98032226 de-cuong-lactase-sua-lan-4-dot-1

5,421 views

Published on

0 Comments
2 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
5,421
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
127
Comments
0
Likes
2
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

98032226 de-cuong-lactase-sua-lan-4-dot-1

  1. 1. Chương 1 MỞ ĐẦU Xu hướng của con người ngày nay là quay về sử dụng các sản phẩm mang tính thiên nhiên,khai thác những kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật hiện đại và hạn chế tối đa việc đưahoá chất vào cơ thể. Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm có bổ sung các chủng vi sinh vật giúp conngười tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá và giúp chống lại rất nhiều bệnh tật phát sinhtừ bên trong cơ thể. Tuy nhiên các sản phẩm thực phẩm này không phải là thuốc, mà được xếp vàonhóm thực phẩm chức năng. Chính vì những lợi ích trên và theo quan điểm phòng bệnh hơn chữabệnh, ở các nước phát triển có xu hướng sử dụng các loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiềuhơn là sử dụng thuốc điều trị. Sữa là thực phẩm chính của trẻ em và người già, do thói quen không sử dụng sữa nênenzyme lactase bị mất dần, dẫn đến bệnh không dung nạp lactose. Sự thiếu hụt lactase phổ biếnrộng rãi trên toàn thế giới. Trong cơ thể người, lactase hoạt động khoảng năm năm. Ở Bắc ChâuÂu và những người sống ở phía Tây Bắc của tiểu lục địa Ấn Độ, lactase có xu hướng bảo tồn ởngười lớn, là do việc sử dụng các sản phẩm từ sữa như pho mát trong suốt mùa đông khi nguồncung cấp lương thực có thể bị hạn chế. Chúng ta có thể kết luận rằng việc thiếu hụt lactase (đượcgọi là không dung nạp lactose hoặc alactasia) không phải là một bệnh, nhưng sự tồn lưu của lactasevào tuổi trưởng thành là sự thích ứng sinh học với việc sử dụng các sản phẩm từ sữa. Lactase là một enzyme được tìm thấy ở mép của ruột non. Nó phân hủy lactose thành đườngglucose và galactose. Tần số thiếu hụt lactase trên toàn thế giới khác nhau. Mức độ lactase trongruột và các triệu chứng không có sự hòa hợp. Hình ảnh điển hình là khó chịu ngay sau khi dùngsữa hoặc các sản phẩm từ sữa. Điều này có thể thấy từ việc bị đau bụng, buồn nôn, cảm giác đầyhơi ngắn, nhanh, chảy nước mắt và tiêu chảy[56]. 1
  2. 2. Khi bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúng gây nên sự tổn thương niêmmạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả là đường lactose khôngtiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy[56]. Ngoài ra, trình trạng kém hấp thu lactose do bệnh đường tiêu hóa tại một số quốc gia là kháchính xác, có thể gây kém hấp thu lactose - hội chứng ruột ngắn, kém hấp thu đường galactose bẩmsinh. Trong thực tế, trạng thái bất thường hoặc sai lệch là việc duy trì hoạt động lactase trong suốtgiai đoạn trưởng thành. Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến sự bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứ phát, (C)bẩm sinh[57].(A) Nguyên phát: Đây là nguyên nhân thường gặp nhất của bất dung nạp lactose do thiếu lactasetương đối, xuất hiện ở trẻ em vào những độ tuổi khác nhau trong những nhóm chủng tộc khác nhau.(B) Thứ phát: Do tổn thương ruột non sau viêm dạ dày ruột do siêu vi (Rotavirus), trẻ bị bất dungnạp lactose thoáng qua, có thể hồi phục sau khi vấn đề bệnh viêm dạ dày ruột đã được giải quyếthoặc trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tổn thương, men lactase không sản sinh đủ nêncơ thể trẻ không thể hấp thu được lactose dẫn đến triệu chứng bất dung nạp. Khi ấy sẽ khiến chotình trạng tiêu chảy kéo dài và trầm trọng hơn là trẻ bị suy dinh dưỡng, và khi trẻ bi suy dinh dưỡngthì lượng men lactase càng giảm, vì vậy suy dinh dưỡng và tiêu chảy là vòng luẩn quẩn khó giảiquyết.(C) Bẩm sinh: Nguyên nhân này rất hiếm gặp, biểu hiện ngay sau sinh do rối loạn nhiễm sắc thể,gây ngăn cản sản xuất men lactase. Trong hệ tiêu hóa của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có hơn400 loài vi sinh vật khác nhau (Melissa peterson et al., 2002), chúng được xếp vào 2 loại: vi sinhvật gây bệnh và vi sinh vật có ích. Các loài vi sinh vật sống chung với nhau tạo thành hệ sinh tháiổn định, cân bằng và là hàng rào bảo vệ, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh đường ruộtcũng như duy trì một số hoạt động chuyển hóa của cơ thể. Vi sinh vật có ích càng nhiều thì cơ thểcàng khỏe mạnh. 2
  3. 3. Để tăng dung nạp lactose trong sữa, lý tưởng nhất là tăng sinh tổng hợp được enzyme nàyngay trong cơ thể người. Tuy nhiên con đường này rất khó khăn. Enzyme từ nguồn vi sinh vật vẫnlà nhu cầu trước mắt. Do đó lựa chọn nguồn enzyme vi sinh là hiệu quả hơn tuy nhiên phải chọnloại enzyme có hoạt động pH tối ưu tương tự như sữa để tránh hiện tượng đông tụ sữa. Hiện nay lactase được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm lactase thương mại hiện nay chủyếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyverromyces lactics, Kluyverromycesmarxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candidapseudotropicalis. Ngoài ra lactase còn được sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu là Gram dương, thuộcgiống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus và vi khuẩn Gram âm là E.coli ), nấm sợi(Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp)… Đề tài : “Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase và ứng dụng” - Phận lập, thu thập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn. - Định danh các chủng vi khuẩn đến cấp giống và hướng đến định danh cấp loài. - Kiểm tra hoạt tính enzyme lactase của những chủng vi sinh vật phân lập được. - Bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase. Chương 2 TỔNG QUAN 3
  4. 4. 2.1. Enzyme lactase2.1.1. Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl –(1Æ 4)-α-D-glucopyranose) là đường đôi có ở động vật cóvú, ngoại trừ một vài loài, nồng độ trong khoảng 2 – 10%. Hàm lượng lactose trung bình ở sữa bòkhoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008). Trong quá trình sản xuất phomai, phần lớnlactose trong sữa có trong dịch whey. Khác với trước đây, whey không được xem như phụ phẩm.Ngày nay, whey được sử dụng hiệu quả hơn. Whey có thể được sấy khô để sản xuất các loại bộtwhey khác nhau hoặc phân đoạn bằng kỹ thuật lọc màng để sản xuất sản phẩm whey protein vàphần đi qua màng giàu lactose (theo Fox 2009; Lifran, 2009). Lactose là một loại đường có nhiều trong sữa. Để cơ thể hấp thu được thì đường lactose cầnphải được phân tách thành đường glucose và galactose trước. Quá trình này xảy ra ở phần trên củaruột non bởi men lactase. Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật ra là trong cơ thể chúng ta thiếumen lactase để chuyển lactose thành ra hai loại đường như đã trình bày trên. Nếu thiếu men lactaseở ruột non thì đường lactose không được phân tách và sẽ không được hấp thu vào máu mà bị tồnđọng ở ruột, dẫn đến những rối loạn tiêu hóa, gọi là bất dung nạp đường lactose. Đây là nguyênnhân làm cho ta không uống được sữa. Nhiều người nhầm lẫn giữa bất dung nạp đường lactose vàdị ứng sữa. Bản chất của dị ứng sữa là do hệ miễn dịch của cơ thể phản ứng với protein có trongsữa dẫn đến những rối loạn. Lactase được mã hóa bởi một locus gen trên nhiễm sắc thể số 2, thể hiện độc quyền trong ruộtđộng vật có vú nhỏ, và ở mức độ rất thấp trong ruột kết của quá trình phát triển thai nhi. Con ngườiđược sinh ra với mức lactase cao. Sau khi cai sữa gen sinh tổng hợp lactase ở trạng thái bất hoạt vìvậy lactase trong ruột non giảm. Việc giảm lactase đồng nghĩa với việc gây ra các triệu chứng phổbiến như không dung nạp hypolactasia hoặc không dung nạp lactose. Bất dung nạp đường lactose không liên quan đến hệ miễn dịch, chỉ vì cơ thể chúng ta thiếulactase để tiêu hóa lactose vì thế lactose sẽ bị tống ra ngoài với dạng tiêu chảy. Ở người, vấn đềkhó khăn trong tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, ở độ tuổi thanh thiếu niên chiếm khoảng 70% số 4
  5. 5. thanh thiếu niên của thế giới (Paige 2005). Enzym thương mại có xu hướng phát triển mạnh, β-galactosidase cho phép sản xuất sản phẩm chứa hàm lượng lactose thấp (Gekas và Lopez-Leiva1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amach 1999; Rehman 2009). Khi đó, lactose ít hòa tan và ítngọt, sự thủy phân lactose làm giảm các tinh thể lactose ở sản phẩm giàu lactose trong quá trìnhbảo quản và làm tăng độ ngọt (Gekas và Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amachi1999; Rehman 2009).2.1.2. Lactase và chức năng Enzyme thủy phân lactose có tên lactase thuộc nhóm β-galactosidase (E.C.3.2.1.23) viết tắt làLCT. Enzyme này có hoạt tính chủ yếu là thủy phân liên kết β1-4 glucosidic của phân tử đường đôilactose để tạo thành 2 phân tử đường đơn có độ ngọt cao hơn đường lactose. Do vậy, enzymelactase chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp các sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose,một thành phần cacbonhydrat chính trong sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả năng dungnạp rất kém và đặc biệt một số ít người lớn kể cả trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose.Hơn nữa, phân tử lactose dễ dàng bị kết tinh dạng hạt cát ở nhiệt độ lạnh nên gây khó khăn cho sảnxuất một số sản phẩm sữa lạnh như kem, vì vậy người ta sử dụng enzyme này để giảm hàm lượnglactose đồng thời tăng độ ngọt của sản phẩm nhờ các đường đơn tạo thành. Enzyme lactase trong một số trường hợp còn có hoạt tính transgalactosyl hóa, trước tiênenzyme phá vỡ liên kết β1-4 glucosidic tạo thành galactosyl và sau đó chuyển cho phân tử một hợpchất chứa nhóm hydroxyl. Do vậy người ta đã sử dụng hoạt tính này để tổng hợpgalactooligosaccharide, có hoạt tính dược học. Lactase có thể được tìm thấy ở nhu động ruột non người và động vật, trong một số thực vật(dưa hấu, trái mơ…) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm sợi). Tùy theo nguồn gốc lactase sẽcó kích thước phân tử khác nhau, các chuỗi peptide (tiểu phần theo cấu trúc bậc 4) dài ngắn và sốlượng cũng rất khác nhau. Mặc dù vậy nhưng chuỗi peptide chính mang hoạt tính lactase thôngthường có trọng lượng phân tử khoảng 120kDa và chứa tâm xúc tác và tâm này có cấu trúc tương 5
  6. 6. tự giữa các loài (được bảo tồn qua tiến hóa) và trong đó là vai trò không thể thay thế của các “tay”Glu trong phản ứng xúc tác axit – base hoặc tấn công vào nhân.. Hình 1. Enzyme lactase ở ruột non người[52] Hoạt tính phân hủy lactose được xác định bằng 2 cách, hoặc là thông qua sự mất đi của cơchất là lactose hoặc là thông qua sự tạo thành của sản phẩm đặc trưng cho phá vỡ liên kết 6
  7. 7. glycosidic, thông thường dùng cơ chất đặc hiệu ONPG (o-nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác địnhlượng ONP (o-nitrophenyl) tạo thành. Các lactase khác nhau có dải hoạt động pH từ axit yếu đến trung tính từ khoảng 4.0 – 6.5 tùythuộc vào nguồn gốc. Lactase của nấm sợi có pH hoạt động axit hơn, còn lactase của các vi khuẩnvà nấm men ưa pH gần trung tính hơn.Bảng 1. Một số đặc trưng của chuỗi peptide đóng vai trò xúc tác trong enzyme lactase ở một sốloài vi sinh điển hình Nguồn gốc enzyme K.lactic E.coli E.coli A.niger Trọng lượng phân tử 117618 116351 118016 119160 Chiều dài 1025 1023 1031 1006 Nguyên tử proton Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/bazơ Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-45 0C (ưa nhiệt độ trung bình), một sốkhác từ 45-650 C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở nhiệt độ lạnh 4 0C. Dướiđây là tổng hợp một số đặc tính của lactase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau (Bảng 2). Đặc biệtmột số enzyme đòi hỏi ion kim loại để hoạt hóa. Người và động vật có khả năng dung nạp lactose là do trong thời kỳ trẻ mới sinh, ruột non cókhả năng tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose trong sữa mẹ, thành phần chính cho trẻ sinh trưởng.Đến tuổi trưởng thành các gen này hầu như ngưng hoạt động do vậy cơ thể tiêu hóa lactose rấtkém. Điều này cũng đúng cho động vật. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự dung nạp latose có thể được hỗtrợ bởi hệ vi sinh niêm mạc ruột non, trong đó có vai trò của các vi sinh vật lên men lactose nhưLactococcus và Bifidobacterium. Đây chính là cơ sở của việc đưa các vi sinh vật này vào một sốdòng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa. 7
  8. 8. Bảng 2. Một số đặc trưng của enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình Trọng Giá trị pH Giá trị nhiệt Hoạt hóa ion. Chú Chú Nguồn lượng tối ưu độ tối ưu thích khác phân tử A.niger 3,0-4,0 55-60 124 A.oryzae 5,0 50-55 90 Mn+2 , K+ K.fragilus 6,9-7,3 37 201 Mn+2 , Na+ K.lactic 7,2 35 135 K+ , Na+ E.coli 6,2-7,1 40 540 L.thermophilus 3,4-4,3 55-57 530 C.inaegualis 6,0 30-55 Hoạt động cao B.circulans 6,8 60-65 ở sữa không béo Bacillus sp 6,5-7,5 65 L.bulgaricus 42-45 S.thermophilus 55 500-6002.1.3. Cơ chế, cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp Lactase có thể thủy phân một loạt các chất nền. Trong đó đáng chú ý nhất là lớp enzyme β –galactosidase, lactase cũng có glucosidase và glycosylceramidase hoat động. Trong quá trình traođổi chất, β -glycosidic trong D-lactose thủy phân để tạo thành D-galactose, D-glucose, có thể đượchấp thu qua thành ruột vào máu.Phản ứng xúc tác lactase tổng thể là :C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6H 12 O 6 + Q 8
  9. 9. Lactase cũng xúc tác chuyển đổi phlorizin phloretin và glucose. Cơ chế xúc tác thuỷ phânlactose D – giữ lại cấu hình chất nền anomeric trong các sản phẩm. Trong khi các chi tiết của cơchế là không chắc chắn, để đạt được phải thông qua một phản ứng chuyển đổi. Các nghiên cứu vềlactase của E.coli đã đề xuất rằng: quá trình thủy phân được bắt đầu khi một tác nhân nucleophinglutamate tấn công enzyme từ phía bên trục carbon galactosyl của β-glycosidic. Vì Mg phụ thuộcvào axit xúc tác nên việc loại bỏ các nhóm rời D-glucose có thể được thuận lợi, enzyme được giảiphóng từ phân nửa α-galactosyl khi tấn công nucleophin sẽ sản xuất D-galactose. Hình 2. Cơ chế thủy phân lactose [53] Các nghiên cứu về chất nền đã chứng minh rằng 3’-OH và 2’-OH trên vòng galactopyranoselà rất cần thiết để thủy phân enzyme. Nhóm 3- hydroxy được tham gia ngay từ ban đầu trong khinhóm 2’ là không cần thiết, nhưng cần thiết trong các bước tiếp theo. Điều này được chứng minhbởi thực tế rằng 2-deoxy là một chất ức chế cạnh tranh hiệu quả (K i= 10mM). Loại bỏ các nhómhydroxyl trên phân nửa glucopyranose không hoàn toàn loại bỏ chất xúc tác. Pre-pro-lactase có một cấu trúc polypeptide chính duy nhất bao gồm 1927 axit amin chiathành 5 nhánh: (1) 19 amino axit chia tín hiệu theo thứ tự, (2) chuỗi miền lớn không hiện diệntrong lactase ở giai đoạn trưởng thành, (3) các phân khúc lactase ở giai đoạn trưởng thành, (4) một 9
  10. 10. mảng trải dài kị nước, (5) một đoạn ngắn ưa nước ở cacboxyl cuối. Chuỗi tín hiệu được phân táchtrong lưới nội chất, pro-LHP đạt chiều dài 215kDa được chuyển sang bộ máy Golgi, nơi có nhiềuglycoxyl hóa và protein thủy phân. Các prodomain đã được hiển thị để hoạt động như mộtchaperone intramolecular trong ER, ngăn ngừa sự phân tách trypsin và cho phép LPH áp dụng cáccấu trúc 3-D cần thiết để vận chuyển đến bộ máy Golgi. Hình 3. Quá trình sản sinh lactase ở người [53]2.1.4. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase được sinh tổng hợp bởi một số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromycesmarxianus, Torulautilis sp, Torulopsis spherica, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis).Ngoài ra, còn có các vi khuẩn Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus,nhóm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917. Bên cạnh đó thìnấm sợi cũng được quan tâm nhiều (Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp) nhưng loàiAspergillus sp được nghiên cứu nhiều hơn cả. Tuy nhiên quá trình tổng hợp lactase ở cả quy mônghiên cứu và quy mô sản xuất chủ yếu là từ nấm men Kluyveromyces và vi khuẩn lactic. Cácenzyme lactase được sinh tổng hợp bao gồm cả ngoại bào và nội bào, loại chịu nhiệt và không chịunhiệt, đặc biệt loại lactase chịu lạnh để ứng dụng trong làm kem. Sử dụng lactase (cố định hoặc tựdo) chủ yếu để sản xuất sữa tươi và sữa bột không chứa (hoặc chứa rất ít) lactose hoặc sinh tổnghợp các hợp chất galacto-ooligosaccharides. 10
  11. 11. Bảng 3. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Nấm men Vi khuẩn Nấm sợi Kluyverromyces lactic Lactobacillus acidophilus Aspergillus sp Kluyveromyces maxianu Lactobacillus sp Aspergillus niger Kluyveromyces sp Lactococcus lactic Aspergillus oryzea Torulopsis spherical Bacillus subtilis Aspergillus candidus Torulopsis pseudotropicalis Bacillus curculans Fusarium sp Torulautilis sp Streptococcus salivarius Fusarium moniliforme Saccharomyces fragilis Streptococcus thermophilus Trichoderma sp Candida pseudotropicalis E.coli Trichoderma reesei Rut-C30 Zygosaccharomyces lactic Những tế bào niêm mạc ở phần trên của ruột non (là những tế bào sản xuất ra men lactase) bịtổn thương. Hiện tượng này hay gặp ở trẻ em và thường xảy ra sau khi bị tiêu chảy, viêm dạ dàyruột hoặc có thể do hóa trị liệu. Khi trẻ bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúnggây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả làđường lactose không tiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy và bệnhngày càng trầm trọng hơn. Thống kê cho thấy 50% -70% trẻ tiêu chảy nặng nhập viện có biểu hiệnbất dung nạp lactose. Lactose là đường chủ yếu có trong sữa mẹ và các sữa công thức. Lactose lànguồn cung cấp đường glucose cho sự hoạt động của não và cơ thể, làm phân mềm, tạo sự vượttrội của các Bifidus và Lactobacillus là những vi khuẩn có lợi giúp cho sự phát triển hệ miễn dịchvà tiêu hoá trong cơ thể trẻ. Men lactase ở màng ruột là men tiêu hoá biến đường lactose trở thànhđường glucose. Khi trẻ bị tiêu chảy cấp, màng ruột bị tổn thương bởi vi khuẩn,virút hoặc độc tốcủa chúng làm thiếu men lactase. Do thiếu men lactasa làm đường lactose không tiêu hoá đượctrong ruột gây bất dung nạp lactose. Đường lactose không được tiêu hoá sẽ ứ đọng lại trong ruột, 11
  12. 12. hút nước làm tiêu chảy tăng thêm và kéo dài. Trường hợp này gọi là thiếu lactase thứ phát khác vớithiếu men lactase tiên phát thường xuất hiện ngay sau khi trẻ sinh và rất hiếm gặp (chỉ 1 trong số1000 trẻ). Bất dung nạp lactose thứ phát thường kéo dài trong 1-2 tuần nhất là ở trẻ tiêu chảy kéodài. Hậu quả là trẻ bị suy dinh dưỡng nặng, kém ăn cộng thêm tập quán kiêng ăn làm chậm hồiphục niêm mạc ruột. Bất dung nạp lactose có thể gặp trong những trường hợp tiêu chảy do nhiễmvi khuẩn, virút, đặc biệt tiêu chảy do Rota virút, dị ứng sữa bò… là những bệnh lý rất thường xảyra ở trẻ nhỏ dưới 3 tuổi[56].2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB)2.2.1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất về hìnhthái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hayque (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấytrong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, axit lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếucủa sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùngtrong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủngLAB có thể sinh bacteriocin ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, axit lacticvà các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được côngnhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), do được sử dụng thường xuyêntrong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họLactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, trong đó các giống sauđây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella.Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loạicủa Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp 12
  13. 13. với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhómActinomycetaceae, một nhóm vi khuẩn Gram dương và có con đường lên men đường khác với vikhuẩn lactic. Hình 4. Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic [26]Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần nhau - Trong đó nhóm được đóng khung được xem là nhóm vi khuẩn an toàn Việc phân loại vi khuẩn axit lactic chỉ khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độvà con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất axit lactic,khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được axit hoặc kiềm. Phân loại theo con đườnghóa học như thành phần axit béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinhhọc di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại.2.2.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính và là vikhuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và 13
  14. 14. không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vikhuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, peptonvà axit. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính củacác dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi cóchiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻhoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axit lactic trong môi trường,và sức chịu axit (hay độ bền axit) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạothành axit lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thểphát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên mentốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5÷6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25÷350C, ưa nhiệt là 40÷450C vàưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưngchủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…). Mặc dù cơ chế vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên LAB được cho là có một số hiệu ứng cólợi cho chức năng miễn dịch. LAB có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng các phương tiệncủa sự ức chế cạnh tranh, đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đápứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003) tăng số lượng tế bào plasma sản xuấtIgA – kháng thể chính trong chất nhầy cơ thể, hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ Tlympho (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặcdù chưa có cơ chế cụ thể) (OToole và Cooney, 2008). Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn trên những tếbào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bàotạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lạinhững ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong. Khi ATP 14
  15. 15. được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màngtế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết. Trong đóbacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác.Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó.Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủynhanh bởi enzym protease, lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thànhcác kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giảiADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin của vi khuẩnlactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng.Bacteriocin class I (đại diện: nisin của Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyểncác tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặcdo bám được vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào;bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năngxuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) –protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích (Riley và Chavan, 2007), (Cotter etal., 2005). Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những phần khác nhau của hệ tiêuhóa thì tồn tại các vi khuẩn khác nhau. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạmthời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khibắt đầu tiêu thụ thực phẩm có VSV chứa lactase, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giốngvi khuẩn. Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh: Nguyên nhân là do kháng sinh làm mất cân bằng hệ visinh đường ruột và khi đó Clotridium difficle và Klebsiela oxytoca tăng lên nhanh chóng và giảiphóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy dokháng sinh, kết quả cho thấy chủng S. bolardii, S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG,Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc 15
  16. 16. bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thìmang lại hiệu quả (DSouza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả củaphòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung LAB, được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, vàgiảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em vàtiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). Những lợi ích của chủng LAB là ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặpkhi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái"tắt" trong khi LAB lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứngvới lây nhiễm mới.2.2.3. Đặc điểm hình thái một số chủng LABTùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que.Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.2.2.3.1. Giống LactobacillusPhân loại khoa học:Bảng 4. Phân loại khoa học giống Lactobacillus Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus 16
  17. 17. Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như : L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L.fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus … Hình 5. Lactobacillus sp[51]Đ điểm ( ặc : Beijerinck, 1901) Tế bào có dạng hình que thường dài và thon, không di động, Gram dương, hiếm khi tạo sắc tố(màu gỉ sắt và màu đỏ gạch). glucose, các aldehydic hexoses tương tự, cacrbohydrates là đườngđơn và các rượu đa chức được chuyển hóa bằng con đường lên men lactic đồng hình và cả dị hìnhtạo ra axit lactic, axit acetic, rượu và CO2. Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L. plantarum khi ở điều kiện nhất định. Mộtsố loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Kỵ khíkhông bắt buộc, không tạo ra catalase, không hóa lỏng gelatin, không phân hủy casein nhưng vàichủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan. Không tạo indole và H2S. Tế bào còn non cho kếtquả Gram dương và trở thành Gram âm khi đã già. Không có khả năng di động. 17
  18. 18. Được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sảnphẩm sữa.Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men đồng hình: Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L.plantarum, L. casei…Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình: Lactobacillus brevis, L.pentoaceticus, L. lycopersici, L. fermenti…2.2.3.2. Giống StreptococcusPhân loại khoa học:Bảng 5. Phân loại khoa học Giống Streptococcus (Rosenbach, 1884) Giới : Vi khuẩn Nghành: Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Streptococcaceae Giống : StreptococcusGồm các loài: S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. equi, S. iniae, S. mitis, S. mutans, S.oralis, S. parasanguinis, S. peroris, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S.salivarius ssp. thermophilus, S. sanguinis… 18
  19. 19. Hình 6. Streptococcus [51]Đặc điểm: Có dạng hình tròn hoặc hình trứng (ovan), ít khi kéo dài thành dạng que. Sau khi phân chiatheo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi khuẩn không nhabào, Gram dương, không di đông, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài có thểnhận thấy trong điều kiện nhất định, đường kính tế bào 0.5-1µm. Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên mặt nước hoặclà dạng mịn gây đục môi trường. Trên môi trường agar, khuẩn lạc thường nhỏ hơn 1mm, trongcùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi. Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kểethanol, axit acetic, axit formic…khi lên men glucose trong môi trường có tính kiềm (Gunsalus vàNiven, 1942). Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không sống được trongmôi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có trong nhóm enterococcus. Tấtcả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầuvề vitamin B và các amino axit trong khi số khác có nhu cầu về các axit béo không no và gia tănglượng CO2. Vì vậy nhu cầu về dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài. (Dubos,1948). Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus được đề nghị bởi (Sherman, 1937). Theo đó, chúngđược chia ra thành 4 nhóm: nhóm sinh mủ (pyogenic), viridans, Enterococcus và nhóm lactic. Sựphân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với mỗi nhóm, đặc biệt là khoảngnhiệt độ phát triển. Tuy nhiên với các loài mới được công nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trởnên ít khác biệt nhau vì chúng cùng lúc mang nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm. Ví dụ:Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc điểm mà ta 19
  20. 20. có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus. Trong khi Streptococcus acidominimus Ayers và Mudgecũng thuộc nhóm viridans nhưng cũng có thể xem như thuộc nhóm pyogenic.Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus cremoris,Streptococcus lactis, Streptococcus thermophillus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus…Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình: Streptobacterium brassicaefermentati…2.2.3.3. Giống LeuconostocPhân loại khoa học:Bảng 6. Phân loại khoa học giống Leuconostoc(Van Tieghem, 1878) emend. (Hucker và Pederson, 1930). Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Leuconostocaceae Giống : Leuconostoc Gồm các loài như: L. carnosum, L. citreum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis… 20
  21. 21. Hình 7. Leuconostoc [49]Đặc điểm: ( Van Tieghem, 1878), (Orla-Jensen, 1919), (Hucker và Pederson, 1930). Leuconostoc có tế bào thường có dạng hình cầu hay oval đơn lẻ, cặp đôi hay dạng chuỗi ngắn.Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính axit, tế bào có thể kéo dài thànhdạng nhọn hay dạng que. Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứasucrose. Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung caonấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ. Leuconostoc là một loài ky khí không bắt buộc. Khi lên men tạo ra một lượng hạn chế axitlactic. L-lactic axit luôn được tạo ra và đôi khi cũng xuất hiện D-lactic axit. Axit acetic và rượucũng được tạo thành và khoảng ¼ lượng glucose lên men được chuyển thành CO2.Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm thấy trong lên men sữa vàrau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides (Cienkowski) Van Tieghem.2.2.3.4. Giống PediococusPhân loại khoa học:Bảng 7. Phân loại khoa học giống Pediococcus (Claussen, 1903) Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Pediococcus Gồm các loài như: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, P. damnosus, P.ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii.Đặc điểm: ( Balcke, 1884) 21
  22. 22. Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẽ hoặc thậm chíchuỗi ngắn, Gram dương, không di động, catalase âm. Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25-32oC, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thểphát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Quá trình trao đổi chất chủ yếu là quá trình lên men đồng hình, không có khả năng chuyểnhóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém vì vậy chúng có nhu cầu rất cao về thànhphần dinh dưỡng từ môi trường. Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae Balcke. Hình 8. Pediococcus sp [50]2.2.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa2.2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ cónhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnhmà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ… a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza,fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột,dextrin). 22
  23. 23. Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làmcơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ. b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảocho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủyphân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và cóhiệu quả nhất. tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. c. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiếtcho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợpvitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sửdụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men… d. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự pháttriển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axitxitric, axit oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic làm thànhphần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai axit hữu cơ trên, axit axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinhtrưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng axit axetic dưới dạng các muối axetat để làm chấtđệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. e. Nhu cầu các muối vô cơ khác 23
  24. 24. Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ.Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặcbiệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. f. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trongmôi trường không có oxy. + Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵkhí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO 2 và H2O và tổnghợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP. + Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bịphân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.2.2.4.2. Quá trình trao đổi chất Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên mencarbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩmcuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả năng lên men các loạiđường hexcose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…);pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loạiđường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làmthay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: lênmen lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.(Owen R. Fennema et al. 2004). a. Lên men lactic đồng hình 24
  25. 25. Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận chuyển đường tự do(transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi glucokinase (cần 1 ATP). Một số loàisử dụng phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system (PTS), mỗi phosphoenolpyruvatelà một phần tử cho phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một liên kết phosphate có năng lượngcao để hoạt hóa phân tử đường. Con đường glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) đượcsử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci vàWeissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thànhdihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất cómức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạnchế oxy, pyruvate bị khử thành axit lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đóNADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng đượctạo ra chủ yếu là axit lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. b. Lên men lactic dị hình Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, conđường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate và được gọi chung là 6-phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK). Đặcđiểm của con đường này là sự khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đó làsự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate(GAP) và acetyl phosphate.GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kếtquả là tạo ra axit lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphatesẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này tạo ra một lượngđáng kể các sản phẩm khác như CO2, ethanol... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngượclại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên cần chú ý nhận xét trên khôngphải dúng cho tất cả các trường hợp. 25
  26. 26. (Owen R. Fennema et al. 2004). 26
  27. 27. Hình 9. Con đường lên men glucose 27
  28. 28. (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) Các enzyme tham gia vào quá trình: 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6.Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phosphoketolase;9. Acetaldehyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogenase.2.2.5. Sản phẩm quá trình lên men và khả năng sinh các chất kháng khuẩn ở vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một số lượng lớn các enzyme ngoại bào kíchthước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lacticdehydrogenase. Khi sử dụng chúng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, phân giải protein và lipid, giúpgiảm cholesterol, cải thiện khả năng dung nạp lactose… LAB đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, axit folic, biotin(vitamin H), vitamin K. Vi khuẩn sinh axit lactic tạo ra một số các sản phẩm biến dưỡng có khả năng ức chế sựphát triển của các vi sinh vật gây bệnh như: H2O2, CO2, diacetyl và các bacteriocin…(Bảng 8). Vi khuẩn lactic được xem là có khả năng ức chế và cạnh tranh các vi khuẩn gây hại cũng nhưcác mầm bệnh bên trong cơ thể (in vivo) bằng cách sinh ra các chất có tính kháng khuẩn như đãnêu trên. Có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào bacteriocin và phổ kháng khuẩn của bacteriocin,kết quả cho thấy khả năng kháng khuẩn của chúng vẫn còn rất hạn chế, phần lớn chúng chỉ có thểkháng lại các vi khuẩn Gram dương như kháng một số loài có liên quan mật thiết (các chủngLactobacillus khác) hoặc kháng các vi khuẩn sinh bào tử Gram dương như Bacillus và Clostridium(Holzapfel et al.,1995). Tuy nhiên vẫn có một số nghiên cứu khác cho thấy LAB có thể kháng lại một số vi khuẩnGram âm như: Salmonella, Escherichia coli và Helicobacter licobacter (Skytta¨ et al., 1992;Helander et al., 1997; Niku-Paavola et al., 1999) có thể là nhờ vào việc sản sinh ra các chất có 28
  29. 29. trọng lượng phân tử thấp (như H2O2, axit lactic, các hợp chất dễ bay hơi) và các hợp chất thứ cấp…trong quá trình trao đổi chất đã làm cho phổ kháng khuẩn của chúng được mở rộng hơn đối với vikhuẩn Gram âm. Chủng L. acidophilus LA1 có khả năng kháng lại cả vi khuẩn Gram dương vàGram âm như Staphylococcus aureus, L. monocytogens, Salmonella typhimurium, Shigellaflexneri, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter cloacae vàHelicobacter pylori (Bernet-Camard et al., 1997), (Michetti et al., 1999). Mặc dù LAB không có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Gram âm nhưng trong thực tếthì người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của LAB hơn vì các vi khuẩnGram âm thường là những vi khuẩn có hại và gây bệnh cho người như E. coli gây tiêu chảy,Salmonella gây bệnh thương hàn và Helicobacter gây viêm loét dạ dày…Bảng 8. Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng CO2 Ức chế quá trình decarboxylation, giảm tính thấm của màng. Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine. Hydrogen peroxide Oxy hóa các protein cơ bản. Lactoperoxide Axit lactic Axit lactic không bị phân hủy mà thấm vào màng làm giảm pH nội bào. Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như: oxidative phóphotylation. Bacteriocin Tác động lên màng , tổng hợp enzyme và tổng hợp protein.2.3. Tổng quan về phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic2.3.1. Nhu cầu tìm kiếm các nguồn mới 29
  30. 30. Trong những năm gần đây, khả năng kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biếntrong sự điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vikhuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc. Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốckháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng củamột số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, việc sản xuất lactase từ vi khuẩnlactic đã thu hút nhiều sự chú ý do LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và cótiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm.2.3.2. Phương pháp tìm kiếm các nguồn mới Tuy hầu hết các sản phẩm về lactase trên thị trường đều giống nhau về thành phần vi sinh,chỉ khác nhau về nhà sản xuất, mà mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau. Vì vậy việc phân lậpđể tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn lactase, làmtăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vikhuẩn sản xuất lactase là một quy trình lựa chọn cẩn thận. Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt…cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nênđược xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin,lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặnsự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủngvi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúpkích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vìchúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi. Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan, Rogosa,Sharpe.1960) từ nhiều nguồn khác nhau:- Từ các sản phẩm thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi….- Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo và từ mề gà… 30
  31. 31. - Từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh…. Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì việc quan trọng kế tiếp làphải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng. Công việc tuyển chọn ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt củaprobiotics, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhấttheo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp. Khảo sát tính an toàn của chủng (đối vớicon người, cho động vật và môi trường) trước khi mang đi sử dụng.2.3.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật2.3.3.1. Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển. Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm chua sữa và sau đó một dạng vikhuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là Lactococcus lactis) được đưa ra bởiJ. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khicó sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo axit lactic khác có trong cácnguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện(Orla-Jensen. 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửađổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla-Jensen vẫn phân loại dựa trênphương pháp cổ điển như: so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lênmen glucose (đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC),khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được môtả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp cổ điển dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai tròquan trọng trong phân loại LAB. Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như làphiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sựphù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình: Aerococcus, Lactobacillus,Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là 31
  32. 32. giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm : Enterococcus, Lactococcus vàStreptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đềnghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thayđổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loàiPediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hìnhtrong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũngđược mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum,Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera…Bản sửađổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trênthành phần hóa học và di truyền.(Owen R. Fennema et al. 2004)2.3.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằngphương pháp định danh cổ điển và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual 1986, tuynhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân loại một số giống mớinhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn. LAB được phân chia theo hình thái như sau: dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillusvà Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giốngWeissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theohai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) vànó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus,Pediococcus và Tetragenococcus. Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồnghình chuyển hóa glucose chủ yếu thành axit lactic và lên men dị hình tạo axit lactic, ethanol, axitacetic và CO2. Trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để phân biệt giữa 2 nhóm: nhóm 32
  33. 33. (Sharpe. 1979) Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dịhình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình. Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng góp phần phân biệt một số giống thuộccầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oCnhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thểphát triển ở 45oC tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữaEnterococci và Lactococi, Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối(18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu axit ở kiềm cũng rất hữu íchtrong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thểphát triển ở pH cao những không phát triển ở pH=9.6. Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của axit lactic trong quá trình len men glucosecũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic axit) và Lactobacilli lênmen dị hình (tạo axit lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấnđề này.(Owen R. Fennema et al. 2004)a. Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:- Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến).- Kiểm tra khả năng di động: nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm.- Nhuộm bào tử: nhuộm lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton), nhuộm Carbolic Fuchsin.- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và phươngpháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet).- Nhuộm vi khuẩn kháng axit…b. Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý:- Hình thái khuẩn lạc. 33
  34. 34. - Nhiệt độ sinh trưởng, chịu axit, chịu muối mật…- Nhu cầu oxygen.c. Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh chophù hợp như: khả năng đồng hóa các nguồn carbon, khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năngsinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệmđồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởngvới KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin,arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza,sorbitoi, phản ứng Methyl - Methyl Red, phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza… Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như: + API20E KIT : dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuậtnày nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân: trường hợp gene quyếtđịnh phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổitrong quá trình nuôi cấy dẫn đến làm sai kết quả. + Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khácnhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lênthành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễmnhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khácbiệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩnnghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặctính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vikhuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực 34
  35. 35. khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩnchủ. + Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệuquả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyếtđịnh kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế củaphương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiềutrường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng có hạn chế là:yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh khôngđồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. + Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptidkháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loạibacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đãđược phân loại dựa vào kiểu bacteriocin.2.3.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại. Việc phân loại LAB chủ yếu dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Tuy nhiên trongthực nghiệm, các đặc điểm này không đủ để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể.Ngày nay với công nghệ xác định trình tự DNA một các tự động và nhanh chóng, người ta đã trựctiếp xác định được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phânloại vi khuẩn (Owen R. Fennema et al. 2004) Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB đã được thựhiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để định danh vi khuẩn. Việcphân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được phát triển và sử dụng đối vớiLactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và phân biệt Vagococci với các LAB khác…Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danhmục các đầu dò hiện có được đưa ra bởi Pot et al. 35
  36. 36. 2.4. Các nghiên cứu về lactase trong và ngoài nước2.4.1. Trong nướcCác nghiên cứu về lactase ở Việt Nam có thể kể đến: Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cộng tác viên (2006) nghiên cứu sự biểu hiện củaenzyme lactase ở 2 chủng Lactobacilus reuteri L103 và L461. Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản,cho thấy 2 enzyme biểu hiện ở 2 tiểu phần ( 2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa).Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 ( chủng L461) vàmột pH 4.6 – 4.8 (chủng L103). Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứV, Trường Đại học Khoa học Hà Nội, 2006, và đã đăng trong tạp chí quốc tế. Nhóm tác giả này vềsau có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galactooligosaccharides manghoạt tính sinh học. Nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Văn Giang (2009) có 2 nghiên cứu tập trung vào nghiêncứu enzyme tái tổ hợp. Một là nghiên cứu biểu hiện β-glucosidase trong E.coli BL21. Một nghiêncứu khác là nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa B-glucosidase từ chủng Bacillus subtilisG1.2.4.2. Ngoài nước2.4.2.1. Nghiên cứu lactase từ nấm men Được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm lactase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từnấm men. Các loài nấm men như Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulopsisspherical, Torulautilis sp, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis. Lactase từ Sacchromyces fragilis được nghiên cứu từ rất sớm, 1956, khi đó Davids. A [47] đãbiết rằng lactase trong nấm men này là dạng nội bào và tìm ra phương pháp phá tế bào bằng hóachất để tăng hoạt tính enzyme. Nghiên cứu này cũng chỉ ra là lactase bị ức chế bởi nồng độ đườngGlc, Suc, nhưng kém ức chế hơn với Gal và Lac. 36
  37. 37. Về lactase của Candida pseudotropicalis, nghiên cứu của Sonia a. de Bales và Francisco J.Castillo, 1979 [46], nuôi trong canh trường chứa 10-12% nước chiết rút sản xuất phomai (whey) bổsung thêm khoáng và nước chiết nấm men. Hoạt tính enzyme thu được là 468 U/ml và 4.35 U/gsinh khối. Hoạt tính enzyme tối ưu ở pH 6.2 và nhiệt độ 470c. Hoạt tính này có thể bảo tồn 95% sau3 tháng bảo quản ở -200c Gần đây nhất (2008) [6] là nghiên cứu về sinh tổng hợp lactase từ Kluyveromyces marxianuscố định trên giá thể rắn với nồng độ cơ chất lactose là 50g/L, bổ sung them nguồn nitơ vàphosphor. Sau 30h nuôi cấy, 90% cơ chất bị chuyển hóa và thu được hoạt tính lactase nội bào là1147.7 UI/g sinh khối.2.4.2.2. Nghiên cứa lactase từ vi khuẩn Chủ yếu là từ Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, vi khuẩn Gramâm là E.coli. Chang B.S và cộng tác viên (1989) [41] đã tinh sạch lactase từ Streptococcussalivarius phân nhánh thermophilus đến mức độ 109 lần so với ban đầu, với hiệu suất là 41% vàhoạt tính là 592UI/mg protein ở 370c. Nếu đặt enzyme trong sữa thì hoạt tính này bền nhiệt (60-650c) tới 146 phút tức gấp 40-80 lần khi môi trường phản ứng không phải là sữa. Năm 2005, một nghiên cứu ở Ấn Độ, S.K.Akolkar và cộng tác viên [7] đã sinh tổng hợplactase từ Lactobacillus acidophilus, chủng phân lập từ sản phẩm len men ragi, một món ăn truyềnthống. Vi sinh được nuôi trong canh trường lỏng 5L, chứa nồng độ lactose rất thấp 0.75% cho thêmcó 1% ragi nên hiệu quả về kinh tế. Enzyme thu được có hoạt tính 5400U/ml-1 tức là thậm chí caohơn chủng đã sản xuất công nghiệp là nấm men Kluyveromyces lactis. Lactase trong E.coli được biết đến từ năm 1941 [48], khi đó người ta phải phá tế bào vi khuẩnđể thu dung dịch lactose thô . Enzyme nay đặc biệt có giải pH trung tính, tại pH 5.0 đã gần như mấthoạt tính . Nhiệt độ tối ưu là 360C. Gen mã hóa cho β-galactosidase của E.coli sau này được táchdòng, tái tổ hợp lại trong vectơ đặc hiệu với mục đích làm công cụ trong kĩ thuật di truyền để tuyểnchon các tế bào biểu hiện gen thông qua sàng lọc khuẩn lạc xanh trong môi trường chứa X-gal. 37
  38. 38. 2.4.3.3. Nghiên cứu lactase từ nấm sợi Điển hình là từ Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp. Đặc trưng chung là các enzymenày là ngoại bào nên quy trình tinh sạch khá dễ dàng. Phần lớn là enzyme chịu nhiệt và chịu pHacid yếu (3.0-5.0). Bên cạnh ưu điểm trên thì nhược điểm lớn nhất là hoạt tính riêng của enzymekhá thấp so với vi khuẩn và nấm men. Lactase từ Aspergillus sp được nghiên cứu nhiều hơn cả đólà các enzyme từ loài Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Một vài nghiên cứu tiêu biểu sau: Park, Y.K và cộng tác viên (1979) [45] đã tinh sạch lactase từ Aspergillus oryzae bằng kết tủaamon sulphate và sau đó là sắc kí cột thu được enzyme khá ổn định pH 3.0-8.0 và hoạt động tốt ởnhiệt độ 500c. Tuy nhiên enzyme này trong môi trường bò sữa đã giảm hoạt tính đáng kể. Sanjeev Agrawal và cộng tác viên (1982) [43] đã phân lập được 48 chủng nấm sợi có hoạttính lactase, trong đó có 8 chủng thuộc Aspergillus sp. Nghiên cứu cũng cho thấy là enzyme ngoạibào và thuộc tính enzyme thuộc dang chịu nhiệt Gần đây Zhang W và công tác viên (2005) [40] đã chuyển gene lactase của Aspergilluscandidus vào nấm men Pichia pastoris, tinh sạch enzyme và thu được enzyme có trọng lượng113kDa, hoạt tính là 3600U/mg, tối ưu ở pH 5.2 và nhiệt độ 600C. Đối với lactase từ Trichoderma sp, Francisco J. Castillo và cộng sự (1984) [42] đã nuôi chìmTrichoderma reesei Rut-C30 trong môi trường chứa lactose thu được hoạt tính enzyme ngoại bào27.3U/L. Hoạt tính enzyme đạt được cưc đại ở 600c và pH 4.6. Loại lactase này được gọi là lactaseaxit và phù hợp dùng trong môi trường có pH tương đối axit như nước chiết rút từ len men phomai. Lactase cũng có thể tách chiết từ nấm sợi Fusarium sp. Macris BJ, Markakis P (1981)[44] đãthu nhận enzyme ngoại bào từ chủng Fusarium moniliforme nuôi bằng nước chiết rút từ sản xuấtphomai (whey) và tủa bằng amonium sulphate. Kết quả là enzyme có hoạt tính tốt nhât ở pH 3.8 vànhiêt độ 500c. Tương tự như với enzyme từ Trichoderma sp, enzyme này thuộc dạng lactase axit vàthích hợp để thủy phân lactose trong nước chiết. Trong điều kiện thích hợp, 10 đơn vị hoạt tínhenzyme có thể thủy phân 50% lượng lactose trong vòng 5h. 38
  39. 39. 2.4.3.4. Một số chủng đã được thương mại hóa[58] Tác động đến Chủng Tên sản phẩm Nhà sản xuất con người Bifidobacterium animalis Chr. Hansen subsp. lactis BB-12 Bifidobacterium breve Bifiene Yakult Yakult Bifidobacterium infantis Align Procter & Gamble 35624 Bifidobacterium lactis Howaru Bifido Danisco HN019 (DR10) Bifidobacterium longum Morinaga Milk BB536 Industry Escherichia coli M-17 ProBactrix BioBalance Escherichia coli Nissle 1917 Mutaflor Ardeypharm Lactobacillus acidophilus Chr. Hansen LA-5 Lactobacillus acidophilus Danisco NCFM Lactobacillus casei DN114- 001 (Lactobacillus casei Actimel/DanActive Danone Immunitas(s)/Defensis) Lactobacillus casei CRL431 Chr. Hansen Cải thiện sức khỏe tiêu hóa, kích thích miễn dịch, làm giảm kháng sinh-liên quan đến tiêu chảy, điều chỉnh Lactobacillus casei F19 Cultura Arla Foods sự cân bằng men vi sinh trong ruột già, làm giảm sự tăng cân (Burrington, Kimberlee. 2007). 39
  40. 40. Lactobacillus casei Shirota Yakult YakultLactobacillus paracasei Lactobacillus fortis Nestlé Dành cho trẻ emSt11 (or NCC2461)[55]Lactobacillus johnsonii La1 Nestlé(Lactobacillus LC1) Kích thích miễn dịch, cải thiệnLactococcus lactis L1A Norrmejerier tiêu hóa, làm giảm kháng sinh - tiêu chảyLactobacillus plantarum GoodBelly / NextFoods Probi299V ProViva/ TuZen Ferring Phòng, chống và giảm thiểu tiêuLactobacillus reuteri ATTC chảy ở trẻ em,55730 (Lactobacillus reuteri BioGaia Biologics cải thiện hệ tiêuSD2112) hóa. Phòng bệnh ở tẻ em và người lớnLactobacillus rhamnosus Vifit và một số mặtATCC 53013 (discoveredby Valio hàng khácGorbach & Goldin (LGG) Kích thích miễn dịch, cải thiệnLactobacillus rhamnosus Verum Norrmejerier tiêu hóa, làmLB21 giảm kháng sinh-tiêu chảyLactobacillus salivariusUCC118 chống lại kháng sinh-được liên kết và tiêu chảy Wren [ClostridiumSaccharomyces cerevisiae DiarSafe và một số Laboratories và difficile] bệnh(boulardii) lyo mặt hàng khác một số hảng khác nhiễm trùng, để điều trị tiêu chảy cấp tính ở người lớn & trẻ em 40
  41. 41. Hỗn hợp: Bion Flore IntimeLactobacillus rhamnosus Ngăn ngừa viêm Jarrow Fem- Chr. HansenGR-1 & Lactobacillus âm đạo Dophilusreuteri RC-14Hỗn hợp :mixture of 8 strains of Sigma-TauStreptococcus thermophilus VSL#3 Pharmaceuticals,& four Lactobacillus spp & Inc.three Bifidobacterium sppstrainsHỗn hợp:Lactobacillus acidophilusCUL60 & Bifidobacteriumbifidum CUL 20 Cải thiện sức khỏe tiêu hóa. Ngăn ngừa Tiêu chảy Có liên hệ Antiobic (AAD) và Clostridium (C Difficile). Kiềm hãm In vitro ở nhữngHỗn hợp: chủng ListeriaLactobacillus acidophilus Bio-K+ monocytogenes BioK PlusCL1285 & Lactobacillus International và L. innocua,casei Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis và Enterococcus faecium. tiêu hóa đường lactose và kích thích miễn dịch 41
  42. 42. Lactobacillus helveticus ABiotica và một số R0052 & Lactobacillus Institut Rosell mặc hàng khác rhamnosus R0011 Hỗn hợp pha trộn từ 16 chủng: Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve Bifidobacterium infantis Bifidobacterium lactis Bifidobacterium longum Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Flora Source® Lactobacillus bulgaricus Nutri-Health® Multi-Probiotic® Lactobacillus casei Lactobacillus gasseri Lactobacillus paracasei Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus salivarius Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus2.4.3.5. Sản xuất chế phẩm lactase trên thế giới Lactose hiện diện ở nồng độ khoảng 4,7% (w / v) trong sữa và whey (nổi trên mặt) còn lại saugiai đoạn đông tụ làm pho mát. Sự hiện diện của nó trong sữa làm nó không phù hợp với phần lớndân số người lớn trên thế giới, đặc biệt ở những khu vực không có truyền thống về ngành côngnghiệp sữa. Bất dung nạp lactose được giới hạn chủ yếu ở dân tộc có nguồn gốc nằm ở Bắc Âu haytiểu lục địa Ấn Độ và nhờ ổn định lactase, tất cả các động vật có vú trẻ rõ ràng có thể tiêu hóa sữa,nhưng trong nhiều trường hợp khả năng này giảm sau khi cai sữa. Thái Lan, Trung Quốc và ngườiMỹ đen tương ứng với 97%, 90% và 73%, được báo là không dung nạp lactose, trong khi ngườiMỹ trắng và dân số Thụy Điển tương ứng với 84% và 96%. Thêm vào đó, chỉ có rất hiếm một sốcá nhân không dung nạp lactose chuyển hóa bẩm sinh hoặc thiếu lactase, cả hai đều có thể nhậnthấy khi sinh. Sự cần thiết của sữa có hàm lượng lactose thấp đặc biệt quan trọng trong chương 42
  43. 43. trình viện trợ thực phẩm như mất nước mô nghiêm trọng, tiêu chảy và thậm chí tử vong do ăn sữacó chứa lactose, trẻ em không dung nạp lactose và người lớn bị suy dinh dưỡng protein có hàmlượng calo thấp. Trong tất cả các trường hợp, thủy phân lactose thành glucose và galactose sẽ ngănchặn các vấn đề tiêu hóa (nặng)[55]. Một vấn đề khác được trình bày bởi lactose là khả năng hòa tan thấp dẫn đến hình thành tinhthể ở nồng độ cao hơn 11% (w / v) (4C). Điều này ngăn cản việc tập trung sử dụng xi-rô wheytrong quá trình sản xuất thực phẩm, tạo nhiều kết cấu phức tạp và dễ dàng bị hư hỏng visinh. Thêm vấn đề nữa là việc xử lý chất thải whey như vậy là rất đắt tiền do nhu cầu oxy sinh họccủa nó cao. Những vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách thủy phân lactose trong sữa, sảnphẩm có các yếu tố như độ ngọt, hòa tan, khả năng hình thành tập trung, an toàn vi sinh và xi-rô(70% (w / v))[55].Lactose có thể được thủy phân bởi lactase, một b-galactosidase: Hình 10. Quá trình thủy phân lactose[54] Lactase thương mại có thể được chế biến từ sữa nấm men Kluyveromyces fragilis ( K.marxianus var. marxianus), với độ pH tối ưu (pH 6,5-7,0), hoặc từ các loại nấm Aspergillusoryzae hoặc A. niger, với Optima pH (pH 4,5-6,0 và 3,0-4,0 hoặc tương ứng) phù hợp với thủyphân whey hơn. Các men này có thể có mức độ khác nhau về sự ức chế sản phẩm của 43
  44. 44. galactose. Ngoài ra, ở nồng độ lactose và galactose cao, lactase cho thấy khả năng truyền enzymeđáng kể và sản xuất b-1,6 liên kết với oligosaccharides galactosyl[55]. Lactase đang được sử dụng trong sản xuất kem, sữa cô đặc và có hương vị ngọt. Khi đượcthêm vào sữa hay sữa lỏng (2000 U kg -1 ) và để khoảng một ngày 5C sẽ có khoảng 50% lactoseđược thủy phân, đưa ra một sản phẩm có độ ngọt mà không kết tinh nếu ngưng tụ hoặc đônglạnh. Phương pháp này cho phép không lãng phí whey để thay thế một số hoặc tất cả sữa bột táchkem được sử dụng trong công thức nấu kem đá ăn truyền thống. Nó cũng cải thiện khả năng mởrộng và tính mượt của sản phẩm. Số lượng lactase nhỏ hơn có thể được thêm vào sữa tiệt trùng đểsản xuất một sản phẩm lactose tương đối rẻ tiền ( ví dụ như 20 U kg -1, 20C). Nói chung, việc sửdụng lactase không đạt được tiềm năng đầy đủ của nó, vì enzyme hiện nay tương đối đắt tiền vàchỉ có thể được sử dụng ở nhiệt độ thấp[55]. Lactase từ tế bào động vật, thực vật và nấm men và vi khuẩn là dạng nội bào, còn từ nấm mốclà dạng ngoại bào. Vị trí tồn tại của enzyme trong tế bào sẽ quyết định phương pháp tinh sạch cũngnhư từ đó dự toán chi phí cho công đoạn này, thông thường chiếm tỷ trọng lớn trong quá trình sảnxuất . Trong công nghiệp hiện nay chủ yếu sản xuất enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật do thờigian sinh trưởng nhanh. Lactase từ vi khuẩn có đặc trưng là hoạt tính thông thường cao hơn nhiềuvà lượng enzyme cũng tạo ra nhiều hơn so với lactase có nguồn gốc từ vi nấm , tuy nhiên phươngpháp tinh sạch và tốn kém hơn.Các sản phẩm lactase có thể : - Dạng lỏng sử dụng trực tiếp nhỏ vào sữa để phân hủy lactose - Dạng cố định để sản xuất sữa nghèo lactase - Dạng viên nén để uống hôc trợ tiêu hóa lactase tại ruột non Đối với enzyme cho sản xuất sữa thì chủ yếu là enzyme từ nấm men còn để hỗ trợ tiêu hóa thìenzyme từ nấm sợi được sử dụng nhiều hơn. 44

×