (مانند سنتروروئیدس و تیتیوس) یافت شده‬ ‫، و سبب ممانعت و یا تاخیر در باز شدن کانال های سدیمی و در نتیجه مهار هدایت عصبی می‬ ‫گردند.‬ ‫بتاتوکسین ها سبب یک تغییر منفی در وابستگی ولتاژی فعال شدن می شوند و دامنه ی جریان برای‬ ‫کانال های سدیمی مغز و ایزوفرم های ماهیچه اسکلتی را کاهش می دهند.‬ ‫13‬
  31. 31. ‫کاربردهای درمانی سم عقرب‬ ‫‪ ‬علی رغم آثار زیان بار سم عقرب در بدن از سال 0791 میالدی به بعد که محققان موفق به خالص‬ ‫سازی توکسین های موجود در سم عقرب شدند و شناسایی مکانیسم مولکولی آنها انجام گرفت امید‬ ‫استفاده از این توکسین ها برای درمان سرطان مغز و اعصاب هر روز بیشتر می شود.‬ ‫‪ ‬با تزریق مستقیم نوعی از این توکسین ها همراه با رادیوتراپی ، تعدادی از بیماران مبتال به سرطان مغز‬ ‫مورد مداوا قرار داده اند. این توکسین ها به سلول های سرطانی حمله کرده و در آن ها ایجاد چسبندگی‬ ‫می نمایند. همین امر باعث می گردد سلول های سرطانی قدرت پخش شدن بیشتر را نداشته باشند و لذا‬ ‫رادیوتراپی برای کشتن سلول های سرطانی آسانتر می گردد ، در حالی که به سلول های سا لم صدمه ای‬ ‫وارد نمی گردد.‬ ‫‪ ‬در کشور کوبا داروی ضد سرطانی را از سم عقرب به نام اسکوزول تهیه نموده اند. این دارو نه تنها برای‬ ‫درمان سرطان مورد استفاده قرار می گیرد ، بلکه به صورت خوراکی برای درمان بیماری های دیگر مانند‬ ‫بیماری پارکینسون ، مشکالت کلیوی و التهاب لگن خاصره نیز به کار می رود. با اینکه سم عقرب برای‬ ‫انسان خطرناک می باشد ، اما ظاهرا این دارو در غلظت مورد استفاده خطرناک نیست و آن را به‬ ‫صورت خوراکی تجویز می کنند.‬ ‫23‬
  32. 32. ‫‪‬‬ ‫دانشمندان در مجله آکادمی ملی آمریکا مدعی شده اند که در سم عقرب موادی وجود دارد که‬ ‫قابلیت سرکوب سیستم ایمنی مربوط به سلول های ‪ T‬را دارا بوده و به همین دلیل احتمال‬ ‫استفاده از آن ها برای بیمارانی که پیوند عضو در آن ها صورت می گیرد وجود دارد.‬ ‫‪‬‬ ‫همچنین بعض ی از محققین در دانشگاه کالیفرنیا معتقد هستند که سم عقرب ممکن است بتواند‬ ‫است بتواند به عنوان دارویی بر علیه بیماری هایی مانند سل جلدی ، مولتی پل اسکلروسیز (‪)MS‬‬ ‫33‬
  33. 33. ‫‪ OD1 ‬اولین سم شبه آلفا جدا شده از زهر عقرب ایرانی موثر بر روی کانالهای سدیم‬ ‫وابسته به ولتاژ)‪VGSCS‬‬ ‫) پستانداران و حشرات می باشد. میزان بازیافت این سم از‬ ‫زهر در حدود تنها 2% می باشد. با استفاده از تکنیک ولتاژ – کالمپ دوالکترودی ،‬ ‫اثرات این سم بر روی سه کانال سدیمی )‪( 1.2/ β1 ، 1 NAV.β1 /5،PARA/TIPE‬‬ ‫‪ NAV‬بیان شده بر روی اووسیت قورباغه)‪ ) Xenopus laevis oocytes‬مطالعه‬ ‫شد. توانست پروسه غیر فعالسازی کانال حشره ‪ para/tipe‬را به میزان زیادی مهار‬ ‫نماید (‪ .)EC50= 80 ±14 nM‬در حالیکه بر روی کانال سدیمی 5.1‪ Nav‬تنها در‬ ‫غلظتهای میکروموالر موثر بود و بر روی کانال سدیمی مغزی 2.1 ‪ Nav‬تاثیری‬ ‫نداشت(3). در مطالعه دیگر ، مشخص شد که این سم می تواند باعث آهسته و طوالنی‬ ‫شدن پروسه غیر فعالسازی و افزایش میانگین ‪ Open-state‬کانال 7.1‪ Nav‬شود. به‬ ‫همین دلیل این سم از معدود سموم طبیعی موثر بر روی این کانال است که دارای اثرات‬ ‫اختصاصی بر روی درد مزمن ، و درد های التهابی و همچنین شرایط پاتولوژیک مانند‬ ‫سرطان پروستات می باشد.‬ ‫43‬
  34. 34. ‫افزایش ورود یون سدیم توسط 1‪ OD‬می تواند منجر به‬ ‫دپالریزاسیون غشاء )‪ (in vivo‬باقیمانده کانالهای 7.1 ‪ Nav‬در‬ ‫حالت غیر فعال و از دست رفتن تحریک پذیری الکتریکی‬ ‫نرونهای ادراک کننده درد )‪(Nociceptor‬و احساس بی دردی‬ ‫)‪ (Neuroligic‬می شود. باتوجه به اینکه 1‪ ( OD‬با بازیافت کم‬ ‫تنها 2% از زهر) یک پروب فارماکولوژیک و فیزیولوژیک‬ ‫اختصاصی موثر بر روی کانالهای خاص خصوصا سدیمی‬ ‫پستانداران 7.1‪ Nav‬و حشرات ‪ para/tipE‬شناخته شده است‬ ‫و همچنین بسیاری از اعمال بدن توسط کانالهای سدیمی‬ ‫میانجیگری می شود، اهمیت دسترسی به مقادیر مناسب این سم‬ ‫برای ادامه بررسی ها معلوم می شود..‬ ‫53‬
  35. 35. ‫ویژگی های 1‪OD‬‬ ‫‪ ‬خصوصیات بیوشیمي- بیوفیزیك1‪:OD‬‬ ‫تعداد اسيد آمينه: 56‬ ‫وزن مولكولي: 1.5127 دالتون‬ ‫نقطه ايزو الكتريك تئوريك: 76.7‬ ‫63‬
  36. 36. ‫تعداد و درصد تركيبات اسيد آمينه آن:‬ ‫73‬
  37. 37. ‫‪ ‬تعداد اسید آمینه باردار منفي (‪7 :)Asp+Glu‬‬ ‫‪ ‬تعداد اسید آمینه باردار مثبت (‪8 :)Arg+ Lys‬‬ ‫‪ ‬تركیبات اتمي 1‪:OD‬‬ ‫‪ ‬كربن(‪308 :)C‬‬ ‫‪ ‬هیدروژن (‪473 :)H‬‬ ‫‪ ‬نیتروژن (‪89 :)N‬‬ ‫‪ ‬اكسیژن (‪96 :)O‬‬ ‫‪ ‬سولفور (‪8 :)S‬‬ ‫‪ ‬فرمول مولكولي: 8‪C308H473O96S‬‬ ‫‪ ‬تعداد كل اتمهاي آن: 479‬ ‫83‬
  38. 38. ‫مقایسه ترتیب اسید آمینه 1‪ OD‬با سموم عقرب مشابه:‬ ‫‪ ‬مقایسه ساختمان اولیه تعدادي از سموم آلفا، شبه آلفا و سموم حشرات عقرب با 1‪ OD‬انجام‬ ‫شده است. 61 آمینه اسید در موقعیت مشابه 1‪ OD‬با بقیه سموم تكرار شده است. ترتیب‬ ‫هاي اسید آمینه بر اساس اسید آمینه سیستئین (‪ )C‬تراز شده است.‬ ‫‪‬‬ ‫آلفا، شبه آلفا و سموم حشرات تقسیم شده اند .‬ ‫‪ ‬ترتیب 1‪ OD‬با استفاده از وب سایت (‪ (http://www.ebi.ac.uk/clustal‬و‬ ‫برنامه ‪ ClustalW‬با سایر سكونس ها تراز و مقایسه شد. سموم ‪( LqqIV‬سم آلفا‬ ‫از ‪Leiurus quinquestriatus‬با 29% تشابه)، ‪( LqhIV‬سم آلفا از ‪Leiurus‬‬ ‫‪quinquestriatus hebreaus‬با %19 تشابه)، ‪( BjαIT‬یك سم حشره آلفا از‬ ‫‪ Buthus judaicus‬با 97% تشابه) و 2‪ ( BmK M1/BmK M‬یك سم شبه آلفا از‬ ‫‪ Buthus martensii Karsch‬با 57% تشابه) و‪( LqhαIT‬یك سم شبه آلفا‬ ‫از‪ Leirus quinquestriatus hebreaus‬با 37% تشابه ) حداكثر تشابه با ترتیب‬ ‫اسید امینه 1‪ OD‬را دارد.‬ ‫93‬
  39. 39. ‫مقایسه ترتیب اسید آمینه 1‪ OD‬با سموم مشابه است. در سمت راست، درصد مشابهت اسید‬ ‫آمینه سم با 1‪ OD‬بر حسب درصد آمده است. ساختمان ثانویه در قسمت باالي سموم آمده‬ ‫است (‪ (*) .)B= β-sheet, T= turn, H= α-helix‬نشاندهنده اسید آمینه هائي است كه در‬ ‫تمام سموم حفظ شده است‬ ‫04‬
  40. 40. ‫به بيان برخي تفاوتهاي موجود در ساختمان شبه آلفا 1‪ OD‬در مقايسه با برخي سموم‬ ‫شناخته شده:‬ ‫‪ -1 ‬اسيدهاي آمينه آروماتيك 1‪(Tyr5, Tyr14, Tyr21, Tyr35, ( BmK M‬‬ ‫74‪ )Trp38, Tyr42 and Trp‬همانند 1‪ OD‬مي باشد.‬ ‫‪ -2 ‬جايگزيني 8‪ Lys‬با‪ Asp‬در 1‪( BmK M‬كه در 1‪ OD‬وجود دارد) مانند سموم كالسيك‬ ‫آلفا توكسین 2‪ Lqh2 ،AaH‬و 5‪ Lqq‬باعث كاهش چشمگیر در ميل اتصالي با كانالهاي‬ ‫سديم حشرات شده است در حاليكه در 1‪ OD‬اين چنین نيست.‬ ‫‪-3 ‬اسيد هاي آمينه بازي 26-85 در ناحيه ‪ )58-64( C-terminus‬شديدا بر ميل اتصالي‬ ‫1‪ BmK M‬بر تمام كانالها از جمله حشرات تاثیر دارد. جابجائي هيستدين (5.0+) با آرژنین‬ ‫(1+) در موقعيت 46 در ترتيب اسيد آمينه 1‪ OD‬بايستي مورد توجه قرار گیرد. جالب آنكه‬ ‫ناحيه 1‪ C-terminus OD‬علیرغم دارا بودن اثر قوي بر كانال حشرات، شباهت تام با‬ ‫سموم كم اثر بر حشرات 4‪ Lqq‬و 4‪ Lqh‬دارد.‬ ‫14‬
  41. 41. ‫‪-4 ‬جایگزیني موقعیت 46 (اغلب هیستیدین (5.0+) در سموم شبه آلفا) با اسید‬ ‫آمینه فاقد بار آالنین در 1‪ BmK M‬سبب كاهش اتصال با كانالهاي حشرات شده‬ ‫است. در توافق با مطلب باال مي بایست ببینیم كه آیا جایگزیني هیتیدین با آرژنین‬ ‫(1+) در 1‪ OD‬فعالیت آنرا بر روي كانال حشرات حفظ خواهد كرد؟. اگر چه‬ ‫4‪ Lqq‬و4‪ Lqh‬با فعالیت اندك بر حشره داراي آرژنین در موقعیت 46 هستند. به‬ ‫نظر میرسد كه این موقعیت نقش مهمي در اتصال به كانالهاي حشرات نداشته باشد.‬ ‫‪‬‬ ‫5-اسید هاي آمینه 1‪ OD‬در سطح هیدروفوبیك مانند 5‪ Tyr‬و اطراف آن 35 ‪Asp‬‬ ‫(نزدیك به این سطح و نیز اسید هاي آمینه ‪ )N-terminal‬و 12‪ Tyr‬و 82‪ Lys‬در‬ ‫سطح ‪( B‬در آلفا-هلیكس 82-91 در مقابل سطح هیدروفوبیك قرار دارد) مشابه‬ ‫سموم شبه آلفا است. با توجه به جایگزیني ‪ K28E‬كه منجر به كاهش اتصال كانالهاي‬ ‫سدیم ماهیچه و حشرات مي شود، میتوان حدس زد كه فعالیت اتصالي 1‪ OD‬بیش از‬ ‫سموم 7‪ Lqh‬و 3‪ Lqh‬باشد.‬ ‫24‬
  42. 42. ‫‪ -6 ‬موتاسیون ‪ K8/D‬در ‪( LqhαIT‬كه در 1‪ OD‬و 1‪ BmK M‬وجود دارد) سبب تاثیر‬ ‫باالئي بر محل اتصال كانال حشرات و تغییر در ساختمان ثانویه ‪( LqhαIT‬شاید به دلیل‬ ‫تغییر بار در این محل) شده است (فعالیت 1‪ OD‬بر روي كانال حشرات میتواند با دو سم‬ ‫مقایسه شود).‬ ‫‪ -7 ‬جایگزیني ‪ R/A‬در موقعیت 81 ‪ LqhαIT‬تایید كننده اثر بار در فعالیت سموم بوده است‬ ‫(87% فعالیت بر روي كانال حشرات حفظ گردید). ‪ R/A‬در1‪ OD‬وجود دارد. با بررسي‬ ‫اثر 1‪ OD‬بر كانال حشرات میتوان اثر موقعیت 81 داراي بار بر فعالیت سم بررسي شود.‬ ‫‪ ‬خالصه اینكه به نظر میرسد كه سم شبه آلفا 1‪ OD‬داراي تفاوتهاي تقریبا باالئي از لحاظ‬ ‫ساختمان اولیه و در نتیجه ساختمان ثانویه با سایر سموم شبه آلفا دارد. شاید مطالعات‬ ‫موتاژنز بر روي این سم میتواند نقاط و نواحي دیگر مهم دیگر موجود در سموم شبه آلفا كه‬ ‫نقش آنها در اعمال سموم شبه آلفا داراي اهمیت بیشتر و یا ناشناخته مانده باشد، روشن‬ ‫نماید.‬ ‫34‬
  43. 43. ‫مواد و روش ها‬ ‫44‬
  44. 44. ‫مواد و محلولهای استفاده شده:‬ ‫54‬
  45. 45. ‫فهرست دستگاه های مورد استفاده:‬ ‫64‬
  46. 46. ‫آنزیم های مورد استفاده شده:‬ ‫‪ ‬مارکر‬ ‫مارکر ‪ )1/0μg/μl( 50bp‬که محصول شرکت ‪ Fermentase‬بود، در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت‬ ‫74‬
  47. 47. ‫طرز تهیه ی محلول ها و بافر های مورد استفاده:‬ ‫‪‬‬ ‫آب تیمار شده با ‪DEPC‬‬ ‫‪ DEPC‬یک عامل بسیار قوی در غیر فعال سازی آنزیم ‪ RNase‬از طریق تشکیل گروه های هیستیدیل می باشد. بسته‬ ‫به حجم آب مقطر، به میزان 0/1درصد ‪ DEPC‬به آب افزوده می شود. سپس ظرف آب به شدت تکان داده می شود تا‬ ‫‪ DEPC‬کامال در آب توزیع شود. پس از قرار گرفتن ظرف به مدت 21 ساعت در دمای اتاق، به منظور غیر فعال‬ ‫کردن ‪ DEPC‬به مدت 51 دقیقه اتوکالو می شود.‬ ‫‪ ‬بافر ‪)10X(TBE‬‬ ‫801 گرم از تریس، 55 گرم بورات و 9/3 گرم از ‪ EDTA‬را بعد از توزین در یک لیتر آب مقطر حل‬ ‫کرده و بعد در مواقع نیاز از ‪ 10X‬به مقدار ‪ 1X‬رقیق می شود و در تانک الکترو فورز استفاده‬ ‫می شود.‬ ‫84‬
  48. 48. ‫‪‬‬ ‫ژل آگارز 1/5 درصد‬ ‫73/. گرم آگارز در 52 میلی لیتر از بافر ‪ 1X TBE‬حل شده و استفاده می شود.‬ ‫‪ ‬محلول رنگ اتیدیوم بروماید )‪)10 mg/ml‬‬ ‫01 میلی گرم اتیدیوم بروماید را با 1 میلی لیتر آب مقطر مخلوط کرده و در زیر هود و‬ ‫قرار داده و پس از حل شدن کامل، محلول در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می‬ ‫‪ ‬بافر بار گذاری (‪)6X‬‬ ‫در این تحقیق از بافر بار گذاری (‪ )6X‬که محصول شرکت ‪ Fermentase‬بود استفاده شد.‬ ‫این بافر حاوی )6.7 ‪ %03/0 ،10 mM Tris-HCl(pH‬برومو فنول بلو، 0/30% زایلن‬ ‫سیانول ‪ %60،FF‬گلیسرول و‪ EDTA 60mM‬می باشد.‬ ‫94‬
  49. 49. ‫روش ها:‬ ‫‪ ‬نمونه گیری‬ ‫محل نمونه گیری به خوبی توسط الکل ضد عفونی شد و پنس و قیچی های مورد استفاده به همراه نوک سمپلر ها و‬ ‫میکروتیوب های حجم های مختلف دوبار اتوکالو گردید. نمونه های عقرب ادنتوبوتوس دوریه از بخش جانوران‬ ‫سمی موسسه رازی کرج تهیه شد. غدد زهری عقربها با استفاده از پنس و قیچی استریل جدا شده و جهت فریز کردن‬ ‫و آسان تر شدن عمل له کردن، نمونه ها در نیتروژن مایع قرار داده شد، سپس با استفاده از مورتار و پیستل‬ ‫نمونه ها له گردید.‬ ‫‪ ‬استخراج ‪RNA‬‬ ‫استخراج ‪ RNA‬با استفاده از کیت استخراج )‪ Total RNA (QIAGEN‬صورت گرفت.‬ ‫مشکل ‪ RNase‬ها؟‬ ‫05‬
  50. 50. ‫مراحل استخراج ‪ Totol RNA‬از غده ی سمی عقرب 1‪OD‬‬ ‫‪‬‬ ‫1- به اندازه ی 03 میلی گرم از بافت تازه حیوانی جدا شد( نباید بیش از 03 میلی گرم باشد). سپس در میکروتیوب مناسب‬ ‫قرار داده شد.‬ ‫وزن میکروتیوب خالی: ‪0.93 g‬‬ ‫وزن میکروتیوب + بافت: ‪0.95 g‬‬ ‫‪‬‬ ‫2- بافت را به وسیله مورتار و پیستل کامال له کرده و به آن ‪ 600 μl‬از بافر ‪ RTL‬اضافه شد.‬ ‫‪‬‬ ‫3- بافت به خوبی له شده و به همراه بافر اضافه شده خوب مخلوط شد به طوری که کامال یکنواخت گردید.‬ ‫این کار روی یخ و در کمترین زمان ممکن انجام شد تا ‪ RNase‬ها فعال نشوند.‬ ‫‪‬‬ ‫4- مخلوط به دست آمده یا ‪ lysate‬به مدت 3 دقیقه و با بیشترین سرعت سانتریفوژ شد.‬ ‫‪‬‬ ‫5- محلول رویی با استفاده از پیپت به دقت به یک تیوب سانتریفوژ جدید منتقل گردید. دقت شد که همراه محلول رویی‬ ‫چیزی وارد نوک سمپلر نشود.‬ ‫‪‬‬ ‫6- به اندازه ی حجم محلول رویی به آن اتانول 07% اضافه شد. حجم آن بین ‪ 350-600lμ‬بود. حجم اتانول به حجم محلول‬ ‫رویی بستگی دارد. در این مرحله نباید از سانتریفوژ استفاده شود و مخلوط کردن فقط از طریق چند بار پیپت کردن انجام‬ ‫شد.‬ ‫15‬
  51. 51. ‫‪‬‬ ‫6- به اندازه ی حجم محلول رویی به آن اتانول 07% اضافه شد. حجم آن بین ‪ 350-600lμ‬بود. حجم‬ ‫اتانول به حجم محلول رویی بستگی دارد. در این مرحله نباید از سانتریفوژ استفاده شود و مخلوط کردن‬ ‫فقط از طریق چند بار پیپت کردن انجام شد.‬ ‫‪‬‬ ‫7- از مخلوط به دست آمده به اندازه ی ‪ 700lμ‬یا بیشتر برداشته و در یک ستون ریخته شد. ستون در‬ ‫یک تیوب 2 میلی لیتری قرار گرفت. در ستون محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از‬ ‫‪ 10000rpm‬سانتریفوژ شد. این مخلوط با خود رسوباتی به همراه داشت.‬ ‫‪‬‬ ‫8- محلول خارج شده از ستون پس از سانتریفوژ دور ریخته شد.از همان تیوب 2 میلی لیتر برای مرحله‬ ‫ی بعد استفاده شد که در زیر ستون قرار داده شد.‬ ‫‪‬‬ ‫9- ‪ 700lμ‬از بافر 1‪RW‬به ستون اضافه شد. در آن محکم بسته شده به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از‬ ‫‪ 10000 rpm‬سانتریفوژ شد.‬ ‫‪‬‬ ‫01- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده‬ ‫گردید.‬ ‫‪‬‬ ‫11- ‪ 500lμ‬از با فر ‪ RPE‬به ستون اضافه شد، در آن محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش‬ ‫از ‪10000 rpm‬سانتریفوژ شد.‬ ‫25‬
  52. 52. ‫‪‬‬ ‫7- از مخلوط به دست آمده به اندازه ی ‪ 700lμ‬یا بیشتر برداشته و در یک ستون ریخته شد. ستون در‬ ‫یک تیوب 2 میلی لیتری قرار گرفت. در ستون محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش از‬ ‫‪‬‬ ‫‪‬‬ ‫‪ 10000rpm‬سانتریفوژ شد. این مخلوط با خود رسوباتی به همراه داشت.‬ ‫8- محلول خارج شده از ستون پس از سانتریفوژ دور ریخته شد.از همان تیوب 2 میلی لیتر برای‬ ‫مرحله ی بعد استفاده شد که در زیر ستون قرار داده شد.‬ ‫‪‬‬ ‫9- ‪ 700lμ‬از بافر 1‪RW‬به ستون اضافه شد. در آن محکم بسته شده به مدت 51 ثانیه با سرعت بیش‬ ‫از ‪ 10000 rpm‬سانتریفوژ شد.‬ ‫‪‬‬ ‫01- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده‬ ‫گردید.‬ ‫‪‬‬ ‫11- ‪ 500lμ‬از با فر ‪ RPE‬به ستون اضافه شد، در آن محکم بسته شد و به مدت 51 ثانیه با سرعت‬ ‫بیش از ‪10000 rpm‬سانتریفوژ شد.‬ ‫‪‬‬ ‫21- محلول خارج شده از ستون دور ریخته شد. از تیوب 2 میلی لیتری برای مرحله ی بعد استفاده‬ ‫35‬
  53. 53. ‫‪‬‬ ‫31- مجددا ً ‪ 500lμ‬از بافر ‪ RPE‬به ستون اضافه شده مرحله ی قبل تکرار شد.ولی مدت سانتریفوژ‬ ‫به 2 دقیقه افزایش داده شد.‬ ‫‪‬‬ ‫41- در این مرحله ستون از تیوب زیر آن به آرا می بر داشته شد و دقت گردید که با محلول درون‬ ‫آن که حاوی اتانول است برخورد نکند.‬ ‫‪‬‬ ‫51- ستون درون یک تیوب جدید 2 میلی لیتری قرار گرفت. در آن محکم بسته شده و به مدت 1‬ ‫دقیقه با آخرین دور سانتریفوژ شد.( این مرحله برای اطمینان از خروج بافر های مراحل قبل از‬ ‫ستون انجام گردید.)‬ ‫‪‬‬ ‫61- ستون را درون یک تیوب 5-1 میلی لیتری جدید قرار داده و به اندازه ی ‪ 30-50lμ‬آب بدون‬ ‫‪ RNase‬به ستون مستقیما ً اضافه گردید. در ستون محکم بسته شده و به مدت یک دقیقه با سرعت‬ ‫‪ 10000 rpm‬سانتریفوژ گردید.( برای ‪ Elute‬کردن ‪.)RNA‬‬ ‫45‬
  54. 54. ‫تهیه ‪cDNA‬‬ ‫‪‬‬ ‫الگوی ‪RNA‬می تواند به عنوان هدف در تکنیک ‪ RT-PCR‬به کار گرفته شود به شرطی که ‪RNA‬ی استخراج‬ ‫شده با استفاده از آنزیم ترا نس کریپتاز معکوس به ‪cDNA‬تبدیل گردد.‬ ‫پارامترهای سنتز ‪cDNA‬‬ ‫55‬
  55. 55. ‫مراحل سنتز ‪ cDNA‬از ‪:Total RNA‬‬ ‫‪‬‬ ‫1-‪ RNA‬ی الگو پس از در آوردن از فریزر 07- درجه ی سانتی گراد روی یخ قرار داده شد.‬ ‫محلول پرایمر ،بافر ‪،RT‬مخلوط‪ dNTP‬و آب بدون ‪ RNase‬در دمای اتاق قرار داده شد. (بهتر‬ ‫است این کارروی یخ انجام شود. )‬ ‫‪‬‬ ‫2- ‪ RNase Inhibitor‬با استفاده از بافر ‪ )1x( RT‬رقیق شد به طوری که غلظت نهایی آن‬ ‫‪ 10 Unit/ml‬گردید. خود بافر ‪ RT‬با استفاده از آب بدون ‪ RNase‬به صورت (‪ )1x‬رقیق شد.‬ ‫‪‬‬ ‫محلول رقیق شده ی ‪ RNase Inhibitor‬با ‪ Vortex‬به مدت کمتر از 5 ثانیه مخلوط شد. و به‬ ‫مدت کمتر از یک دقیقه سانتریفوژ گردید.‬ ‫‪‬‬ ‫3- یک ‪ Master mix‬مطابق جدول 2-3 تهیه گردید. به وسیله ی ‪ Vortex‬میکس حاصل‬ ‫مخلوط گردیده و به مدت کمتر از یک دقیقه سانتریفوژ شده وروی یخ قرار داده شد.‬ ‫‪‬‬ ‫4- ‪RNA‬ی الگو به میکس مورد نظر اضافه گردید.( ‪ Vortex‬کمتر از 5ثانیه و سانتریفوژ کمتر‬ ‫از یک دقیقه انجام شد).‬ ‫‪‬‬ ‫5- به مدت یک ساعت در دمای 73درجه سانتیگراد قرار گرفت.‬ ‫65‬
  56. 56. ‫تکثیر ژن 1‪ OD‬توسط واکنش ‪PCR‬‬ ‫)‪(polymerase chain reaction‬‬ ‫‪‬‬ ‫تکنیک ‪ PCR‬در اواسط دهه 0891 بوسیله کری مولیس معرفی شد. ‪ PCR‬از نظر اصول علمی شباهت زیادی به‬ ‫همانند سازی ‪ DNA‬دارد و در واقع برگرفته از آن است. ‪ PCR‬روش ی حساس ، انتخابی و بسیار سریع برای‬ ‫ازدیاد یک توالی مورد نظر ‪ DNA‬می باشد. ترکیبات ضروری برای انجام یک واکنش ‪ PCR‬شامل مولکول های‬ ‫‪ DNA‬الگو ، آغازگرها ،‪ DNA‬پلیمر از مقاوم به حرارت و ‪ dNTP‬می باشد. مخلوط واکنش طی واکنش ‪PCR‬‬ ‫به سرعت درون دستگاه ترموسایکلر سرد و گرم می گردد و در مدت کوتاهی تعداد زیادی از ‪ DNA‬الگو فراهم می‬ ‫شود. در واکنش ‪ PCR‬دو رشته ‪ DNA‬در دمای 59 درجه سانتیگراد از هم باز شده و در دمای 56-05 درجه‬ ‫سانتیگراد آغازگرها به نواحی مکمل متصل شده و در دمای 27 درجه سانتیگراد فرایند سنتز صورت می گیرد. زمان‬ ‫و درجه حرارت دو پارامتر مهم در ‪ PCR‬می باشند. آغازگر ها طوری طراحی می شوند که مکمل دو طرف توالی هدف‬ ‫خاص در ‪ DNA‬الگو باشند.‬ ‫‪-kary mullis‬‬ ‫2‬ ‫‪-amplification‬‬ ‫3‬ ‫‪-primer‬‬ ‫4‬ ‫75‬
  57. 57. ‫آغازگرها طولی حدود ‪ 17-24 bp‬دارند. دو آغازگر رفت و برگشت نباید مکمل باشند زیرا در طی مراحل‬ ‫‪ PCR‬تشکیل پرایمر – دایمر می دهند و واکنش ‪ PCR‬به خوبی صورت نمی گیرد. دو آغازگر باید دمای ذوب (‪ )Tm‬نزدیک به هم‬ ‫داشته باشند (6). ‪Tm‬به ترکیب بازی الیگونوکلئوتید و تعداد بازها بستگی دارد. جهت محاسبه ‪ Tm‬برای آغازگرهای با طول بیشتر‬ ‫از 02 نوکلئوتید ، از فرمول زیر استفاده می شود(8):‬ ‫طول آغازگر /005-)‪Tm= 63/20c + 0/410c (0/0G+C‬‬ ‫دمای اتصال هر آغازگر 5-2 درجه کمتر از دمای ذوب آن می باشد هر چه دمای اتصال آغازگرها زیادتر باشد اختصاص ی بودن‬ ‫اتصال آنها به توالی مورد نظر بیشتر می شود و هر چه دمای اتصال کمتر شود اتصال آغازگرها به نواحی مکمل غیر اختصاص ی‬ ‫بیشتر شده و محصوالت ناخواسته افزایش می یابد. در هر چرخه از واکنش ‪ PCR‬محصوالت چرخه قبل به عنوان الگو استفاده‬ ‫می شود.‬ ‫به طوری که هر چه تعداد چرخه بیشتر باشد محصوالت بیشتری بدست می آید . اما باید توجه داشت که تعداد زیاد چرخه ها باعث‬ ‫ایجاد محصوالت غیر اختصاص ی شده و در نتیجه در پایان باندهای کاذب دیده می شود . جهت انجام واکنش ‪ PCR‬باید از ‪DNA‬‬ ‫پلیمراز مقاوم به گرما استفاده شود، چراکه در غیر این صورت ، این آنزیم طی هر چرخه دناتوره شدن با گرما ، تخریب می گردد‬ ‫‪1-melting temperature‬‬ ‫85‬
  58. 58. ‫مواد الزم جهت انجام هر واکنش ‪PCR‬‬ ‫95‬
  59. 59. ‫شرایط دمایی واکنش ‪:PCR‬‬ ‫در واکنش ‪ PCR‬سه دمای مختلف به کار می روند. ابتدا دمای واسرشت سازی که‬ ‫حدود 59-29 درجه سانتی گراد می باشد،که برای جدا شدن دو رشته ‪ DNA‬به‬ ‫کار می رود. با توجه به خصوصیت ‪ DNA‬الگو، دما و زمان تا حد امکان کم می‬ ‫باشد، به منظور بهتر باز شدن دو رشته ‪ DNA‬قبل از شروع سنتز به مدت‬ ‫3 دقیقه و در چرخه های بعد به مدت 03 ثانیه در 49 درجه سانتی گراد قرار داده شد.‬ ‫دمای دوم که به آن دمای اتصال می گویند، حدود 06-73 درجه سانتی گراد می‬ ‫باشد.‬ ‫هر آغازگر دمای اتصال ویزه ای دارد. در این دما آغازگرها می توانند به طور‬ ‫اختصاصی به توالی مکمل مورد نظر در ‪DNA‬الگو متصل شوند .دمای سوم دمای‬ ‫گسترش است که حدود 27-76 درجه سانتی گراد برای آنزیم های ‪DNA‬پلیمراز‬ ‫می باشد.‬ ‫‪1-Denaturation‬‬ ‫‪2-Annealing‬‬ ‫‪3-Extension‬‬ ‫06‬
  60. 60. ‫الکتروفورز‬ ‫به منظور بررس ی محصول واکنش زنجیره ای پلیمراز، 01 میکرولیتر از نمونه با 02 میکرولیتر بافر‬ ‫بارگذاری ‪ 6X‬مخلوط و به چاهک های ژل آگارز 1/5 درصد حاوی بافر ‪ TBE‬اضافه شد و با ولتاژ‬ ‫ثابت 58 به مدت 03 دقیقه الکتروفورز گردید، سپس ژل در محلول 5/ . میکروگرم در میلی لیتر‬ ‫اتیدیوم بروماید(‪ )10mg/ml‬به مدت 02 دقیقه قرار داده شد و سپس رنگ آمیزی گردید و با‬ ‫استفاده از دستگاه ژل داک عکسبرداری شد.‬ ‫.‬ ‫16‬
  61. 61. ‫استخراج ‪RNA‬‬ ‫با استفاده از کیت استخراج ، ‪ RNA‬از نمونهها جداسازی شد. ‪ RNA‬استخراجی در یخچال 07- درجه‬ ‫سانتیگراد نگهداری و سپس از این ‪ RNA‬های استخراج شده، ‪ cDNA‬سنتز گردید.‬ ‫تکثیر ژن 1‪ OD‬با استفاده از تکنیک ‪RT-PCR‬‬ ‫تهیه ‪cDNA‬‬ ‫با استفاده از آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (فرمنتاز) و آغازگر ‪ ،F‬نمونههای ‪ RNA‬استخراج شده به ‪cDNA‬‬ ‫تبدیل شدند.‬ ‫طراحی آغازگرها‬ ‫برای این منظور ابتدا توالیهای مربوط به ژنهای کد کنندة نرو توکسینهای مشابه که قبالً در عقربهای‬ ‫این خانواده شناسایی شده و در بانک ژن (‪ )NCBI‬موجودند، با استفاده از نرم افزار ‪Blast:homology‬‬ ‫‪ search‬با یکدیگر مقایسه شدند. پس از بررسیهای متعدد، بیشترین تشابه در مورد ژنهای کد کنندة‬ ‫نروتوکسینهای متعلق به عقربهای آندروکتونوس استرالیس و مزوبوتوس مارتنزی مشاهده شد. برای‬ ‫طراحی آغازگرها از توالیهای یکسان و حفظ شده در نواحی مشابه که در ابتدا و انتها به ترتیب حاوی‬ ‫کدون شروع (‪ )ATG‬و کدون خاتمه (‪ )TGA‬بودند، استفاده گردید. همچنین در ادامه، تشابه توالی‬ ‫اسیدآمینههای نروتوکسینهای این گونهها با استفاده از نرم افزار ‪ Blast-primer Design‬بررسی و‬ ‫مقایسه شده و نواحی مشابه مجددا ً برای طراحی توالی آغازگرها مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت‬ ‫آغازگرها به صورت ‪Degeneratet primer‬‬ ‫طراحی شدند.‬ ‫26‬
  62. 62. (A)- Alignment of Amino acid sequence of OD1 Toxin with other toxins in the gene bank NCBI. The nomers indicate the accession number of Amino acid sequences according the NCBI. 1NH5_A 2 DGYPVDSKGCKLSCVA.[1].NYCDNQCKM.[1].KASGGHCYAMS CYCEGLPENA 49 OD1 4 DAYIADDKNCVYTCAS.[1].GYCNTECTK.[1].GAESGYCQWIG.[5].CWCIKLPDEV 65 gi 20140244 22 DAYIAKPHNCVYECAR.[1].EYCNDLCTK.[1].GAKSGYCQWVG.[5].CWCKELPDNV 74 1OMY_A 4 DAYIAQNYNCVYHCAR.[1].AYCNELCTK.[1].GAKSGSCPYLG.[5].CYCKDLPDNV 56 1LQH 4 DAYIAKNYNCVYECFR.[1].AYCNELCTK.[1].GASSGYCQWAG.[5].CWCYALPDNV 56 gi 20140302 11 DAYIAKNYNCVYHCFR.[1].DYCNGLCTE.[1].GADSGYCYLAG.[5].CWCINLPDDK 63 gi 134376 3 DAYIADDRNCVYTCAL.[1].PYCDSECKK.[1].GADGSYCQWLG.[5].CWCKNLPDDV 55 gi 134373 3 DGYIADDKDCAYFCGR.[1].AYCDEECKK gi 134365 3 DGYIVDDKNCTFFCGR.[1].AYCNDECKK.[1].GGESGYCQWAS.[5].CWCYKLPDRV 55 GAESGKCWYAG.[5].CWCYKLPDWV 54 gi 20140304 22 DGYIADDRNCPYFCGR.[1].AYCDGECKK.[1].RAESGYCQWAS.[5].CWCYKLPDDA74 (B)- DNA SEQUENCE OF THE OD1 TOXIN FROM THE AMINO ACID SEQUENCE MADE BY THE SOFTWARE OLIGOS: GGNGTNCGNGAYGCNTAYATHGCNGAYGAYAARAAYTGYGTNTAYACNTGYGC NTCNAAYGGNTAYTGYAAYACNGARTGYACNAARAAYGGNGCNGARTCNGG NTAYTGYCARTGGATHGGNCGNTAYGGNAAYGCNTGYTGGTGYATHAARCT NCCNGAYGARGTNCCNATHCGNATHCCNGGNAARTGYCGN (195 BP) 63
  63. 63. )C(-PRIMER SEQUENCES: OD1-VF: 5- TNCGNGAYGCNTAYATHGCNGAYGAY-3 OD1-VR: 5- AYTTNCCNGGDATNCGDATNGGN-3 (D)- Degenerate alphabet used by CODEHOP: A A C C G G T T AG R CT Y AC M GT K AT W CG S CGT B AGT D ACT H ACG V ACGT N ‫ بر اساس سکونس های اسید آمینه‬OD1 ‫)- سکونس های سم‬B( ‫ با سموم همولوگ‬OD1 ‫(– مقایسه اسید آمینه های سم‬A): ‫)- پرایمرهای طراحی شده‬C( ‫ها‬ 64
  64. 64. ‫تفسیر نتایج‬ ‫‪‬‬ ‫نتیجه ای که از گرادیان دمایی ‪PCR‬حاصل شد مطابق شکل 1 در دو دمای 65 و85 درجه فقط اسمیر مشاهده‬ ‫شد، به منظور اصالح و بهینه سازی ‪ PCR‬از همین محصوالت به عنوان ‪ Template‬استفاده شد و مجددا‬ ‫‪ RePCR‬گذاشته شد. شرایط گرادیان دمایی مورد استفاده جهت بهینه سازی ‪ PCR‬برای تکثیر ژن 1‪OD‬‬ ‫مطابق شرایط مندرج در جدول زیر اجرا گردید.‬ ‫56‬
  65. 65. ‫‪‬‬ ‫و طبق عکس شماره 2 در دو دمای 65و85 درجه عالوه بر باند مورد نظر چندین باند کاذب دیگر نیز مشاهده شد. به‬ ‫همین منظور باند مورد نظر از روی ژل الکتروفورز ‪ cut‬شده و با استفاه از کیت تخلیص، از ژل خالص سازی شد و‬ ‫سپس مجددا با این محصوالت تخلیص شده ‪ PCR‬انجام شد و نتیجه ی نهایی عکس شماره 3 به دست آمد. البته‬ ‫همانطور که در شکل نشان داده شده است، ابتدا محصول تخلیص شده به نسبت 01:1 و 5:1 با آب مقطر استریل‬ ‫رقیق شد و سپس در ‪ PCR‬استفاده گردید، اما چون محصول ‪ PCR‬باند ضعیفی داد، مجددآ و بدون رقیق کردن‬ ‫با حجم های 1و2 و3 و4 و5 و6 میکرو لیتر از محصول تخلیص شده ‪ PCR‬تکرار شد و طبق شکل مشاهده شد که‬ ‫باندها به تدریج پررنگ تر و قوی تر شده، به طوری که در حجم 6 میکرو لیتر باند کامال مطلوبی به دست آمد.الزم به‬ ‫ذکر است که ‪PCR‬های نهایی طبق شرایط دمایی که در جدول زیر آمده است.‬ ‫66‬
  66. 66. ‫بحث و نتیجهگیری‬ ‫76‬
  67. 67. ‫برای بررسی مکانیسم اثر زهر عقرب ایرانی ‪ Odonthobuthus doriae‬تاکنون 3 سم پلی پپتیدی‬ ‫از زهر این عقرب جداسازی، شناسایی و اثرات فارماکولوژیک و الکتروفیزیولوژی آن بررسی شده‬ ‫است. در بررسی زهر این عقرب نیز مشخص شد که زهر این عقرب دارای اثرات پیش سیناپسی‬ ‫عصبی- عضال نی است که منجر به آزادسازی نروترانسمیترها مخصوصا ً استیل کولین در پایانه‬ ‫های عصبی است.‬ ‫اولین سم جداسازی شده از این عقرب 1‪ OD‬نامگذاری شد.مشخصات و خصوصیات این سم در بانک‬ ‫اطالعاتی ‪ Swiss prot‬با کد 4648‪ P‬ثبت شد.تالش و پیگیری و تالیفات متعدد از این عقرب منجر‬ ‫به نامگذاری اولین عقرب ایرانی شد‬ ‫‪‬‬ ‫سم 1‪ OD‬دارای 56 اسید آمینه است و جزو سموم شبه آلفا عقرب است. سموم شبه الفا دارای اثر‬ ‫مهاری بر پروسه غیر فعال سازی کانالهای سدیمی وابسته به ولتاژ (‪ )VGSCs‬هستند. این سم دارای‬ ‫اثر مهاری بر روی کانال قلبی پستانداران (5.1‪ )Nav‬و همچنین کانال سدیم حشرات (‪)para/tipE‬‬ ‫است .از خواص مهم 1‪ OD‬اثرات مشخص و مهاری آن بر روی کانال 7 سدیمی ( 7.1‪)Nav‬‬ ‫است. این کانال در پروسه درد و التهاب نقش مشخص دارد. بر همین اساس 1‪ OD‬جز معدود‬ ‫ترکیبات طبیعی موثر بر روی این کانال است و به همین دلیل نقش و اهمیت آن به عنوان یک پروب‬ ‫86‬
  68. 68. ‫‪ ‬تعداد ‪ 195bp‬الیگونوکلئوتد برای سنتز ‪ DNA‬کدکننده 1‪ OD‬استفاده شد.‬ ‫طراحی این الیگو نوکلئوتیدها براساس ترتیب اسید آمینه 1‪ OD‬انجام شد.این‬ ‫ترتیب نوکلئوتید با استفاده از برنامه ‪ Blast:homology search‬و نرم افزار‬ ‫‪ Blast-primer Design‬انجام شد.سکونس های نوکلئوتید بر اساس کدون‬ ‫ترجیحی برای بیان در وکتور ‪ E.coli‬انتخاب شدند.‬ ‫این پژوهش با هدف جداسازی و تکثیر ‪ cDNA‬مربوط به یک نروتوکسین از‬ ‫غدة زهر عقربهای متعلق به خانوادة بوتیده ،که از آزمایشگاه رفرانس عقرب‬ ‫مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی کرج تهیه شد صورت گرفت. بدین‬ ‫منظور ابتدا کل ‪ RNA‬با استفاده از کیت استخراج ‪ RNA‬از غده زهری‬ ‫عقرب ادونتوبوتوس دوریه استخراج شد و در ادامه ‪RNA‬ها به ‪ cDNA‬تبدیل‬ ‫شد و برای تکثیر ژن مربوطه در ‪ ، PCR‬به عنوان الگو مورد استفاده قرار‬ ‫گرفتند.‬ ‫96‬
  69. 69. ‫در این پژوهش، با توجه به اینکه قطعه ‪ cDNA‬تکثیر یافته، در محدودة مورد انتظار‬ ‫( ‪ )195bp‬قرارگرفته بود و از آنجا که این نتیجه با تکرار واکنش مجددا ً به خوبی قابل‬ ‫مشاهده بود، چنین به نظر میرسد که قطعه تکثیر یافته، همان ‪ cDNA‬کدکنندة نروتوکسین‬ ‫هدف در غدة زهر عقرب ادونتوبوتوس دوریه باشد. نتایج بدست آمده توسط دیگر محققین‬ ‫نیز میتواند گواهی بر این امر باشد. نیکخواه و همکارانش (6002) ژن کدکنندة یک‬ ‫نروتوکسین به نام 1‪ Bsaul‬را با استفاده از روش ‪ RT-PCR‬از عقرب هوتنتوتا سلسئی‬ ‫تکثیر کردند. قطعه ‪ cDNA‬تکثیر یافته توسط این محققین، ‪ 240bp‬طول داشت. قطعه‬ ‫‪ cDNA‬تکثیر یافته توسط وانگ و همکارانش (1002) نیز ‪ 200bp‬بود، که یک‬ ‫نروتوکسین ضد صرع جدا شده از سم عقرب بوتوس مارتنزی کارش به نام ‪BmK AEP‬‬ ‫را کد میکند. عالوه بر این موارد، با توجه به اینکه آلفاتوکسینهای جدا شده از زهر‬ ‫عقرب بوتوس مارتنزی کارش، پلیپپتیدهایی با 66-46 توالی اسیدآمینه هستند،‬ ‫‪cDNA‬های کدکنندة این نروتوکسینها در حدود ‪ 192-198bp‬طول دارند.‬ ‫07‬
  70. 70. ‫‪‬‬ ‫همچنین چهار بتاتوکسین جداشده از سم این عقرب، پلیپپتیدهایی با طول 27-96 توالی اسیدآمینه‬ ‫هستند که ‪cDNA‬هایی با طول حدود ‪ 207-216bp‬خواهند داشت. زیونگ و همکارانش نیز در‬ ‫سال 9991 توالی 462 جفت بازی ‪ cDNA‬یک نروتوکسین تحریکی اختصاصی حشرات را از‬ ‫همین عقرب شناسایی کردند.‬ ‫‪‬‬ ‫با توجه به اینکه ‪cDNA‬های مربوط به نروتوکسینهای شناسایی شده در این مطالعات همگی در‬ ‫محدودة 291تا 462 جفت باز بودهاند، صحت نتیجه حاصل از پژوهش حاضر، که تکثیر ‪cDNA‬‬ ‫یک نروتوکسین با طول پیشبینی شدة ‪ 195bp‬بود، دور از انتظار نبوده است.‬ ‫‪‬‬ ‫همچنین بنابر مطالعات مبس (2002) و گودت و همکاران (2002) آلفا توکسینها بیشتر در‬ ‫گونههای عقربهای ‪( Old world‬از قبیل آندروکتونوس) و بتا توکسینها بیشتر در گونههای‬ ‫عقربهای ‪( New world‬از قبیل سنتروروئیدس) یافت شدهاند و با توجه به اینکه قطعه تکثیر یافته‬ ‫در پژوهش حاضر از سم عقرب ادونتوبوتوس دوریه جداسازی شده است، امکان اینکه نروتوکسین‬ ‫کد شونده توسط این ‪ ،cDNA‬یک آلفاتوکسین باشد بیشتر است. با این وجود، تأیید قطعی اینکه آیا‬ ‫‪ cDNA‬تکثیر یافته همان ‪ cDNA‬مورد انتظار در این پژوهش بوده است یا خیر، تنها با تعیین‬ ‫توالی نوکلئوتیدی آن امکان پذیر خواهد بود و به دنبال آن نیز امکان تشخیص نوع نروتوکسین‬ ‫کدشونده توسط این ‪ cDNA‬میسر خواهد شد.‬ ‫17‬
  71. 71. ‫‪‬‬ ‫پیشنهادات‬ ‫‪ ‬با توجه به نتایج بدست امده از پژوهش حاضر،پیشنهاد می شود که:‬ ‫1. تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعه ‪ cDNA‬تکثیر یافته در این پژوهش و تعیین نوع نروتوکسین کدد شدونده توسدط‬ ‫آن.‬ ‫2. طراحددی و سدداخت آغازگرهددای اختصاصددیتر بدده منظددور تکثیددر ‪ cDNA‬مربددوط بدده نروتوکسددینهای موجددود در‬ ‫سایر گونههای عقربهای خانواده بوتیده.‬ ‫3. توصیه و ترغیب پژوهشگران به استفاده از تکنیدک ‪ RT-PCR‬بدر روی غددز زهدر سدایر عقربهدای خدانواده‬ ‫بوتیده و دیگر خانوادههای عقرب ها جهت شناسایی و تکثیر ژنهای کد کننده نروتوکسینهای موجود در غددز‬ ‫زهر آنها.‬ ‫‪ -4 ‬تهیه کتابخانه ژنی از غده زهر عقربهای خانواده بوتیده.‬ ‫5. با توجه به اینکه آنتدی سدرم ضدد زهدر عقربدی کده در حدال حاضدر در میسسد تحقیقدات واکسدن و سدرم سدازی‬ ‫رازی تولیددد میشددود، از مجمددوع زهرخددام بدسددت آمددده و بدده صددورت پلددیواالن میباشددد، در بیمدداران بددهطور‬ ‫اختصاصی عمل نمیکند و عوارض جانبی احتمالی نیز بههمراه دارد. با شناسایی ژنهای کدکنندز توکسدینهای‬ ‫موجددود در غددده زهددر عقددرب ، ایددن امکددان بدسددت میآیددد تددا در آینددده در راسددتای تولیددد پددروتئین نوترکیددب، بده‬ ‫منظور تولید آنتیسرم اختصاصی اقدام گردد.‬ ‫27‬
  72. 72. 73

×