Overview on protein based biosensors

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Overview on protein based biosensors

  1. 1. Proteine per la biosensoristica Riccardo Castagna LATEMAR Unit - Politecnico di Torino Italy
  2. 2. BIOSENSORI METODOLOGIE BIOCHIMICHE PROTEINE
  3. 3. <ul><li>Visione di insieme, dal DNA alle proteine </li></ul><ul><li>Struttura </li></ul><ul><li>Funzione biologica </li></ul><ul><ul><li>- strutturale </li></ul></ul><ul><li>- trasporto </li></ul><ul><li>- energetica/enzimatica </li></ul><ul><li>Anticorpi - Antigeni </li></ul>Proteine > Outline
  4. 4. Trascrizione DNA Deossiribosio Nucleotidi (A,G,C,T) Doppio filamento RNA Ribosio Nucleotidi (A,G,C,U) Singolo filamento
  5. 5. Trascrizione DNA RNA messaggero (mRNA) transfer (tRNA) ribosomale (rRNA) small interference (siRNA) micro (miRNA) … RNA Polimerasi
  6. 6. Traduzione (1) RNA messaggero (mRNA) > SPLICING
  7. 7. Traduzione (2) RNA messaggero (mRNA) > dalle triplette agli AMINOACIDI <ul><li>CODICE GENETICO degenere </li></ul><ul><li>Ogni tripletta (codone) determina un unico AA </li></ul><ul><li>Griglia di lettura </li></ul><ul><li>4 nucleotidi > 4 3 possibili combinazioni </li></ul><ul><li>In natura esistono 20 aminoacidi </li></ul>
  8. 8. Traduzione (3) RNA transfer (tRNA)
  9. 9. Traduzione (4) RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
  10. 10. Traduzione (5) RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
  11. 11. Traduzione (6) AMINOACIDI Sostanze organiche bifunzionali costituite cioè dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
  12. 12. Traduzione (7) AMINOACIDI IDROFILICI
  13. 13. Traduzione (7) AMINOACIDI IDROFOBICI AMINOACIDI SPECIALI
  14. 14. Traduzione (8)
  15. 15. Traduzione (6)
  16. 16. Traduzione
  17. 17. Struttura (1) STRUTTURA SECONDARIA Conformazione spaziale delle catene Foglietti Beta Alfa Eliche STRUTTURA PRIMARIA Sequenza lineare dei residui aminoacidici
  18. 18. Struttura (2) STRUTTURA TERZIARIA Conformazione tridimensionale assunta dall’intera sequenza di residui aminoacidici. L’ambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine. <ul><li>Tipi di Legami intramolecolare </li></ul><ul><li>Legami ad Idrogeno </li></ul><ul><li>Ponti Disolfuro </li></ul>
  19. 19. Struttura (2) STRUTTURA QUATERNARIA Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo l’associazione di due o piu’ unita’ polipeptidiche, unite tra loro da legami deboli.
  20. 20. Struttura (3)
  21. 21. Struttura (3) ARCHITETTURA DELLE PROTEINE In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi: <ul><li>Proteine fibrose </li></ul><ul><li>strutture lineari semplici e regolari </li></ul><ul><li>insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite </li></ul><ul><li>Proteine globulari </li></ul><ul><li>forma approssimativamente sferica </li></ul><ul><li>molto solubile in acqua </li></ul>
  22. 22. Proprieta’ (1) Le proprietà delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti, gli amminoacidi: sono elettroliti anfoteri, possono essere sottoposte ad elettroforesi , sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle , di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze d'onda della luce incidente). Il punto isoelettrico o PI di una proteina è rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo, che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione. Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione. Tra le tante, quella che fornisce i risultati più precisi è senza dubbio la spettrometria di massa .
  23. 23. Funzione (1) <ul><li>Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi, le proteine svolgono numesore funzioni. </li></ul><ul><li>Strutturale </li></ul><ul><li>Immunitaria </li></ul><ul><li>Trasporto (di ossigeno, metalli, lipidi, di membrana) </li></ul><ul><li>Energetica - Enzimatica </li></ul><ul><li>Identificazione dell'identità genetica, ormonale, enzimatica, contrattile. </li></ul>
  24. 24. Funzione (2) STRUTTURALE <ul><li>Forniscono supporto meccanico e base </li></ul><ul><li>per i movimenti a cellule e tessuti </li></ul><ul><li>Esempi </li></ul><ul><li>collagene </li></ul><ul><li>elastina </li></ul><ul><li>actina </li></ul><ul><li>tubulina </li></ul><ul><li>cheratina </li></ul>
  25. 25. Funzione (3) TRASPORTO <ul><li>Generano movimenti nelle cellule e nei tessuti. </li></ul><ul><li>Possono trasportare singole molecole (ossigeno, anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole </li></ul><ul><li>Esempi </li></ul><ul><li>miosina </li></ul><ul><li>chinesina </li></ul><ul><li>dineina </li></ul><ul><li>Le proteine motrici si muovono su “rotaie” formate da proteine strutturali </li></ul>
  26. 26. Funzione (4) <ul><li>ENERGETICA – ENZIMATICA </li></ul><ul><li>Gli enzimi sono i catalizzatori biologici </li></ul><ul><li>Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologici </li></ul><ul><li>Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente e </li></ul><ul><li>Hanno un alta efficienza </li></ul><ul><li>Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati) </li></ul>
  27. 27. Funzione (5) La velocità di una reazione chimica è indipendente d al D G ma è determinata dall’ampiezza della barriera dell’energia di attivazione. I catalizzatori aumentano la velocità di reazione, abbassando questa barriera.
  28. 28. Funzione (6) Nel sito attivo, i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente. Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede.
  29. 29. Anticorpi (1) CATENA LEGGERA Frammento Fab ( antibody binding ) CATENA PESANTE Frammento Fc ( crystallizable ) Regione Cerniera
  30. 30. Anticorpi (2) <ul><li>Quando sono introdotti in un ospite estraneo </li></ul><ul><li>gli antigeni inducono la formazione di anticorpi </li></ul><ul><li>Interazione antigeni-anticorpi: Gli anticorpi e </li></ul><ul><li>gli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinità e legamento (concetto della chiave e della serratura) </li></ul><ul><li>Il legamento tra anticorpi e antigeni porta alla </li></ul><ul><li>eliminazione dell'immunogeno. </li></ul>
  31. 31. Nella cellula
  32. 32. <ul><li>Saggi immunologici </li></ul><ul><li>- definizione </li></ul><ul><li>- potenzialita’ e limitazioni </li></ul><ul><li>- saggi competitivi </li></ul><ul><li>- saggi NON competitivi </li></ul><ul><li>- saggi omogenei vs eterogenei </li></ul><ul><li>Saggi RadioImmunologici </li></ul><ul><li>ImmunoFluorescenza </li></ul><ul><li>Saggi Immuno Enzimatici (EIA) </li></ul><ul><li>- EMIT </li></ul><ul><li>- CEDIA </li></ul><ul><li>- ELISA </li></ul>Metodologie biochimiche > Outline
  33. 33. Saggi Immunologici (1) I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpi/antigeni che producono un segnale misurabile che può essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione 􀂄 􀂄 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
  34. 34. Saggi Immunologici (2) <ul><li>POTENZIALITA’ </li></ul><ul><li>Applicazione in tutte le aree del laboratorio </li></ul><ul><li>Estrema specificita’ del riconoscimento biologico </li></ul><ul><li>Buona sensibilità; larga gamma di prove </li></ul><ul><li>Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumenti </li></ul><ul><li>In molti casi non c'è bisogno di preparazione del campione </li></ul><ul><li>Efficiente </li></ul><ul><li>Economico </li></ul>
  35. 35. Saggi Immunologici (3) <ul><li>LIMITI </li></ul><ul><li>􀂄 A seconda del reagente, potrebbe avere un intervallo dinamico limitato </li></ul><ul><li>􀂄 Reazione crociata e specificità </li></ul><ul><li>􀂄 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati </li></ul><ul><li>􀂄 Interpretazione ed elaborazione dei risultati </li></ul>
  36. 36. Saggi Immunologici (4) SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantità limitata di anticorpi
  37. 37. Saggi Immunologici (5) SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI Nei metodi non competitivi, la mistura di reazione comprende un eccesso di anticorpi marcati, in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legati. La quantità di complesso antigeni-anticorpi è quindi misurato per determinare la quantità di farmaco presente nel campione.
  38. 38. Saggi Immunologici (6) SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
  39. 39. Saggi Immunologici (7) SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggi immunologici eterogenei richiedono la separazione dei componenti legati e non legati (p.e. ELISA) Nei saggi immunologici omogenei la reazione legante è misurata &quot;sul posto&quot; senza la separazione dei componenti della reazione.
  40. 40. Saggi RadioImmunologici (RIA) (1) RIA usa un marcatore radioattivo (normalmente 125I, 3H o 14C), che emette radiazioni che possono essere misurate da un contatore gamma o beta 􀂄 Negli anni passati la tendenza è stata di allontanarsi dal RIA e muoversi verso tecniche non isotopiche
  41. 41. ImmunoFluorescenza (1) L’immunofluorescenza è una delle tecniche più usate tra le reazioni sierologiche, di fondamentale importanza in microbiologia, per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) è variamente legata ad un marcatore. Il marcatore è un fluorocromo, ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile. Il fluorocromo più impiegato è l’isotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti, dunque con l’ausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta, emette luce verde.
  42. 42. ImmunoFluorescenza (2) ImmunoFluorescenza DIRETTA
  43. 43. ImmunoFluorescenza (3) ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
  44. 44. Saggi Immuno Enzimatici (EIA) Per fornire un segnale misurabile, i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) e galattosidasi-B. Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento, formazione di substrato colorato …
  45. 45. Saggi Immuno Enzimatici (1) L’analita nel campione ed l’analita marcato con G6PD competono per siti peptidilici dello specifico anticorpo Il legame inibisce l'attività dell'enzima, mentre enzimi liberi restano liberi di interagire con il substrato. SAGGI EMIT L'attività/assorbimento dell'enzima è direttamente proporzionale alla concentrazione di farmaco
  46. 46. Saggi Immuno Enzimatici (2) SAGGI CEDIA Frammenti di enzima dell'enzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio si riuniscono spontaneamente in soluzione per formare un enzima attivo Il farmaco del campione compete per siti peptidilici di anticorpi La concentrazione del farmaco è direttamente proporzionale all'attività dell'enzima
  47. 47. Saggi Immuno Enzimatici (3) SAGGI ELISA <ul><li>ELISA ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) , un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne è probabilmente affetto. </li></ul><ul><li>Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno, come ad esempio nei test per HIV. </li></ul><ul><li>Varianti del test ELISA: </li></ul><ul><li>ELISA COMPETITIVO </li></ul><ul><li>ELISA NON COMPETITIVO </li></ul><ul><li>- metodo diretto (DAS-ELISA) </li></ul><ul><li>- metodo indiretto. </li></ul>
  48. 48. Saggi Immuno Enzimatici (4) ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
  49. 49. Saggi Immuno Enzimatici (4) ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
  50. 50. Saggi Immuno Enzimatici (5) ELISA COMPETITIVO
  51. 51. <ul><li> Biosensori: </li></ul><ul><ul><ul><li>definizione </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>settori di applicazione </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>elementi sensibili </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>principi di trasduzione </li></ul></ul></ul><ul><li>Esempi di Biosensori </li></ul><ul><li>Funzionalizzazione di superficie </li></ul><ul><li>Caso di studio: Biosensori a base MicroCantilever </li></ul>Biosensori > Outline
  52. 52. Biosensori - DEFINIZIONE Definizione IUPAC: &quot;un biosensore è un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive, o tessuti, o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi l'informazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi, in un segnale utile analiticamente. L'interazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) è alla base del corretto funzionamento di un biosensore&quot;.
  53. 53. Biosensori - DEFINIZIONE
  54. 54. Biosensori Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)? • un’ alta selettività , frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale, basata sul riconoscimento di forma specifica • un’ alta sensibilità , fino alle parti per miliardo (ppb)
  55. 55. Biosensori Svantaggi • Perdita delle funzionalità nel tempo; • Il tessuto biologico è fortemente influenzato dalla temperatura e dal pH (forza ionica, parti acide/basiche); • La forza ionica modifica il sito recettore; • Il tempo di vita del sensore è breve • Il tempo di risposta è determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento).
  56. 56. Biosensori – PRINCIPI DI RILEVAMENTO
  57. 57. Biosensori – ELEMENTI BIO-SENSIBILI Vi sono due classi di processi bioricognitivi, che si differenziano per il metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore: • Riconoscimento bioaffine: il trasduttore percepisce il legame fra recettore e ligando per dimensione / forma (es.: reazioni anticorpo-antigene); • Riconoscimento biometabolico: il trasduttore percepisce le alterazioni chimiche dovute alla reazione, come cambi della concentrazione dei prodotti e dei reagenti, o come calore specifico di reazione (es.: reazioni enzima-substrato).
  58. 58. Biosensori – PRINCIPI DI RILEVAMENTO <ul><li>Acustici </li></ul><ul><li>Ampiezza e fase di un’onda </li></ul><ul><li>Spettro </li></ul><ul><li>Velocità dell’onda </li></ul><ul><li>Biologici </li></ul><ul><li>Biomassa (tipo, concentrazione) </li></ul><ul><li>Chimici </li></ul><ul><li>Componenti, concentrazione </li></ul><ul><li>Magnetici </li></ul><ul><li>Ampiezza e fase campo magn. </li></ul><ul><li>Conducibilità </li></ul><ul><li>Permittività </li></ul><ul><li>Ottici </li></ul><ul><li>Ampiezza e fase di un’onda </li></ul><ul><li>Velocità dell’onda </li></ul><ul><li>Indice di rifrazione </li></ul><ul><li>Emissività, riflettività </li></ul><ul><li>Meccanici </li></ul><ul><li>Posizione (lineare, angolare) </li></ul><ul><li>Accelerazione </li></ul><ul><li>Forza </li></ul><ul><li>Sforzo/tensione (Stress), pressione </li></ul><ul><li>Deformazione (Strain) </li></ul><ul><li>Massa, densità </li></ul><ul><li>Momento, torsione </li></ul><ul><li>Velocità di flusso, rate di massa </li></ul><ul><li>Forma, ruvidezza </li></ul><ul><li>Rigidità, cedevolezza </li></ul><ul><li>Viscosità </li></ul><ul><li>Cristallinità, struttura </li></ul><ul><li>Radiazione </li></ul><ul><li>Tipo </li></ul><ul><li>Energia </li></ul><ul><li>Intensità </li></ul><ul><li>Termici </li></ul><ul><li>Temperatura </li></ul><ul><li>Flusso </li></ul><ul><li>Calore specifico </li></ul><ul><li>Conducibilità termica </li></ul>
  59. 59. Biosensori - APPLICAZIONI
  60. 60. Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE Microbiology Nanotechnology Microelectronic processing Pubblicazioni (%) Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
  61. 61. Biosensori – PRINCIPI DI RILEVAMENTO DIAGNOSTICA BIOMEDICA 􀁺 Doctors increasingly rely on testing 􀁺 Needs: rapid, cheap, and “low tech” 􀁺 Done by technicians or patients 􀁺 Some needs for in-vivo operation, with feedback Glucose-based on glucose oxidase Cholesterol - based on cholesterol oxidase Antigen-antibody sensors - toxic substances, pathogenic bacteria Small molecules and ions in living things: H+, K+, Na+, NO, CO2, H2O2 DNA hybridization, sequencing, mutants and damage
  62. 62. Biosensori – CARATTERISTICHE <ul><li>LINEARITA’: Maximum linear value of the sensor </li></ul><ul><li>calibration curve. Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration. </li></ul><ul><li>2. SENSIBILITA’: The value of the electrode response per substrate concentration. </li></ul><ul><li>3. SELETTIVITA’: Interference of chemicals must be </li></ul><ul><li>minimised for obtaining the correct result. </li></ul><ul><li>4. TEMPO DI RISPOSTA: The necessary time for having 95% of the response. </li></ul>
  63. 63. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
  64. 64. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 2) Intrappolamento tramite matrice La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel). Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore, per via dell’interazione con la matrice, ed un tempo di vita utile di 3/4 settimane.
  65. 65. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 3) Intrappolamento per adsorbimento Si basa sull’interazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals, legami idrogeno e legami ionici. Essendo queste interazioni deboli è difficile quantificare la risposta, e il tempo di vita utile è di solo un giorno. Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura, del pH e della concentrazione ionica.
  66. 66. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 4) Intrappolamento mediante legami covalenti Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore, che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile:3/14 mesi). Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalità.
  67. 67. Biosensori – PRINCIPI DI RILEVAMENTO <ul><li>Rilevamento - esempi </li></ul><ul><li>Ottico </li></ul><ul><ul><ul><li>Surface Plasmon Resonance (SPR) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Elettrochimico </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Potenziometrici </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Amperometrici </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Impedimetrici </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Meccanico </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Misura frequenza e/o stress superficiale (MC) </li></ul></ul></ul>
  68. 68. Biosensori – SPR Surface Plasmon Resonance (SPR) Principio: Alla base vi e’ il riconoscimento specifico tra due macromolecole (es. Ab-Ag). Il legame tra le due molecole provoca un cambiamento dell’indice di rifrazione del mezzo su cui e’ legato l’elemento sensibile. Questo cambiamento e’ valutabile dalla variazione dell’indice di rifrazione del mezzo
  69. 69. Biosensori <ul><li>Elettrochimico </li></ul><ul><li>BIOSENSING </li></ul><ul><li>Basato sull’uso di enzimi specifici per l’analita di interesse. </li></ul><ul><li>TRASDUTTORE </li></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Potenziometrici </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Amperometrici </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Sensori Impedimetrici </li></ul></ul></ul>
  70. 70. Biosensori Elettrochimico substrato prodotti ENZIMI Voltaggio Misura della corrente > proporzionale alla concentrazione del substrato
  71. 71. Biosensori Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
  72. 72. Detection of Angiogenic Growth Factor by Microcantilever Biosensors Riccardo Castagna LATEMAR Unit - Politecnico di Torino Italy
  73. 73. Biosensori - Cantilever <ul><li>Modello biologico - target analyte </li></ul><ul><li>Trasduttore - teoria </li></ul><ul><li>Experimental set up </li></ul><ul><li>Misure preliminari (sensibilita’ e selettivita’) </li></ul><ul><li>Ripetibilita’ </li></ul><ul><li>Versatilita’ </li></ul><ul><li>Implementazioni </li></ul>OBIETTIVO/PRESUPPOSTI PROOF OF PRINCIPLE “ REAL STRATEGY”
  74. 74. Biological Background <ul><li>Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors. </li></ul><ul><li>Angiogenesis is a critical component of several human diseases, including cancer, diabetic microvascular and rheumatic diseases, psoriasis, hemangioblastoma, and ischemia </li></ul><ul><li>( Folkman, Nat Rev Drug Discov, 2007 ). </li></ul>Spannuth WA et al. (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
  75. 75. Biological Background Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) . Among these, vascular endothelial ( VEGF-A 165 ) and angiopoietin-1 ( ANG-1 ) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation, survival, proliferation and migration of EC Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system In the same cell type the same receptor induces different responces. To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques. So, there is a demand of quantitative data
  76. 76. MC beam dynamics in vacuum To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq. of motion : Mass adsorption effect : Q factor k constant and “small” dm: Different contributions: Q i : ambient, TED, clamping, internal friction, surface, etc…
  77. 77. Experimental set-up <ul><li>Temperature stability 0.05 °C </li></ul><ul><li>Min pressure: 1E-05 Torr </li></ul><ul><li>Piezo-electrical actuation </li></ul><ul><li>Optical lever read-out: PSD/ lock-in </li></ul><ul><li>The measurement is controlled in a Labview ® environment </li></ul>Reproducibility and repeatability in vacuum < 0.2Hz (1st mode)
  78. 78. Experimental procedure <ul><li>Thermal oxidation </li></ul><ul><li>Silanization (APTES) </li></ul><ul><li>Glutaraldehyde </li></ul><ul><li>Protein A/G </li></ul><ul><li>Antibody/Receptor </li></ul><ul><li>Antigen (ANG 1) </li></ul>SURFACE FUNCTIONALIZATION SENSING PROTEIN BINDING TARGET ANALYTE
  79. 79. Surface Activation Condensation: T=60°C, 1% v/v in anhydrous toluene, t =7’ Dry, 1100°C, t = 3 h, thickness 190 nm; then dipping in “piranha” solution to obtain OH groups on the surface Stabilization of the imine (Shiff’s base) formed through sodium cyanoborohydride buffer (NaBH 3 CN); RT, t = 45’ Si thermal oxidation Si/SiO 2 Si silanization (APTES) ( CH 2 ) 3 NH 2 + Si (CH 2 ) 3 N= CH-(CH 2 ) 3 -CHO Si (CH 2 ) 3 NH- CH 2 -(CH 2 ) 3 -CHO Glutaraldehyde (1% v/v, pH = 8.5; RT, t =15’) OCH-(CH 2 ) 3 -CHO Reduced specie NaBH 3 CN
  80. 80. Protein binding Antibody (Ab) Antigen (Ag) + CHO Protein A or G NH 2 + <ul><li>30’ in pure PBS, RT </li></ul><ul><li>Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h, RT) </li></ul><ul><li>Rinsing in pure BPS ( t =30’, RT) and DI water (15’, RT) to remove salts </li></ul><ul><li>Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS ( t =1 h, RT) </li></ul><ul><li>Rinsing in pure PBS ( t =30’, RT) and DI water ( t =15’, RT) to remove salts </li></ul><ul><li>Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS ( t =1 h, RT) </li></ul><ul><li>Rinsing in pure PBS (30’, RT) and DI water ( t =15’, RT) to remove salts </li></ul>(CH 2 ) 3 NH - - CH=N - CH 2 - - NH - - CHO - CH 2 - (CH 2 ) 3 - (CH 2 ) 3 NH - - CH=N - CH 2 - -
  81. 81. “ Proof of concept” and “real” strategies “ Real system” Probe : Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody) Target : Ang-1 (56 kDa) An approach to be used for different Ab/Ag “ Proof” system Probe :Tie2-Fc (165 kDa) (fusion protein) Target : angiopoietin human protein (56 kDa) Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
  82. 82. Ligand mass as low as some tens of picograms were detected Using different cantilever geometries and operation modes, it is possible to detect different quantity of adsorbed masses, always keeping a similar surface density of the species. Thus, a good reproducibility of all experimental steps is achieved “ Proof of concept” experimental results (1) M1 600x100x2 μm 3 Frequency shift for each experimental step
  83. 83. Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation In order to test the system specificity, cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule  only non-specific binding can be present in such experiment M1 800x100x2 μm 3 “ Proof of concept” experimental results (2) Buffer effect
  84. 84. Frequency shift for each experimental step Anti-ANG-1 Surf. Density: 2x10 12 molecules/cm 2 ANG-1 Surf. Density: 14x10 12 molecules/cm 2 [Gupta et al. PNAS 2006: 1,2x10 12 molec/cm 2 ] “ Real strategy” experimental results (1) M1 670x70x1.9 μm 3 M2 670x70x1.9 μm 3
  85. 85. “ Real strategy” experimental results (2) Selectivity tests VEGF-A 165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens Nearly perfect selectivity M1 470x50x2.31 μm 3 M1 470x60x2.31 μm 3
  86. 86. <ul><li>Liquid measurement advantages: </li></ul><ul><li>Physiological structure and function of molecules </li></ul><ul><li>Real-time and kinetics measurement </li></ul><ul><li>Reduction of salt residuals </li></ul>Integration with LOC instead of fluid cell advantages: reduction reagent, cost efficient, portability, restricted dimension tolerance, bench production... Liquid Measurements: LOC integration
  87. 87. E.B. Eq in conjunction with N.S. Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected): [Maali JAP 2005]; [Sader JAP 98] Liquid Measurements: MC beam dynamics From theoretical model and FE analysis: SOI device Layer: 7 μ m Aspect ratio: 1.5-3 is the added mass per unit length is damping coefficient per unit length
  88. 88. Liquid Measurements: Preliminary results Liquid priliminary measurements are performed in PBS. Real time detection: 4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decrese. The binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results ( Carl A. K. Borrebaeck, Bio/Technology 1992)
  89. 89. Conclusions <ul><li>Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum. Data analysis demonstrate high sensitivity, measure specificity and reproducibility </li></ul><ul><li>Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels </li></ul>Future Works <ul><li>Automatic and continuous measurement (data storage and fit) </li></ul><ul><li>Development of an alternative actuation </li></ul><ul><li>Kinetics </li></ul><ul><li>Q-enhancement circuit </li></ul><ul><li>In plasma measurements </li></ul>
  90. 90. IP1 IP2 70 140 210 280 Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210 Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1) 75 KDa 50 KDa Depletion of Albumin Component (DAC) MW Plasma1X 2X 1 2 3 [ Colantonio Proteomics 2005 ] IP1 IP2 70 140 210 280 PLASMA depleted + ANG1 SAMPLE PREPARATION: clarification of PLASMA (Murin Model) Albumin (ug) PLASMA + ANG1 rh - ANG1 (ng) rh - ANG1 (ng) rh - ANG1 (ng) Future works: measurements in plasma
  91. 91. Acknowledgments L. Napione, F. Bussolino Institute for Cancer Research and Treatment, Candiolo Torino C. Ricciardi, G. Canavese, G.Digregorio, I.Ferrante, S.Fiorilli, S.Marasso, A.Ricci, F. Pirri LATEMAR Unit - Politecnico di Torino

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