Estudio metabolómico con HRMAS-RMN de 1H para evaluar la calidad y trazabilidad de queso mozzarella de leche de búfala.

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Trabajo de la asignatura Métodos Instrumentales y experimentales en Química y Biotecnología del Máster en Química y Biotecnología

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Estudio metabolómico con HRMAS-RMN de 1H para evaluar la calidad y trazabilidad de queso mozzarella de leche de búfala.

  1. 1. MIEQB Sandra Marín San Román Mónica Martínez Junquera 1 Aplicación RMN Estudio metabolómico con HRMAS-RMN de H1 para evaluar la calidad y trazabilidad de queso mozzarella de leche de búfala. Introducción La producción de mozzarella en la región de Campania (Italia) es relevante para mantener la economía agroalimentaria de la región, así como la denominación de origen. La alta demanda del consumidor de este queso, la cantidad limitada de leche búfala disponible y el alto precio de mercado, convierten a este producto en uno de los más afectados por los fraudes y las adulteraciones. Con el fin de evaluar la autenticidad, trazabilidad y calidad de este producto, se ha empleado la RMN-HRMAS (High Resolution Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance) en combinación con análisis de componentes principales (PCA). Esta técnica RMN consiste en hacer girar a la muestra a una velocidad superior que la habitual consiguiendo unos espectros mono y bidimensionales de gran calidad, se utiliza para materiales semisólidos permitiendo examinar directamente los metabolitos del producto alimentario sin pretratamiento de muestra. Preparación muestra Para ello se analizaron 37 muestras de queso, todas ellas obtenidas a partir de leche de búfala producida por animales criados en la fábrica “La perla del mediterráneo” y 12 muestras con denominación de origen de un mercado local. Las 37 muestras provenientes de la fábrica se trataron y se guardaron por individual dentro de un paquete sumergido en suero de mozzarella y almacenado a 25 °C hasta su análisis por RMN- HRMAS, después se devolvió a su envase original almacenándolo durante dos días en las mismas condiciones tras los que se realizó un análisis RMN-HRMAS de la muestra envejecida. Experimentos RMN Todos los experimentos se llevaron a cabo a una temperatura de 25 ± 1°C en un espectrómetro Bruker Avance de 400MHz equipado con una sonda 1 H-13 C HRMAS Bruker que hace girar al rotor a 5KHz utilizando como disolvente D2O.
  2. 2. MIEQB Sandra Marín San Román Mónica Martínez Junquera 2 La identificación estructural de los metabolitos de las muestras se consiguió a partir de espectros de RMN bidimensionales: 1. Homonuclear 1 H-1 H COSY (COrrelation SpectroscopY) y TOCSY (Total COrrelation SpectroscopY). 2. Heteronuclear 1 H-13 C HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation) Resultados RMN El espectro 1 H HRMAS convencional no discernía entre las muestras de queso por ello se aplicaron dos secuencias de pulso eDiff (Diffusion measurement) y eCPMG (Carr-Purcell- Meiboom-Gill) que eliminaron los metabolitos específicos y por lo tanto las señales de las moléculas de movimiento lento (compuestos lipídicos). Esta simplificación permitió una observación más clara de picos y multipletes de moléculas relativamente más rápidas (aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos…), a pesar de la reducción parcial de la intensidad de la señal, y en ocasiones la resolución de la constante de acoplamiento (J). Figura 1. Espectros 1 H HRMAS de muestras de mozzarella a) espectro de 1 H convencional; b) eDiff; c) eCPMG
  3. 3. MIEQB Sandra Marín San Román Mónica Martínez Junquera 3 Figura 2. Espectros de 1 H eCPMG a) Muestras de la fabrica; b) Muestras del mercado local; c) Muestras de la frabrica envejecidas de dos días. Tabla 1. Desplazamientos químicos especficos de cada metabolito.
  4. 4. MIEQB Sandra Marín San Román Mónica Martínez Junquera 4 Conclusiones En este trabajo se demostró que la técnica RMN-HRMAS es una herramienta eficiente, poderosa y rápida para caracterizar la composición molecular de quesos. Las condiciones adoptadas para los espectros eCPMG y eDiff modificados proporcionan espectros simplificados pero significativos que revelaron las señales necesarias para un estudio metabolomico. Las muestras de fábrica (a) tienen más cantidad de β-galactosa y β-lactosa, mientras que las del mercado local (b) tienen un mayor contenido de ácido acético, esto se debe al proceso de transformación. Entre a) y c) se puede observar como aparece un pico correspondiente al alcohol isobutílico, y crecen los picos correspondientes a ácido acético y ácido láctico de las muestras envejecidas. La base de datos obtenida en este experimento sirve como una herramienta para probar y evaluar la calidad molecular de este tipo de queso, rastrear su origen geográfico, evitar posibles fraudes y adulteraciones y estudiar su envejecimiento.

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