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tanaka m

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  1. 1. DNA 塩基配列設計のための バルジループ構造の安定性に関する研究 システム情報工学専攻 複雑系工学講座 調和系工学分野 修士2年 田中 文昭
  2. 2. 背景 しかし,エネルギー曲面は未知であるので,各構造を形成した際の⊿G を予測 することが求められる DNA コンピューティングにおいては, DNA が意図した構造を形成すること が望まれる misG trueG :意図しない構造の⊿G :意図した構造の⊿G 塩基配列設計が必要 評価関数 max GGG truemis G misG misG trueG G GTCT GCAGA C 自由エネルギー 二本の DNA が結合する際の エネルギー曲面
  3. 3. 従来の塩基配列設計手法 G 配列がシフトして結合した構造のみを考慮して いるが,実際にはバルジループと呼ばれる安定 な構造を形成することが知られており,これらも 考慮する必要がある CCG GGT GGC CCA T CCG GGT GGC CCA A T C G T C T 塩基配列を互いにシフトさせていき,相補対の数で安定性を評価する [Garzon 98][Arita 00][Udo 01][Satoshi 02] 一般的に,ループ長が 短いほど安定する 一塩基バルジループ 塩基配列設計においては,バルジループのうち最も安定する 一塩基バルジループ の安定性を調査する必要がある
  4. 4. 目的 ⊿G を推定することによって一塩基バルジループの安定性を明 らかにする GGGTA GTTCA T CCGAT CAAGT ループ塩基 サイド塩基
  5. 5. 一塩基バルジループの⊿G に寄与する要因 一塩基バルジループの⊿G に影響を与える要因は以下に分類される A? T? C? G? A.ループ塩基の種類 B.サイド塩基の種類 D.それ以外の塩基配列 A? T? C? G? A? T? C? G? G T C T G C A G A C CCGAT CAAGT GGGTA GTTCA T C.ループの位置 塩基配列は,スタッキングと呼ばれる力によって 隣接する塩基同士引き合っているが,それ以外の 塩基とは直接のインタラクションは無い [Jan 02] バルジループによる影響はループ塩基とサイド塩基,ループの位置に よって説明されると仮定し,⊿G の推定を行う
  6. 6. 従来モデルの適用 DNA がある構造を形成した際のΔG を隣接する塩基対の⊿G の総和と仮定する [SantaLucia 96] [Hatim 98] [Nicolas 99] [Salvatore 00] (例) ACTGcoreG ATGbulgeG     A T T A CC G A T C A T G G T A A T T A C T A G T A C C A T G A T C A T G G T A C T A G T A C C A T ループ塩基 X A T C G AXA ○ ○ ○ ○ AXT ○ ○ ○ ○ AXC ○ ○ ○ ○ サ AXG ○ ○ ○ ○ イ TXA ○ ○ ○ ○ ド TXT ○ ○ ○ ○ 塩 TXC ○ ○ ○ ○ 基 TXG ○ ○ ○ ○ CXA ○ ○ ○ ○ CXT ○ ○ ○ ○ CXC ○ ○ ○ ○ CXG ○ ○ ○ ○ GXA ○ ○ ○ ○ GXT ○ ○ ○ ○ GXC ○ ○ ○ ○ GXG ○ ○ ○ ○ バルジループに適用 NN model を用いて全てのバルジループ の⊿G を推定するためには,右表にある 64個の⊿G が必要 [Sugimoto 00] = + + +G CC GGG CT GAG TG ACG GG CCG G G A C C C C T G G = G G C C G A C T A C T G C C G G+++ Nearest-Neighbor model (NN model) 予測可能 予測可能 未知
  7. 7. 実験~ループの位置と安定性~ バルジループの安定性は ループの位置に影響する 温度 吸光度 二本鎖 一本鎖 1.0 0 0.5 Tm 従来のモデルを適用するに当たって,ループの位置と 安定性との関係につい て調査を行った.安定性の指標としては,融解温度(Tm) を用いた. 溶液中に一本鎖と二本鎖が1:1で存在する温度 Tm (30uM) 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 0 5 10 15 20 ℃ A G T G A G T C A G A G T C 温度 吸光度 1.0 0 0.5 Tm T G T G A G T A G C T A G A G C T C G A A C A C T C A T C G A T C T C G A G C T Tm Tm が高い二本鎖ほど, 二本鎖から一本鎖に解 離しにくいため,安定した 構造といえる 安定 不安定
  8. 8. ⊿G を算出する配列の選択 •ループの位置による影響を出来るだけ等しく するように,バルジループが塩基配列の真ん 中に存在する配列を用いて実験を行った •今回はループの位置が確定するような バルジループの⊿G のみ算出した. •ただしサイド塩基とループ塩基が一致す る場合にはより安定するという先行研究 があるため [Zhu 99],比較として AAA, TTT, CCC, GGG の4つに関しては算出し ている C AA G G T T C A C AA G G T T C A C AA G G T T C A ・・・C G・・・ ・・・G T T C・・・ A AA AA T T C ・・・A C・・・ ・・・T C G・・・ GG A G C T C G GA G C T C G G GTCTG CGTAC T 64個中40個のパラメータを算出 ループ塩基 X A T C G AXA ○ ○ ○ ○ AXT - - ○ ○ AXC - ○ - ○ サ AXG - ○ ○ - イ TXA - - ○ ○ ド TXT ○ ○ ○ ○ 塩 TXC ○ - - ○ 基 TXG ○ - ○ - CXA - ○ - ○ CXT ○ - - ○ CXC ○ ○ ○ ○ CXG ○ ○ - - GXA - ○ ○ - GXT ○ - ○ - GXC ○ ○ - - GXG ○ ○ ○ ○ CAGAC GCATG
  9. 9. ⊿G の算出方法 ⊿G は直接測定できる物理量ではないため,Tm を用いて推測する Tm 4/ln Ct Tm 1 傾き=a 切片=b H S Ct H R Tm      ]4/ln[ 1 H S Ct H R Tm      ]4/ln[ 1 SHG  15.310 エンタルピー エントロピー [Luis 87] : : S H   : : Ct R 気体定数 DNA 濃度 回帰分析 データ数:最低 7 点 手法:最小二乗法 傾き 切片 傾き   RR G 15.310                                 22 2 2 22 2 2 22 15.31015.310 2 15.31015.310 a Rb a R a R a Rb a R a R ab abG  
  10. 10. 実験結果 -2 -1 0 1 2 3 4 5 ⊿G(kcal/mol) AXA AXT AXCAXG TXA TXT TXC TXG CXA CXT CXC CXGGXAGXTGXC GXG A T C G 全ての回帰分析において,決定係数 ≧ 0.96 Tm の誤差が小さく,実験の信頼性がある程度保証されている 不安定 安定 0.00291 0.00292 0.00293 0.00294 0.00295 0.00296 0.00297 0.00298 0.00299 -16 -15 -14 -13 -12 -11 0.00296 0.00297 0.00298 0.00299 0.003 0.00301 0.00302 0.00303 0.00304 0.00305 -16 -15 -14 -13 -12 -11  AA T T T T G A T C AA G G T A AA T T C T A G T T C C A T G A T C AA G G T A C T A G T T C C A T ATAG coreG AAGbulgeG   エラーバーは誤差
  11. 11. 塩基配列設計への寄与 G バルジループの⊿G の推定値が得られたことでエネルギー曲面をより正確に予測 できると期待される バルジループの⊿G を考慮して塩基配列設計を行うことで 一塩基バルジループを排除するような配列の生成が可能になると思われる G G 従来手法によって 推定されたエネルギー曲面 バルジループの⊿G を考慮した曲面 バルジループの⊿G を考慮して 塩基配列設計を行い得られる曲面
  12. 12. 関連研究との比較 1 ループ部が AAA, TTT, CCC, GGG のバルジループは, 構造の自由度が高い分,安定する傾向がある [Zhu 99] -2 -1 0 1 2 3 4 5 ⊿G(kcal/mol) A*A T*T C*C G*G 従来と同様の傾向が見られた A T C G 不安定 安定
  13. 13. 関連研究との比較 2 N N N N N N H プリン塩基 ピリミジン塩基 平均⊿G の比較 : プリンとピリミジン 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 ⊿G(kcal/mol) プリン ピリミジン 平均⊿G の比較 : ループ両端の塩基対 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 ⊿G(kcal/mol) プリン*プリン ピリミジン*ピリミジン 従来と同様の傾向が見られた •ループ塩基に関して [Krzyztof 91] •サイド塩基に関して [Papanicolaou 84] > DNA の塩基はプリン塩基とピリミジン塩基に分類される A および G T および C < N N N N H N N N N N N H N NN N H N N N N ⊿G の比較
  14. 14. 結論 • 本研究では,NN model におけるバルジループ部分のΔG の推 定を行った • これによって,塩基配列設計でバルジループの形成を防ぐこと が可能となると考えられる • 本研究の結果は従来の定性的な結果と一致した • ループの位置という NN model では考慮されていない要因に よって構造の安定性が左右されるということを示した 今後の課題 • 残り24種類のバルジループ部分の⊿G を算出 • ループの位置による影響の定量化 • NN model とループの位置による影響を組み合わせてモデル化 • ⊿G の予測精度を検証

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