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iimura b

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iimura b

  1. 1. 一本鎖DNAの構造安定性と 分子間反応の関係に関する研究 複雑系工学講座 調和系工学研究室 飯村 直記 卒業論文発表
  2. 2. 背景 ・DNA分子の形態変化を利用し、並行並列・自己組織化等の情報処理の実現を目指している ・化学実験の失敗による時間・コスト削減や、化学反応モデル設計の際の仮定の 正しさ検証するためにハイブリダイゼーションのシミュレーションがつくられている。 ・DNAを構成する4つの塩基のうちGとC、AとTが結合する反応 ・DNA computingにおいて重要な反応 G C C AT G GC A T G CC AT G GC A T DNA computing ハイブリダイゼーション反応 複数種のDNA の競合状態 個々の一本鎖DNAが 二次構造をとっている シミュレーション このような状況を反映した シミュレータがない DNA computingにおける 化学実験の反応溶液中
  3. 3. 研究目的 ハイブリダイゼーションのモデル構築に向けて 一本鎖DNAの二次構造とその安定性がハイブリダイゼーションに どのような影響を与えるか化学実験によって検証する。 本研究の目的 しかし、化学実験によるデータ、検証が行なわれていない。 •競合する分子の数や、個々の一本鎖DNAの二次構造とその安定性が 他分子とのハイブリダイゼーションの起こりやすさにどのように影響するか モデル構築に必要なこと ある一本鎖DNA 同士分子間で ハイブリダイズ するだろう… と予測 実際は 一本鎖DNAの二次構造 によって分子間で ハイブリダイズしない 競合状態
  4. 4. •二次構造の安定性の尺度 → 塩基配列の並びに依存する自由エネルギー(ΔG) T A C C AC G C A G A T G C G T G G T G GG G G G G A A A C C C T TT T 低 ΔG 高 安定 構造 不安定 一本鎖DNAの二次構造安定性[Tinco,1971] ΔGが最も小さいものが、最も安定した二次構造(形態)と予測される。 二次構造予測シミュレータ Mfold [Zuker,1996] • 一本鎖DNAのΔGとDNA間のハイブリダイゼーションにどのような関係があるか。 • 一本鎖DNAの二次構造がDNA間のハイブリダイゼーションにどのように影響するか。 を検証する。 一本鎖DNAの二次構造と安定性 本研究では
  5. 5. 検証手段 • 一本鎖DNA同士がハイブリダイズし、二本鎖DNAを形成する。 • ハイブリダイゼーションによる結合は融解するので、ハイブリダイズした様子や痕 跡が残っていることが望ましい G C C AT G GC A T G CC AT G GC A T 16mer16mer 状態分子 遷移分子 酵素伸長ハイブリダイズ 94℃ 10sec 66℃ 60sec 冷却 16mer16mer 加熱 48mer 修飾し伸長しない 相補 ST PCR [Hashimoto et al,2003] 付可逆反応 検証手段に必要な要素 •一本鎖DNA同士がハイブリダイズし、二本鎖DNAを形成するアプリケーション •不可逆な酵素伸長を利用して、ハイブリダイゼーションを配列の長さの違いと して観測できる
  6. 6. 実験方法 反応率 = 初期の32merの状態分子のうち、反応によって 48merに伸長された分子の割合 48mer 32mer 温度サイクル 0 1 2 レーン 反応率 •ΔGが異なる配列6本 •3’末端のダングリングエンドの長さが異なる配列6本 使用する配列 G G C C A A T T G C C A A T T C T G C A ダングリングエンド 3’5’ •変性ゲル(長さによってDNAを •分離できる)による電気泳動 (200V,60min) •SYBR GOLDで染色 (25min) •ゲル写真の画像解析に よって反応率を求める 状態分子 遷移分子 各々の状態分子に対して ST PCR(2サイクル) 二次構造やその安定性 が配列によって異なる 二次構造が異なる
  7. 7. (実験1)一本鎖DNAの構造安定性とハイブリダイゼーションの関係についての実験 ST PCRを2サイクルまで試行。全4回の実験の平均。 仮定:ΔGが低いものほど構造が安定し、他のDNAとのハイブリダイゼーションが進行 しにくくなるのでは? ST PCRサイクルと反応率の変化 0サイクルと1サイクルの反応率の差とΔGの関係 反 応 率 反 応 率 の 差 PCR cycle 1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 1 2 1.2 dG 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 相関係数 0.635 ΔGが低いものほど、ハイブリダイゼーションが起こりにくい傾向がみられる
  8. 8. (実験2-1)二次構造とハイブリダイゼーションの関係 • ST PCRサイクルを2サイクル行う。 • 全3回の実験の平均。 PCR cycle 反 応 率 ダングリングエンドの長さと反応率の変化 3‘末端側のダングリングエンドの長さの違いに注目し、二次構造と 他分子とのハイブリダイゼーションとの関係を調べる G G C C A A T T G C C A A T T C T G C A ヘアピン ダングリングエンド 3’5’ 0 1 2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 8mer 2mer 12mer 1mer 6mer 6mer 二次構造によって反応率に違いが見られたが、 ダングリングエンドの長さと分子間のハイブリ ダイゼーションの相関は弱い。 状態分子のみによるST PCR 相関係数 -0.569
  9. 9. (実験2-2)二次構造と自己伸長の関係 GCCCAAGTGCA TTTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA TTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA CGGGTTCACGT GCC TTT A T C ミスマッチを削除 自分自身を鋳型に伸長 酵素による自己伸長 全てのダングリングエンドが削除され、自己伸長が起こったと仮定し、 そのときに生成される配列の長さを求め、電気泳動結果と比較する。 検証方法 配列 A B C D E F G H I J K L 最も安定な構造 1 1 1 2 6 6 6 6 7 8 11 12 2番目に安定な構造 10 8 21 9 1 1 10 1 3番目に安定な構造 10 10 10 6 1 Mfoldによるダングリングエンドの予測
  10. 10. GCCCAAGTGCA TTTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA TTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA CGGGTTCACGT GCC TTT A T C ミスマッチを削除 自分自身を鋳型に伸長 酵素による自己伸長 全てのダングリングエンドが削除され、自己伸長が起こったと仮定し、 そのときに生成される配列の長さを求め、電気泳動結果と比較する。 Mfoldによるダングリングエンドの予測 配列 A B C D E F G H I J K L 最も安定な構造 1 1 1 2 6 6 6 6 7 8 11 12 2番目に安定な構造 10 8 21 9 1 1 10 1 3番目に安定な構造 10 10 10 6 1 ダングリングエンドの塩基数が少ないものほど、自己伸長が起こりやすい 競合状態における分子間のハイブリダイゼーションに間接的に 影響を与える可能性がある。 検証方法 (実験2-2)二次構造と自己伸長の関係
  11. 11. • まとめ – 一本鎖DNAの構造が安定してるほどハイブリダイゼーションが起こりに くい傾向がみられた。 – 一本鎖DNAの二次構造の違いがハイブリダイゼーションに与える相関 は弱かった。 – ダングリングエンドの少ないものほど、自己伸長が起こりやすく、分子 内ハイブリダイゼーションが間接的に分子間ハイブリダイゼーションに 影響を及ぼしている可能性がある。 – 分子間のハイブリダイゼーションを考える際には分子内ハイブリダイ ゼーションによる影響を考慮しなければならない。 • 今後に向けて • 今回用いた配列と異なる配列集合を利用し、本研究の検証。 • 配列の長さとハイブリダイゼーションにどのような関係があるのか 検証。 • モデル構築。 • シミュレーターの構築

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