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Generación células ES transmitocondriales                     Enucleación y fusión              Enucleation               ...
Generación de ratones transmitocondriales                 Inyección en blastocistos             Enucleation               ...
Análisis de células ES transmitocondriales        Identificación de clones EStransmitocondriales (T6589C) mediante RFLP   ...
Líneas ES transmitocondriales      Línea ES          Línea celular        Mutación    Complejo afectado transmitocondrial ...
OBJETIVOS PROYECTOEn este proyecto se proponen dos objetivos:A) analizar el efecto de las variantes no patológicas y las m...
B) efecto de las mutaciones en el mtDNA sobre la capacidad dediferenciación de líneas ES a cardiomiocitos. 1.- Transfecció...
A) efecto de las variantes no patológicas y las mutaciones en el mtDNA sobre   los patrones de expresión génica de células...
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Transcriptómica en células ES
Transcriptómica en células ES                    Redes generadas                    en base a                    interacci...
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Transcriptómica en células ES     ES-C3H              ES-C57
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Resultados TranscriptómicaA) líneas ES transmitocondriales (WT y mutantes) con ES control:   1.- Cambios en 200-600 genes ...
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Analysis PCA               MUT.        WT
Patricia Meade                                            Ana LatorreUnidad de Genómica CNIC:Sergio CallejasAna Dopazo
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Efecto de los fallos en el sistema OXPHOS sobre la expresión génica y la diferenciación de células ES. Patricio Fernández Silva

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Ponencia presentada en el marco de las I Jornadas Científicas del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (8-9 noviembre, 2010. Zaragoza)

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Efecto de los fallos en el sistema OXPHOS sobre la expresión génica y la diferenciación de células ES. Patricio Fernández Silva

  1. 1. I Jornadas Científicas IIS Aragón Efecto de los fallos en el sistema OXPHOS sobrela expresión génica y la diferenciación de células ES PIPAMER 09/05 Patricio Fernández Silva Grupo GENOXPHOS Dpto. Bioquímica y Biol. Molecular
  2. 2. GRUPO GENOXPHOS Sistema OXPHOS C. III C. II C. IVComplex I C. V
  3. 3. Mitocondria y patología
  4. 4. Modelos animales de enfermedades mitocondrialesEstudio in vivo de las causas moleculares,funcionales y estructurales.Ensayos de terapia.
  5. 5. 1 mtDNA 2 Modelos animales de enfermedades mitocondriales 3
  6. 6. Mutagénesis del mtDNAMutagéMutagénesis Manipulació Manipulación copias Mutágeno (TMP) BrEt 48 horas Disminución a una copia de mtDNA por célula UV Línea celular de ratón Subclonaje Análisis funcional en Aná (una célula por pocillo) microcultivo DUPLICADO Glucosa GalactosaCaracterizacióCaracterizaciónMutantes Se recogen los clones Gal deficientes
  7. 7. Colección de mutantes aislados COMPLEX GEN MUTATION PHENOTYPEComplex I ND4 Non-Sense Knock-out ND6 Frameshift Knock-out ND6/ND5 Frameshift/NonSense Knock-out ND6/ND1 Frameshift/Missense Knock-out/? ND6 Frameshift Knock-outComplex III Cyt b Missense Folding problemComplex IV CO I Missense Less activity CO I Missense Supressor CO I Missense Less activityComplex V A6 Missense Less activityProt. Synthesis tRNAIle Anticodon loop OXPHOS def
  8. 8. Generación células ES transmitocondriales Enucleación y fusión Enucleation CytoplastsFibroblasts Fusion with R6GmtDNA mutation treated ES cellsCytochalasin Btreatment and centrifugation
  9. 9. Generación de ratones transmitocondriales Inyección en blastocistos Enucleation Fusion withFibroblasts CytoplastsmtDNA mutation R6G treated ES cells Injection intoReimplantation of C57BL/6Jembryos in blastocystpseudopregnantC57BL/6J females
  10. 10. Análisis de células ES transmitocondriales Identificación de clones EStransmitocondriales (T6589C) mediante RFLP Hha I Transmitochondrial ES Un C MT
  11. 11. Líneas ES transmitocondriales Línea ES Línea celular Mutación Complejo afectado transmitocondrial original (C57BL6 XX)ES-C57 C57BL6 WT --ES-Balb/c Balb/c WT --ES-NIH3T3 NIH3T3 WT --ES-C3H C3H WT --ES-NZB NZB WT --ES-MB77 MB77 tRNA-Ile Complejo I, III y IVES-FC2C12 FC2C12 CO I (C6347T) C IVES-E9C E9C CO I (A6589T) C IVES-FHBc FHBc A6 (A8414G) CV
  12. 12. OBJETIVOS PROYECTOEn este proyecto se proponen dos objetivos:A) analizar el efecto de las variantes no patológicas y las mutacionesen el mtDNA sobre los patrones de expresión génica de células ESB) analizar el efecto de las mutaciones en el mtDNA sobre lacapacidad de diferenciación de líneas ES a cardiomiocitos.
  13. 13. B) efecto de las mutaciones en el mtDNA sobre la capacidad dediferenciación de líneas ES a cardiomiocitos. 1.- Transfección de células ES control 2.- Cuerpo embrioide (EB) con GFP bajo promotor α-MHC (técnica de gota pendiente) 3.- Tras 5-7 días en cultivo hay células contráctiles que expresan GFP
  14. 14. A) efecto de las variantes no patológicas y las mutaciones en el mtDNA sobre los patrones de expresión génica de células ES 1 2 Extracción de RNA de las líneas 3 Expresión génica con microarrays de DNA (CNIC)
  15. 15. Transcriptómica en células ESMicroarrays de DNA 41,041 (60-mer) probes: representing all empirical and predicted mouse genes and transcripts from the NIA Mouse Gene Index. RefSeq, Ensembl, RIKEN, GenBank, and UniGene.
  16. 16. Transcriptómica en células ES
  17. 17. Transcriptómica en células ES Redes generadas en base a interacciones entre genes descritas en la bibliografía
  18. 18. Transcriptómica en células ESRutas/Funciones estadísticamente afectadas
  19. 19. Transcriptómica en células ES ES-C3H ES-C57
  20. 20. Transcriptómica en células ES
  21. 21. Resultados TranscriptómicaComparaciones:A) líneas ES transmitocondriales (WT y mutantes) con ES controlB) líneas ES transmitocondriales WT entre sí y con ES controlC) líneas ES transmitocondriales mutantes con ES control
  22. 22. Resultados TranscriptómicaA) líneas ES transmitocondriales (WT y mutantes) con ES control: 1.- Cambios en 200-600 genes (solo 18 comunes a WT y Mut.) 2.- No parecen estar afectados por la transferencia los genes implicados en pluripotencialidad. ES transmit. WT ES transmit. Mut. ES control NIH3T3 Mb 77 NZB/B1NJ FC2C12 ES.C57BL6 XX C3H E9C Balb/c FHBc C57BL6
  23. 23. Resultados TranscriptómicaB) líneas ES transmitocondriales WT entre sí y con ES controlC) líneas ES transmitocondriales mutantes con ES control 1.- No hay cambios significativos en funciones o rutas 2.- Los mayores cambios en genes asociados a señalización celular, sistema inmune e inflamación (WT y Mut.) 3.- No hay cambios en metabolismo azúcares o lípidos (Mut.). ES transmit. WT ES transmit. Mut. ES control NIH3T3 Mb 77 NZB/B1NJ FC2C12 ES.C57BL6 XX C3H E9C Balb/c FHBc C57BL6
  24. 24. Analysis PCA MUT. WT
  25. 25. Patricia Meade Ana LatorreUnidad de Genómica CNIC:Sergio CallejasAna Dopazo

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