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國 立 成 功 大 學
  奈米科技暨微系統工程研究所
       碩士論文



利用面型微加工製作單細胞生物晶片平台


 Using Surface Micromachining Implement
       Single Cell...
摘要

  膜片箝制(Patch Clamp)技術,是電生理學中研究離子通道機制最成熟完

備的一項工具,傳統膜片箝制方式是使用玻璃吸管(pipette)移動到要紀錄的

細胞上。此方式可得到正確且精準的資訊,但卻需要純熟的操作技術,且相

當...
Abstract

     Patch clamp is a well-developed electrophysiological recording technique

used to study ion channel functio...
Keywords:MEMS、Electrophysiology、Patch Clamp、Ion Channel




                              III
當我在看別人的論文時,見到其他人所寫的致謝,第一句話都

是:要感謝的人真的太多了,不知道該從何下手。此時心裡都會想,

有那麼嚴重嗎?眼看著研究生的兩年生涯就要過去,當這篇論文一字

一字出現,記憶也隨著一幕一幕浮現,此刻終於體會,到頭來我的...
生物晶片團隊宗閔學長,您給的幫助實在太多太多,無私地與我交流

各種製程心得,遇到瓶頸時也為我指引明燈,百忙之中仍抽時間修正

此論文的眾多錯誤,我能畢業說是您的功勞真是一點都不為過了,感

謝偉松學長常常我在最困難時伸出援手,像當我在論文撰寫...
讓,給我省去了許多在南科和成大之間奔波的時間。

  感謝陳國聲老師實驗室的歐弟學長和所有跑跑團成員,修銘學

長、嘉良、莞慈、黑人、延彰、聖傑、迪隆、後浪、阿彭、辰軒、澇

練,當我做研究到精神不濟的時候,你們都會挺身出來一起運動,繞

個幾...
目錄

摘要      .................................................................................................................
2.3.3     開放細胞吸附膜內面向外式...........................................41
   2.3.4     傳統全細胞模式.....................................
第四章 晶片製程與討論
 4.1 RCA clean ................................................................................75
 4.2 氧化 .......
附錄 C   微影製程       ..................................................................121

附錄 D   濕式蝕刻        .................
圖目錄
圖 1.1    微小陣列透鏡的 SEM 圖 透鏡直徑 100μm 透鏡間距 15μm .........7
                                        ,                      ...
圖 1.35    側向鉗制晶片工作示意圖................................................................26
圖 1.36    側向鉗制晶片上視圖 .................
圖 4.4 包覆上鐵氟龍的不繡鋼絲載台 .....................................................82
圖 4.5 四吋玻璃檔片.....................................
圖 4.29-(a) 第二次 BOE 潤飾並微縮孔洞之晶片平台 .............................99
圖 4.29-(b) 第二次 BOE 潤飾並微縮之孔洞 .................................
第一章 緒論
1.1 前言

   微機電系統(micro-electro-mechanical system,簡稱 MEMS)在歐洲被

稱為微系統科技(Micro system technology)。著名的費曼博士(1965 年諾貝

爾...
術常常密不可分,如薄膜沉積、微影與蝕刻技術,可是微機電系統的發

展雖然是搭著半導體製程設備與技術的便車,但由於在性能及結構上的

要求已不同於積體電路,所以也逐步發展出不同的製造技術。與標準的

積體電路結構相比,微機電元件的結構特徵有:三維...
術,都是微機電製程中特有的技術。也由於微機電元件常有中空或懸浮

式結構,微元件及微系統所需的封裝技術,也就常不同於電子元件已發

展相當成熟的封裝技術,目前仍處於發展中的階段。



(4)多元性材料:

   比較早的微積電元件的結構中多是...
在微機電產品邁入商品化時,從成本以及技術成熟度考量,自然最

好是利用現有的半導體製程技術,但從功能性考量,單單半導體製程技

術無法滿足所求時,常需要為特定產品額外建立新的生產線。另一方面,

現在也有越來越多的微機電製程代工廠設立,嘗試建立...
理,再送訊號至使安全氣囊膨脹的致動機構,啟動氣囊以保護車上的人

員。



   一般對微機電系統所期待的特性以及優點可大致分為下列幾項:

(1)微小化:省材料、省空間、低耗能、高性能、方便攜帶。

(2)多工化:藉由整合各種不同的微元件,...
2000 年十大應用領域       2005 年十大應用領域

汽車             26 % 光開關           24 %

工業設備           15 % 投影系統          15 %

噴墨印表頭    ...
雖然現在市場上微機電元件或是系統成熟的商品並不多,而且各界

對微機電這個領域在未來的市場發展分析也不盡然相同,但是可以確定

的是微機電事實上是個發展中的產業,還有許多可能的應用仍然在探索

中,當微機電的知識與技術隨著時間逐漸地演進,在研發...
圖 1.3 二氧化矽材質之微噴嘴 [3]




圖 1.4 利用 SU-8 光阻所製作的微流道 [4]




 圖1.5 打線封裝後之微壓力計晶片 [5]



            -8-
圖 1.6 微陀螺儀 [6]




   圖 1.7 微加速度計 [7]




圖 1.8 三種不同的氧氣感測器 [8]




         -9-
圖 1.9 微馬達 [9]




圖 1.10 微幫浦 [10]




圖 1.11 微開關 [11]



     - 10 -
1.4 細胞動作電位簡介

   無論在臨床上或是在實驗室中對各種病理的研究來說,利用建立各

種不同的動物或是細胞模型來討論致病的機制,來研究疾病的成因以及

其治療方法,已經是非常一般且常用的模式了,因此,為了建立完整的

細胞模型,必須想...
1.5 膜片鉗簡介

  膜片箝技術是一種,以紀錄通過離子通道的離子電流,來反應細胞

膜上單一個或是多個的離子通道分子活動的技術,該技術可將微電極尖

端所吸附的一至數平方微米面積的細胞膜的電位固定在同一個水準,對

通過離子通道的微小離子做...
1.6 文獻回顧

1.6.1 離子通道的發展

  在 1890 年時,世界上的第一個物理化學家奧斯華 瓦爾德(Wilhelm

Ostwald,1909 年諾貝爾化學獎得主)就認為在活體組織中所量到的電流

訊號,應該是來自於離子穿透過細胞...
主)和Bert Sakmann(1991年的諾貝爾醫學獎得主)他們在實驗中使用微細

之玻璃電極緊密地吸附著肌細胞膜,並精確測量到離子通過細胞膜時産

生十分微弱的電流,在實驗中,他們利用與離子通道直徑近似的鈉離子

或氯離子,並在最後達成共識...
高的興趣,並開始了這方面的研究。他自承“我的研究生涯從 30 歲才開

始”,不過他的研究卻快速的起飛。由於體認到要了解離子通道如何運

作,必須要有更好而且更高解析度的結構圖像,他決定從最基本的 X 射

線結晶學開始學起,在短短的數年之後,...
圖 1.12 離子通道的晶體結構[15]




          圖 1.13 鈉、鉀離子通過離子通道的示意圖[15]




1.6.2 微機電整合膜片鉗的發展

  2001年,德國Ludwig-Maximilians-Universi...
圖 1.14 在玻璃基板背後以氫氟酸蝕刻出一個凹槽[16]




     圖 1.15 定義出金的蝕刻罩幕[16]




      圖 1.16 蝕刻完畢的孔洞[16]



             - 17 -
2002 年,丹麥的Sophion公司發表APATCHI-1,為全球第一台自動

以玻璃吸管電極為系統的商業化膜片箝制紀錄系統[17]。

   2002 年,德國慕尼黑大學(Munich University)的奈米科學中心(Center

...
2002 年 , 耶 魯 (Yale) 大 學 的 Kathryn 的 團 隊 利 用

PDMS(Polydimethysiloxane)取代玻璃管製造出模片鉗晶片,圖1.19,使量

測過程更符合巨歐姆阻抗封接(Gigaomh Seal)與...
圖1.20 PDMS模片鉗晶片之工作示意圖[19]


    2002年,瑞士聯邦科技學院(Swiss Federal Institute of Technology)微

電子系統所(Institute of Microelectronic...
2003 年,日本立命館大學與松下電子合作的Masato TANABE 團隊

製作一MCA (Micro Channel Array)結構,圖1.22,可用其陣列電極來偵測

細胞[21]。




            圖1.22 陣列電...
2003年,德國Cytocentrics CCS公司研發了CytoPatch晶片,利用聚焦

離子束在石英玻璃(quartz)上做出了玻璃微電極型態的膜片鉗,圖1.25到

圖1.26。[23]




                   圖...
圖1.27 3μm之微孔[24]




                       圖1.28 2.5μm之微孔[24]


圖1.30 微縮孔洞之晶片製程圖[24]




                       圖1.29 1μm...
2003年,在國際微機電與奈米自動化系統研討會上,發表了一篇利

用兩片矽晶圓結合做出來的膜片鉗,晶圓一:利用氮化矽作為蝕刻罩幕,

再以氫氧化鉀蝕刻穿矽晶圓;晶圓二,利用1μm之二氧化矽當作蝕刻停止

層,以乾蝕刻至此層停止後再將二氧化矽薄膜...
2004年,美國加州大學奈米系統所,利用ICP進行體型微加工(bulk

micromachining),製造出約2μm大小的孔洞,再以電槳輔助化學氣相沈積

(Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition...
2004年,美國柏克萊之感應器與制動器中心(Berkeley Sensor and

Actuator Center)的J.Seo團隊利用玻璃基材與PDMS做出開孔在水平方向

的微結構,以側向的孔洞做膜片箝制,並聲稱此結構可以降低量測時的

...
2006年,美國柏克萊的Adrian Y. Lau,Paul J. Hung等人改進了上一

個晶片,將開孔的位置提高,使得細胞膜被鉗制的位置較佳,圖1.38到圖

1.40。[28]




               圖1.38 新側向鉗...
2006年,美國加州大學Brian Matthews等人改進了他們在2003年所製

作的晶片,將BOSCH ICP製程過的微孔洞,利用先進行濕式氧化再以氫

佛酸去除氧化層的方式使得微孔洞管璧更平滑(smooth),如圖1.41。[29]

...
2006年,法國Thomas Sorde等人利用PECVD將微孔洞縮小,針對

PECVD可能沉積的情況提出兩種模型,並明確以實驗數據指出再以

PECVDE縮小的微孔能提供更有效的隔離品質,圖1.42到圖1.43。[30]




     ...
2007年,日本的Z.L. Zhang團隊以矽晶絕緣體(SOI)晶圓,利用鑽石研

磨搭配濕式蝕刻將晶圓從底部掏空到晶圓的絕緣層處,再以聚焦離子束

從正面蝕刻出直徑大約0.5μm的孔洞,圖1.44。[31]




圖1.44 SOI晶圓膜片...
2007年,美國柏克萊之感應器與制動器中心在矽晶圓上沉積了低溫

氧化層(low temperature oxide,LTO)和金屬層搭配微影製程和聚焦離子束

蝕刻,製作出一個可以有4個量測電極的膜片鉗,圖1.45到圖1.48。[32]


...
圖1.47 LTO膜片鉗晶片上視圖[32]




圖1.48 LTO膜片鉗晶片孔洞SEM圖[32]




          - 32 -
1.7 研究動機

  離子通道的性質與細胞動作電位之間關係密不可分,目前如果我們

想要了解離子通道上電流的微細變化量,已經有模片箝技術的幫忙,但

非常可惜的是傳統膜片箝制技術在人工操作上卻需要相當純熟的技術,

才能將玻璃吸管精準地移動到...
的是可以將訊號擷取、放大甚至處理電路放置在晶片平台的附近,可以

增加訊號處理的速度,減少傳輸時產生的雜訊,更精準地觀察細胞動作

電位的變化。



(3)陣列化:

  在設計時,可以將晶片的位置以陣列化的形式分布,相對於傳統的玻

璃微電...
片鉗的微孔洞安置到會黏取細胞的位置上,雖然礙於實驗儀器不足還無

法對此晶片之巨阻抗封接情形做觀察,但從世界各地的研究文獻來看,

我們有足夠的信心相信其效能,只不過在製程上仍舊存些許小問題,使

整體的良率一直無法有效提高到五成以上,在產出數...
1.8 本文架構

  本文共分為六章,如圖 1.49 所示。第一章為簡介膜片鉗晶片與其重

要性,並包含了文獻回顧與研究動機。第二章則介紹傳統上利用玻璃微

電極來對細胞做膜片鉗制量測時的方法、理論以及操作方式。第三章介

紹了本實驗室先前所...
第二章 膜片鉗制
2.1 前言

   1976 年,Neher 和 Sakmann 建立了膜片鉗技術(patch clamp recording

technique),這是一種以紀錄通過離子通道的離子電流來反應細胞膜上單

一的或是多數的離...
電流)達到最小,因此橫跨膜片的電流可以幾乎看成100%來自於玻璃微電

極的紀錄電流,而將信號取出來,圖2.1。




                     圖2.1 膜片鉗制原理圖


   圖2.1中Rs是與膜片阻抗相串聯的局部串聯電...
立了膜內面向外式(Inside-out)和膜外面向外式(Outside-out),近代又分別

建立了開放的細胞吸附式膜內面向外(Open cell-attached inside-out mode)

和穿孔囊泡膜外面向外式(Perforat...
清楚膜片上的實際電位,此外,另一個缺點是即使在溶液中加入刺激性

的物質,也不能到達與電極內液接觸的膜片的細胞外面,相對的,如果

膜片離子通道對於溶液中的刺激性物質有反應,則可以說明這種刺激性

物質是透過某些細胞內其他信號的傳導而間接引起的...
2.3.3 開放細胞吸附膜內面向外式(Open cell-attached mode)

   將上述細胞吸附式的膜片以外某部份的細胞膜進行機械性破壞,經

由被破壞處的孔洞來調控細胞內液,並且在細胞吸附狀態下進行膜內面

向外式的單一離子通道...
2.3.5 膜外面向外式(Outside-out mode)

    將上述的全細胞模式,將玻璃微電極向上提起可得到切割分離的膜

片,由於它的細胞膜內側,面對著玻璃微電極腔內液,而細胞膜外側面

朝外且會自然封閉,所以這個模式被稱為膜外面向...
2.3.7 穿孔囊泡膜外面向外式(Perforated vesicle outside-out mode)

   以上述的穿孔膜片式將玻璃微電極向上提起,之後膜內面向外式的

膜片斷端會融合封閉,因此在微電極的尖端處就形成了一個囊泡膜,如

...
(dual gap)從細胞外進行記錄,但是這兩種方法只適用於非常大的細胞,

反觀膜片鉗技術,對於一般較小的細胞也能在電位固定的條件下紀錄出

膜電流,這也是膜片鉗方法的一個很大的優點,此外膜片鉗技術還可以

直接地控制細胞內環境的優點,而對於...
圖 2.3 ㄧ次拉致與二次拉致的玻璃微電極比較




2.5.1.2 塗矽酮樹脂(Sylgard coating)

   在極短的時間內,欲記錄高頻開閉現象的單一離子通道小電流時,

背景的雜訊除了熱雜訊和封接阻抗雜訊外,最成問題的是從浸在...
圖 2.4 玻璃微電極塗上矽酮樹酯的電容模型




2.5.1.3 熱拋光(heat polish)

    在顯微鏡觀察下,將微電極尖端接近熱源,如通電加熱的白金絲等,

進行熱拋光處理可以提高巨阻抗封接的成功率,這是因為經過熱拋光處

...
阻抗封接形成的粒子(particle) 通常將一次性注射器的過濾膜(孔徑 0.2μm)
                  ,

裝在注射器內使用來取得電解液,而充灌的方法很多,在微電極尖端較

粗的情況下,用注射針或聚乙烯的細塑料管直接從電極...
將玻璃微電極浸入溶液中,然後給其施加一個正壓,可以利用電極內

液和浴液液面差產生之靜水壓來施加,以防止氣液介面上沈降的灰塵或

是溶液中的粒子附著在電極尖端而妨礙巨阻抗封接的形成,接著使電極

接近細胞(還不用接觸到細胞)按下放大器的 Res...
的”C-FAST”和”r-FAST”旋鈕即可補償(補償方法將在後面敘述) 在電路上
                                   ,

消除,另外,此寄生電容和浸在溶液中的玻璃微電極表面積成正比,也

就是說,若是盡量減...
如 果 將 膜 片 鉗 放 大 器 的 記 錄 模 式 轉 換 為 ”CC(Current Clamp)

MODE”,則可以記錄在電流鉗制模式下的細胞內電位,將模式設定

為”CC+COMM MODE”時,可以進行電刺激並可以誘發和記錄動作電...
2.5.5 制真菌素(nystatin)穿孔膜片鉗法

     緩慢全細胞記錄(slow whole-cell recording)法是一種旨在克服傳統全

細胞模式中胞質漏滲的問題而設計的技巧,然而在技術上還是有存在一

些缺點,制真菌素用...
處理可以得到總電荷值 q ,而 q 會與 V0Cm 相等因此求出 Cm 值,假如

Rm>>Rs 的條件成立並且在玻璃微電極施加一個三角波,且波形為V=βt

時則應變電流方程式成為式 2-2


            V         d...
2.6.2 相位敏感性檢測法(phase-sensitive detection method,PSD method)

   假如 Rm>>Rs,則輸入的高頻交流訊號在疊加之後,電阻性電流和電

容性電流之間有 90 度的相位差,對此可以利用...
入浴液中的玻璃表面積成正比,所以應盡量縮短浸入電極的長度,此外,

由於微電極電容與玻璃的導電性成正比而與玻璃壁的厚度成反比,使用

硬質的厚壁玻璃較適當,此外再塗上矽酮樹酯的方法可以使Cp大幅減小。

  採取了以上措施減少Cp後,殘餘的部分...
2.7.2 緩慢電容電流補償(Slow capacitative compensation)

   在全細胞模式時,膜電容Cm由於局部串聯電阻(Series resistance,Rs)

的傳導而充電,因而發生了新的緩慢電容性電流,這時與C...
2.7.3 局部串聯電阻電流補償(Series resistance compensation)

   局部串聯電阻(Rs)是從測量對象的細胞膜以外部份所產生之阻抗,主

要是由玻璃電極和膜片碎片所產生的,此Rs如果和從RsCm所產生的緩慢
...
第三章 晶片設計


  本文中的目的除了著重於能使用微機電製程將此膜片鉗晶片實現之

外,更進一步的希望能透過實驗的參數設計與測試,藉以得到穩定的製

作流程,使得本文所製作出來的晶片除了能達成之前所設計製作的功

能,甚至更優越,又再考慮到...
步驟一:晶圓清洗




                525um




步驟二:微影




步驟三:RIE蝕刻




步驟四:成長二氧化矽1μm




       - 58 -
步驟五:微影




步驟六:BOE濕蝕刻




步驟七:TMAH濕蝕刻




步驟八:BOE濕蝕刻




      - 59 -
步驟九:微影




        步驟十:BOSCH ICP




        步驟十一:二氧化矽成長




        圖3.1 先前的晶片製程圖


 此晶片製作流程比較可能出現問題的步驟為步驟三、四、五,實驗

再現性會較...
能再做改進。

  步驟三到步驟四是晶片平台的微影與RIE蝕刻,此兩個流程本身沒有

問題,但是到了步驟七TMAH蝕刻之後就可能會出現瑕疵,因為RIE蝕刻

之後的Wafer表面就會比較不平整,而經過步驟四再成長氧化層,很可能

會使得氧化層的...
了會形變之外,也會發生位移的情況,所以接下來以BOE開出來的背面

蝕刻孔,相對於晶片正面的平台不一定能夠處於非常正確的位置,有很

大的機率會錯位,也因為這樣,此晶片設計在完成TMAH蝕刻之後,蝕

刻停止面之矩形必須控制在50μm×50μm...
以拿捏確切的蝕刻深度,而本文的解決策略為改變製程材料,使TMAH

蝕刻終止點會出現在兩不同材料之間的介面,可以非常明確,濕蝕刻結

束後的薄膜厚度也能精確的控制。

  針對以上所有問題的詳細改進策略與實驗安排,將在後面的文章中

再進行敘述...
數十奈米的程度是輕而易舉的,因此在後續ICP製程中蝕刻的深寬比參數

設計,則也能夠相對明確。

(3)材料本身透明:

   若是結構薄膜為透明的話,在到達濕蝕刻終止點時,會發現晶片上

面出現陣列狀的透光點,可以根本不需要再用顯微鏡觀察,以...
均分布在一平方公分之內,此光罩設計的目的是要定義出背面濕蝕刻開

孔的位置、大小以及形貌,本文中所設計的開孔的形狀為正方形,而其

邊長為 640μm,從理論上來說,若是按照計算,假設 Wafer 的厚度為

525μm,並且希望蝕刻到底部停止...
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  1. 1. 國 立 成 功 大 學 奈米科技暨微系統工程研究所 碩士論文 利用面型微加工製作單細胞生物晶片平台 Using Surface Micromachining Implement Single Cell Biochip Platform 研究生:盧彥池 指導教授:黃榮俊、羅錦興 中華民國九十六年六月
  2. 2. 摘要 膜片箝制(Patch Clamp)技術,是電生理學中研究離子通道機制最成熟完 備的一項工具,傳統膜片箝制方式是使用玻璃吸管(pipette)移動到要紀錄的 細胞上。此方式可得到正確且精準的資訊,但卻需要純熟的操作技術,且相 當耗費時間導致只能得到少量的紀錄資訊。電壓箝制(voltage clamp)則是一 種量測離子通道性質的方式 給予一定程度的電壓來記錄細胞膜間的離子電 , 流進出以及反應,藉此可觀測細胞的動作電位(action potential)變化的情形, 從而估算通道電容或電阻的參數。 此研究延續了本實驗室長久以來的成果 除了將用以取代傳統玻璃電極 , 的新式膜片鉗晶片製造出來,並對其效能加以改善,提升製程良率以及減低 製造成本,本研究中利用改變晶片的結構材料以及製造程序,再加上利用 BOE 潤飾微孔洞之製程,把此膜片鉗晶片之微孔洞能縮小到 1μm 以下的程 度,將能有效提高量測離子電流的準確性,而整體的結構層厚度能相當一致 地縮減到 7μm 以下,理論上,局部串聯電阻將可降低,其值也較穩定。另 外,製造上取消了需要昂貴專利的 BOSCH ICP 製程,並且以仿製面型微加 工的方式取代了精準度較差的體型微加工 在大量提高量率後製造成本也隨 , 之降低,使此晶片將來在學術以及市場上更具競爭潛力。 關鍵字:微機電、電生理、膜片鉗制、離子通道 I
  3. 3. Abstract Patch clamp is a well-developed electrophysiological recording technique used to study ion channel function and regulation. The conventional method of performing patch clamp technique employs a glass micropipette onto the cell by manual manipulation. Despite this technique is extremely sensitive and information-rich, but requires a highly-skilled operator and is limited in throughput. Voltage clamp that determine the behavior of the ion channel conductance responsible for the generation of the action potential is the another method to record the flow of ionic current across the cell membrane. The method is held a constant membrane potential while the ionic current flowing through the membrane is measured. This research continue the achievement of our laboratory. We not only replace traditional patch clamp of glass electrode by patch clamp chip, but also improve its efficacy, field and cost down. In this research we reduce the patch hole below 1μm using the method of changing structure material, process flow, and an additional process of BOE dipping. Then the accurate rate could be arised. By this we also reduce the whole structure thickness of the chip identically which can make local series resistance lower and stablely. Besides in the process we cancel the BOSCH ICP that has expensive patent cost, and replace bulk micromachining process by surface micromachining like process to raise filed, hence this chip would have much more competition potential. II
  4. 4. Keywords:MEMS、Electrophysiology、Patch Clamp、Ion Channel III
  5. 5. 當我在看別人的論文時,見到其他人所寫的致謝,第一句話都 是:要感謝的人真的太多了,不知道該從何下手。此時心裡都會想, 有那麼嚴重嗎?眼看著研究生的兩年生涯就要過去,當這篇論文一字 一字出現,記憶也隨著一幕一幕浮現,此刻終於體會,到頭來我的第 一句話還是必須說:真的,要感謝的人真的太多了,不知該從何下手。 不然最後我可能會被人笑說,為什麼致謝會寫的比論文本文還要長。 最感謝我的兩位指導老師,在大學物理系時期,黃榮俊老師就是 我的專題研究指導教授,當時老師很辛勤地帶領著一大票學生在高雄 大學與成功大學之間來回奔波,還不厭其煩的教導像我這種只有滿腔 熱血卻沒什麼專業的學生,在研究所時期更讓我自由地到電機系羅錦 興老師的實驗室中鑽研不一樣的學問,學生口試當天老師還從標竿計 畫的文件山中抽身過來參加,種種感動無法一一細數,但永遠謹記在 心。而如果說我這兩年研究生活是一部電影,片名絕對是春風化雨, 主角當然就是我永遠的羅賓威廉斯,羅錦興老師,感謝您在收留我之 後給了一個如此美好的研究方向與如此豐富的研究資源,在全新領域 中,無疑讓我開闊了許多視野,並且在學生實驗失敗或是犯錯時,還 都一貫地以極大胸襟包容,老師在各種不同領域中都有極高的修養, 您是我ㄧ輩子的榜樣。並感謝口試委員陳國聲老師、陳建良老師、鐘 宜彰老師對此論文所有指正與建議,讓我在論文撰寫技巧方面獲得了 長足進步,並親身體會到各種不同領域專家的想法。 感謝實驗室各大學長建中、宗閔、偉松、貞明、宗旗、浩賢、智 光、忠信、博源、志賢、建銘,有你們在,實驗室的所有夢想將一一 變成希望,你們總是用微笑帶著學弟們往正確的方向前進,特別感謝 IV
  6. 6. 生物晶片團隊宗閔學長,您給的幫助實在太多太多,無私地與我交流 各種製程心得,遇到瓶頸時也為我指引明燈,百忙之中仍抽時間修正 此論文的眾多錯誤,我能畢業說是您的功勞真是一點都不為過了,感 謝偉松學長常常我在最困難時伸出援手,像當我在論文撰寫與編排上 傷透腦筋,您就會傳授很多好用的技巧,希望我有天也能將那顆怪球 轉起來的技巧學起來。感謝實驗室的同學君婷、瓊安、人豪、嘉麟、 嘉玄、孟岳、偉禎、明柱,有大家互相扶持與勉勵,乏味的研究生活 也變的溫暖有趣,和你們之間快樂記憶點滴在心頭,謝謝學弟富耑以 及信宏,能在我實驗繁忙時給予適時幫助,也感謝其他學弟為實驗室 帶來許多熱鬧氣氛,特別是艾雲的千里之外演唱會真棒,感謝實驗室 助理們,青霞姐幫忙處理了很多複雜的帳,淑容姐總是很早就來實驗 室幫大家開門開冷氣,已經升上博班的富強哥還特地跑一趟幫忙載儀 器到南科,小白在我管實驗室零件時教了很多元件辨識的方法,並感 謝已經放下一切世俗的衣惟學長,在實驗室位置上您留下了兩樣東 西,一隻筆,要我繼續努力,一盞檯燈,照亮我的研究生活,之後它 們還是會繼續在那裡照顧學弟妹們。 感謝微奈米中心以及南科奈米元件實驗室的工作夥伴,有你們的 辛勤,各實驗機台才得以順利運轉,特別感謝工程師阿德,常幫我解 決實驗上的問題不說,在某個大家都已經回家Happy的星期五晚上, 還留下來幫我修機台趕實驗,令人難忘,感謝奈微所同學志昌、俊億 、家維、秋雯、浩凱、冠志、介芝、昶哥所給的各方面的意見與資源, 讓我所學更加豐富,感謝在無塵室一起做實驗的夥伴們,在根、彥希 以及特別要我註明他是害羞低調加內向的恭佑,有你們的幫助以及禮 V
  7. 7. 讓,給我省去了許多在南科和成大之間奔波的時間。 感謝陳國聲老師實驗室的歐弟學長和所有跑跑團成員,修銘學 長、嘉良、莞慈、黑人、延彰、聖傑、迪隆、後浪、阿彭、辰軒、澇 練,當我做研究到精神不濟的時候,你們都會挺身出來一起運動,繞 個幾圈之後,精神都來了,比喝蠻牛還有效,特別感謝一樣是奈微所 的志中同學,無論在修課、做實驗或是平日的生活,給了極大的助力, 你無疑是我研究生活中最佳的換帖兄弟,職場生活也再請多多關照。 感謝從大學到現在都是同學的彥彰,當完海軍陸戰隊之後還能保 有極佳審美觀,為此論文添得許多美美的圖片,感謝大學好友子桓、 秉宗、景穎,雖然已經少能聚一起吃飯,但你們偶爾的關心對我都是 莫大祝福,特別是宜家,過年過節都讓我去你家度假也就算了,為了 彌補我和鼎立造的孽還故意去抽金馬獎,深感佩服,感謝數學所的朋 友們,可安、老大、小璧、貞姊、小黃教練、小毛、志遠、嘉哲、珮 君、怡如、龍哥、威溢、賢哥,如果沒有你們提供那麼好的讀書氣氛, 還常陪我到有阿給的地方,在下一定半間研究所也上不了,感謝土木 系的小賓賓、伍佰、e-beam勳、志宏、奕仁、煙宏、小龜、瑋廷、志 青、維周、宣儀、佳蓮各位合作夥伴,迎新宿營有你們無條件幫忙, 我才能有如此無限美好回憶,並感謝我所有家教學生,你們任何一點 點進步,都給我莫大的成就感,但願各位往後的生活都能更順遂。 最後感謝我的阿公、阿嬤、爸爸、媽媽、哥哥,時時予以關懷和 支持,大恩不言謝,家人對我的關愛,我的感激只能一切盡在不言中, 感謝小綺,在我心情不好時,妳總盡所能地陪伴左右。 再次感謝所有幫助過我的人,並獻給你們最大的感激與祝福! VI
  8. 8. 目錄 摘要 ..............................................................................................................I Abstract ....................................................................................................II 致謝 ...........................................................................................................IV 目錄 .........................................................................................................VII 圖目錄 .....................................................................................................XI 表目錄 ..................................................................................................XIV 第一章 緒論 1.1 前言 ...........................................................................................1 1.2 微機電製程技術簡介 ...............................................................1 1.3 微機電元件與應用 .................................................................. 4 1.4 細胞動作電位簡介....................................................................11 1.5 膜片鉗簡介................................................................................12 1.6 文獻回顧 ..................................................................................13 1.6.1 離子通道的發展...............................................................13 1.6.2 微機電整合膜片鉗的發展...............................................16 1.7 研究動機....................................................................................33 1.8 本文架構 ..................................................................................36 第二章 膜片鉗制 2.1 前言............................................................................................37 2.2 膜片鉗技術的原理與操作 ......................................................37 2.3 膜片鉗制的各種模式................................................................38 2.3.1 細胞吸附式.......................................................................39 2.3.2 膜內面向外式 .................................................................40 VII
  9. 9. 2.3.3 開放細胞吸附膜內面向外式...........................................41 2.3.4 傳統全細胞模式...............................................................41 2.3.5 膜外面向外式...................................................................42 2.3.6 穿孔膜片式或緩慢全細胞式...........................................42 2.3.7 穿孔囊泡膜外面向外式...................................................43 2.4 膜片鉗技術的優缺點................................................................43 2.5 膜片鉗技術的操作步驟 ..........................................................44 2.5.1 玻璃微電極的製作...........................................................44 2.5.1.1 拉制 .........................................................................44 2.5.1.2 塗矽酮樹脂 .............................................................45 2.5.1.3 熱拋光 .....................................................................46 2.5.1.4 充灌電解液 .............................................................46 2.5.2 巨歐姆阻抗封接的形成 .................................................47 2.5.3 單一離子通道記錄 ........................................................48 2.5.4 全細胞記錄 ....................................................................49 2.5.5 制真菌素穿孔膜片鉗法 ................................................51 2.6 膜片電容測定法 .....................................................................51 2.6.1 膜片電容性漂移電容的測定法 ....................................51 2.6.2 相位敏感性檢測法 ........................................................53 2.7 參數補償 .................................................................................53 2.7.1 瞬時電容電流補償 ........................................................53 2.7.2 緩慢電容電流補償 ........................................................55 2.7.3 局部串聯電阻電流補償 ................................................56 第三章 晶片設計 3.1 先前的晶片設計、製作流程以及其改進策略 ....................57 3.2 本研究之晶片設計 ................................................................63 3.2.1 光罩設計 .......................................................................64 3.2.2 晶片製程簡述 ...............................................................70 VIII
  10. 10. 第四章 晶片製程與討論 4.1 RCA clean ................................................................................75 4.2 氧化 .........................................................................................75 4.3 低壓化學氣相沉積-氮化矽 .................................................76 4.4 電槳輔助化學氣相沈積-SiO y ..............................................77 4.5 電槳輔助化學氣相沈積-SiN x ..............................................77 4.6 定義晶片背面蝕刻開孔的黃光製程 .....................................78 4.7 背面蝕刻開孔之薄膜蝕刻製程 .............................................79 4.8 TMAH 蝕刻 ............................................................................80 4.9 定義晶片正面細胞平台的黃光製程 .....................................85 4.10 晶片正面細胞平台的乾蝕刻製程...........................................87 4.11 晶片正面蒸鍍鋁 .....................................................................88 4.12 定義晶片正面微孔洞的黃光製程 .........................................88 4.13 鋁濕蝕刻製程 .........................................................................90 4.14 晶片正面微孔洞的乾蝕刻製程 .............................................90 4.15 以 PECVD 縮小微孔動製程 ..................................................93 4.16 軟微影製程 ............................................................................100 第五章 問題討論與未來展望 5.1 C 4 F 8 電漿蝕刻討論 ................................................................101 5.2 TMAH 蝕刻討論 ...................................................................102 5.3 ICP 乾蝕刻均勻度討論 .........................................................103 5.4 晶片結構破壞討論 ................................................................104 5.5 生物相容性討論 ....................................................................104 5.6 未來工作展望 ........................................................................106 參考文獻 .......................................................................................108 附錄 A RCA clean ...............................................................113 附錄 B 化學氣相沉積 ......................................................115 IX
  11. 11. 附錄 C 微影製程 ..................................................................121 附錄 D 濕式蝕刻 .................................................................127 附錄 E 乾式蝕刻 ..................................................................135 附錄 F 軟微影 ........................................................................141 X
  12. 12. 圖目錄 圖 1.1 微小陣列透鏡的 SEM 圖 透鏡直徑 100μm 透鏡間距 15μm .........7 , , 圖 1.2 LIGA 技術完成之微齒輪組 齒輪模數為 38μm 材質為 NiFe ........7 , , 圖 1.3 二氧化矽材質之微噴嘴 ....................................................................8 圖 1.4 利用 SU-8 光阻所製作的微流道 ......................................................8 圖 1.5 打線封裝後之微壓力計晶片 ............................................................8 圖 1.6 微陀螺儀 ..........................................................................................9 圖 1.7 微加速度計........................................................................................9 圖 1.8 三種不同的氧氣感測器 .................................................................9 圖 1.9 微馬達 ...........................................................................................10 圖 1.10 微幫浦.............................................................................................10 圖 1.11 微開關..............................................................................................10 圖 1.12 離子通道的晶體結構 ...................................................................16 圖 1.13 鈉、鉀離子通過離子通道的示意圖...............................................16 圖 1.14 在玻璃基板背後以氫氟酸蝕刻出一個凹槽 ..................................17 圖 1.15 定義出金的蝕刻罩幕 ....................................................................17 圖 1.16 蝕刻完畢的孔洞 .............................................................................17 圖 1.17 石英玻璃晶片工作示意圖 .............................................................18 圖 1.18 晶片微孔洞 ....................................................................................18 圖 1.19 PDMS 模片鉗晶片之製程與微結構 SEM 圖 .................................19 圖 1.20 PDMS 模片鉗晶片之工作示意圖 ..................................................20 圖 1.21 晶片之製程與微結構之 SEM 圖 ....................................................20 圖 1.22 陣列電極之晶片之工作示意圖 ......................................................21 圖 1.23 氧電漿蝕刻孔洞之 SEM 圖...............................................................21 圖 1.24 聚焦離子束蝕刻孔洞之 SEM 圖 ...................................................21 圖 1.25 晶片之工作示意圖 ..........................................................................22 圖 1.26 晶片之 SEM 圖...................................................................................22 圖 1.27 3μm 之微孔 ......................................................................................23 圖 1.28 2.5μm 之微孔 ...................................................................................23 圖 1.29 1μm 以下之微孔 ..............................................................................23 圖 1.30 微縮孔洞之晶片製程圖 ..................................................................23 圖 1.31 自動導引膜片鉗晶片製程圖 ..........................................................24 圖 1.32 自動導引膜片鉗晶片微結構 SEM 圖 ............................................24 圖 1.33 結合微流系統晶片的製程圖與孔洞 PECVD 前 後的 SEM 圖 ....25 、 圖 1.34 膜片鉗結合微流系統示意圖 .........................................................25 XI
  13. 13. 圖 1.35 側向鉗制晶片工作示意圖................................................................26 圖 1.36 側向鉗制晶片上視圖 .....................................................................26 圖 1.37 上圖打圈處側向孔洞之 SEM 圖 .....................................................26 圖 1.38 新側向鉗制晶片製程圖 ..................................................................27 圖 1.39 晶片改進示意圖 ...........................................................................27 圖 1.40 新側向鉗制晶片孔洞之 SEM 圖 ....................................................27 圖 1.41 管璧平滑化流程圖 ..........................................................................28 圖 1.42 PECVD 前 後的 SEM 圖 .................................................................29 、 圖 1.43 PECVD 後的兩種孔洞模型 ...........................................................29 圖 1.44 SOI 晶圓膜片鉗製程圖與孔洞的正面與背面 SEM 圖 ..................30 圖 1.45 LTO 膜片鉗晶片工作示意圖 .........................................................31 圖 1.46 LTO 膜片鉗晶片製程圖 .................................................................31 圖 1.47 LTO 膜片鉗晶片上視圖 .................................................................32 圖 1.48 LTO 膜片鉗晶片孔洞 SEM 圖 .......................................................32 圖 1.49 本文架構圖 .....................................................................................36 圖 2.1 膜片鉗制原理圖 ..............................................................................38 圖 2.2 膜片鉗制的各種模式 ......................................................................39 圖 2.3 ㄧ次拉致與二次拉致的玻璃微電極比較 ......................................45 圖 2.4 玻璃微電極塗上矽酮樹酯的電容模型 ..........................................46 圖 2.5 膜片電容測定等效電路 .................................................................52 圖 2.6 瞬時電容電流補償電路 .................................................................54 圖 2.7 緩慢電容電流補償電路 .................................................................55 圖 2.8 局部串聯電阻補償電路 ..................................................................56 圖 3.1 先前的晶片製程圖 ..........................................................................60 圖 3.2 TMAH 蝕刻完畢之晶片背面照片 .................................................66 圖 3.3-(a) 第ㄧ層光罩-1 ...............................................................................67 圖 3.3-(b) 第ㄧ層光罩-2 ................................................................................67 圖 3.4-(a) 第二層光罩-1 ...............................................................................68 圖 3.4-(b) 第二層光罩-2 ..............................................................................68 圖 3.5-(a) 第三層光罩-1 ................................................................................69 圖 3.5-(b) 第三層光罩-2 ................................................................................69 圖 3.6 本文的晶片製程,左Si3N4右SiO2.................................................... 74 圖 4.1 晶片於氧化爐晶舟上的安排 ...........................................................76 圖 4.2 經過第一層黃光製程後的 OM 圖 ...................................................79 圖 4.3 經過薄膜蝕刻製程之背面蝕刻開孔 OM 圖 ...................................80 XII
  14. 14. 圖 4.4 包覆上鐵氟龍的不繡鋼絲載台 .....................................................82 圖 4.5 四吋玻璃檔片..................................................................................82 圖 4.6 包覆鐵氟龍的四吋玻璃檔片.............................................................82 圖 4.7 鐵氟龍材質的 spacer .........................................................................82 圖 4.8 spacer 的放置法...................................................................................82 圖 4.9 TMAH 蝕刻夾具完成圖.......................................................................82 圖 4.10-(a) 晶片 TMAH 浸泡情形 ..............................................................83 圖 4.10-(b) 晶片 TMAH 浸泡情形示意圖 ..................................................83 圖 4.11 TMAH 蝕刻裝置安排情形.................................................................83 圖 4.12 未加玻璃檔片 TMAH 蝕刻後的晶片正面......................................83 圖 4.13-(a) 加玻璃檔片 TMAH 蝕刻後的晶片正面.....................................83 圖 4.13-(b) 加玻璃檔片 TMAH 蝕刻後的晶片背面.....................................83 圖 4.14 達蝕刻終止點時在夾具上的晶片觀察 ..........................................84 圖 4.15 達蝕刻終點從夾具上取下的晶片觀察 .........................................84 圖 4.16-(a) 氮化矽結構蝕刻終止點之晶片正面觀察................................. 84 圖 4.16-(b) 氮化矽結構蝕刻終止點之晶片正面觀察................................. 84 圖 4.17-(a) SiO2結構蝕刻終止點之晶片正面觀察.................................... 84 圖 4.17-(b) Si3N4結構蝕刻終止點之晶片背面觀察................................... 84 圖 4.18 晶片背面貼上 UV 膠的情形 ..........................................................86 圖 4.19-(a) Si3N4結構的方形平台 ...............................................................87 圖 4.19-(b) SiO2結構的圓形平台 ................................................................ 87 圖 4.20 微孔洞蝕刻成功的晶片正面觀察 ..................................................91 圖 4.21 微孔洞蝕刻失敗的晶片正面觀察 ..................................................91 圖 4.22 第一次 PECVD 縮孔後的晶片正面觀察 .......................................93 圖 4.23 第一次 BOE 浸潤後的晶片正面觀察 ..........................................94 圖 4.24 第二次 PECVD 縮孔後的晶片正面觀察 .......................................94 圖 4.25 第二次 BOE 浸潤後的晶片正面觀察 .............................................95 圖 4.26 第三次 PECVD 縮孔後的晶片正面觀察 .......................................95 圖 4.27-(a) 不經 BOE 潤飾而微縮孔洞之晶片平台 ...................................97 圖 4.27-(b) 不經 BOE 潤飾而微縮之孔洞 ...................................................97 圖 4.28-(a) 第一次 BOE 潤飾並微縮孔洞之晶片平台 ...............................98 圖 4.28-(b) 第一次 BOE 潤飾並微縮之孔洞 ..............................................98 XIII
  15. 15. 圖 4.29-(a) 第二次 BOE 潤飾並微縮孔洞之晶片平台 .............................99 圖 4.29-(b) 第二次 BOE 潤飾並微縮之孔洞 ...............................................99 圖 4.29-(c) Tilt20°觀察微孔洞 ....................................................................100 圖 5.1 光阻碳化觀察 ..................................................................................101 圖 5.2 C4F8電漿蝕刻微孔洞失敗觀察 .......................................................101 圖 5.3 蝕刻停止點之矩形過大 ..................................................................102 圖 5.4 平台偏移導致微孔蝕刻失敗觀察 ..................................................102 圖 5.5-(a) 微孔洞穿透失敗 OM 圖 .............................................................103 圖 5.5-(b) 微孔洞穿透失敗 SEM 圖 ..........................................................103 圖 5.6 晶片結構破裂觀察 ..........................................................................104 圖 5.7 晶片結構亀裂觀察 ..........................................................................104 圖 5.8 晶片平台之元素分析 ......................................................................105 表目錄 表 1.1 微機電技術應用產品市場變化表 .......................................................6 表 4.1 SF6氣體電漿對氮化矽蝕刻的參數測試表 .....................................93 XIV
  16. 16. 第一章 緒論 1.1 前言 微機電系統(micro-electro-mechanical system,簡稱 MEMS)在歐洲被 稱為微系統科技(Micro system technology)。著名的費曼博士(1965 年諾貝 爾物理獎得主)在 1959 年在美國物理學年會上發表「There is Plenty of Room at the Bottom」的專題演講中,首先提到把機器微型化的概念,而 「微機器(micromachines)」此一名詞在 1982 年發表了著名的「以矽為機 械材料(silicon as a mechanical material)」研究報告;1989 年在美國猶他州 鹽湖城的一場研討會(Micro-Tele-Operated Robotics Workshop)中,則具體 提出「微機電系統」此一名稱。 此名稱也正顯現了當時此一新科技的特質:以原本用於微電子產業 的半導體製程技術來製作微米(百萬分之ㄧ公尺)尺度的機械結構,並可整 合多種微元件,包含積體電路,而成為一微型系統。演變至今,微機電 系統的發展已逐漸由學術研究走進產業界,衍生出多項產品,所涵蓋的 範疇包含了光學、電子、電機、機械、通訊、材料、物理、化學與生化 醫學等多種知識與技術,形成一個跨領域型整合科技。 1.2 微機電製程技術簡介[37] 雖然早在 1959 年費曼博士就提出微型機器的概念,但真正促使此一 領域蓬勃發展的推手還是由於半導體製程技術的日趨成熟,使得製作微 機電元件的可行性大大提升。所以標準半導體製程技術與微機電製程技 -1-
  17. 17. 術常常密不可分,如薄膜沉積、微影與蝕刻技術,可是微機電系統的發 展雖然是搭著半導體製程設備與技術的便車,但由於在性能及結構上的 要求已不同於積體電路,所以也逐步發展出不同的製造技術。與標準的 積體電路結構相比,微機電元件的結構特徵有:三維結構、高深寬比、 可動結構及多元性材料。 (1)三維結構: 積體電路基本上是一個平面結構,但微機電元件的幾何形狀比較複 雜,配合晶片接合技術,常有微柱、微孔、微腔室及微溝等立體結構, 再搭配立體微接頭,可構成多變的三維結構。 (2)高深寬比: 為了增加強度或是感測及驅動量,微元件的厚度常要求較高,可能 是數十到數百微米,甚至更厚,但是微結構中的微孔洞或是間距可能僅 僅數微米,因此相對地側壁垂直度要很好,所以為了此目的而發展出了 厚膜光阻、深蝕刻、同步輻射 X 光光刻等技術。 (3)可動結構: 在各種的微機電元件中,常常可以見到立體或懸浮式的微結構,以 容許微結構變形或運動,所以掏空微結構下層材料的犧牲層(sacrificial layer)技術、背面蝕刻(back-side etching)技術、連接懸浮結構而形成立體 結構的微絞鏈(micro hinge)技術,及避免懸浮結構與下層基底沾黏的技 -2-
  18. 18. 術,都是微機電製程中特有的技術。也由於微機電元件常有中空或懸浮 式結構,微元件及微系統所需的封裝技術,也就常不同於電子元件已發 展相當成熟的封裝技術,目前仍處於發展中的階段。 (4)多元性材料: 比較早的微積電元件的結構中多是以矽為基材,如單晶(single crystal) 矽 複晶(poly crystal)矽 非晶(amorphous)矽 氮化矽(Silicon Nitride Si3N4) 、 、 、 , 或二氧化矽(Silicon dioxide,SiO2)等,再搭配一些金屬,如鋁、金,因為 這些可用標準半導體製程製作,但隨著微機電元件的多樣化,也越來越 常用到其他各式金屬及高分子材料,甚至用到所謂的智慧型材料,如壓 電、磁性材料及形狀記憶合金,這些就不是目前標準半導體製程所能提 供的,所以非矽材料的微加工製程技術在微機電製程技術中也日漸重 要,如微放電加工、電化學微加工及高深寬比模造術中的精密電鑄和各 種的微成形技術。 對研究的人員來說,在微機電的領域裡盡情發揮想像揮灑的空間很 大,可以不必拘泥於標準的半導體製程,但從產業界的角度來說,由於 微機電製程的多樣化,不單單要考慮最小線寬與結構厚度,還要包含不 同的結構層時常會使用不同的材料所發生的問題,有時還要兼顧不同元 件整合時的製程技術相容性問題,所以不但傳統的半導體製程工廠無法 滿足微機電產品的需求,也使微製造技術的單一標準化十分困難。 -3-
  19. 19. 在微機電產品邁入商品化時,從成本以及技術成熟度考量,自然最 好是利用現有的半導體製程技術,但從功能性考量,單單半導體製程技 術無法滿足所求時,常需要為特定產品額外建立新的生產線。另一方面, 現在也有越來越多的微機電製程代工廠設立,嘗試建立其自有的標準製 程,如 1980 年代由北卡微電子中心(Microelectronics Center of North Carolina,MCNC)所開發可製作三層複晶矽結構的 MUMPs(multi-user MEMS processes),及美國 Sandia 國家實驗室(Sandia National Laboratory) 所發展可製作三層或五層複晶矽結構的 SUMMiT(Sandia Ultra-planar, Multi-level MEMS Technology)製程,顯示標準化的量產技術仍是發展微 機電系統時所要考慮的重要課題。 1.3 微機電元件與應用 微機電元件可分為三大類:微結構、微感測器與微致動器。微結構 是屬於靜態式作用,如微透鏡、微齒輪、微噴嘴和微流道,如圖 1.1 到圖 1.4;微感測器是用來量測一些自然界中的物理量或是化學量,如壓力計、 微陀螺儀、微加速度計與氣體感測器,如圖 1.5 到圖 1.8;微制動器則可 以將輸入的能量轉化為運動輸出,如微馬達、微幫浦和微開關(switch) , 如圖 1.9 到圖 1.11。若將一個或是數個微機電元件與訊號傳輸放大電路或 是與其訊號處理單元整合在一起,則可形成一個微系統。以現在已經大 量商品化的汽車安全氣囊為例,當汽車受到嚴重的衝擊時,車上的微加 速度計將會把其所偵測到的加速度量值轉換成訊號,並經過適當的處 -4-
  20. 20. 理,再送訊號至使安全氣囊膨脹的致動機構,啟動氣囊以保護車上的人 員。 一般對微機電系統所期待的特性以及優點可大致分為下列幾項: (1)微小化:省材料、省空間、低耗能、高性能、方便攜帶。 (2)多工化:藉由整合各種不同的微元件,可使其功能更多樣。 (3)陣列化:相同元件可在小面積內大量複製排列,並且能個別獨立 操作。 (4)模組化:各種不同元件可以使其整合入一個小面積內。 (5)量產化:低成本、可使用後即拋棄。 一般來說,感測器以及致動器是智慧型系統所必備的元件,如同微 處理器一樣,在許多的產品中都已存在,而微機電系統技術除了可以帶 來這些產品在功能上的提昇之外,更有機會創造出一些新的用途。根據 先前在英國皇家科技協會(Royal Institute of Technology)的報告中指出,現 在較常見的微機電系統技術產品主要為(1)磁性儲存設備的讀寫頭;(2)噴 墨印表機的噴墨頭;(3)汽車內的各式感應器。而預測將來主要的產品方 向可能會是(1)醫療技術、設備與用品;(2)生化科技;(3)無線通訊設備等。 下表 1.1 是美國肯那集團(Cahner In-Stat Group)對微機電技術產品市場變 化的研究統計。 -5-
  21. 21. 2000 年十大應用領域 2005 年十大應用領域 汽車 26 % 光開關 24 % 工業設備 15 % 投影系統 15 % 噴墨印表頭 9.5 % 繼電器 14 % 投影設備 8.2 % 汽車 12 % 血壓計 4.4 % 工業設備 6.9 % 消費電子 4 % 噴墨印表頭 6% 生物晶片 1.6 % 生物晶片 4% 光開關 0.8 % 通訊用濾波器 2.9 % 醫療設備 0.6 % 血壓計 2.2 % 醫學儀器 0.4 % 通訊用雷射 1.7 % 表 1.1 微機電技術應用產品市場變化表 -6-
  22. 22. 雖然現在市場上微機電元件或是系統成熟的商品並不多,而且各界 對微機電這個領域在未來的市場發展分析也不盡然相同,但是可以確定 的是微機電事實上是個發展中的產業,還有許多可能的應用仍然在探索 中,當微機電的知識與技術隨著時間逐漸地演進,在研發與生產製造微 機電元件的成本更具有競爭力時,將會發現會有越來越多的微機電產品 出現,取代現在市場上的舊大型商品,使我們未來的生活更加便利與安 全。 圖 1.1 微小陣列透鏡的 SEM 圖,透鏡直徑 100μm,透鏡間距 15μm [1] 圖1.2 LIGA技術完成之微齒輪組,齒輪模數為38μm,材質為NiFe [2] -7-
  23. 23. 圖 1.3 二氧化矽材質之微噴嘴 [3] 圖 1.4 利用 SU-8 光阻所製作的微流道 [4] 圖1.5 打線封裝後之微壓力計晶片 [5] -8-
  24. 24. 圖 1.6 微陀螺儀 [6] 圖 1.7 微加速度計 [7] 圖 1.8 三種不同的氧氣感測器 [8] -9-
  25. 25. 圖 1.9 微馬達 [9] 圖 1.10 微幫浦 [10] 圖 1.11 微開關 [11] - 10 -
  26. 26. 1.4 細胞動作電位簡介 無論在臨床上或是在實驗室中對各種病理的研究來說,利用建立各 種不同的動物或是細胞模型來討論致病的機制,來研究疾病的成因以及 其治療方法,已經是非常一般且常用的模式了,因此,為了建立完整的 細胞模型,必須想辦法來正確的記錄其電氣特性,以心臟細胞為例,現 在我們除了可以用電極量測心電圖的方式來記錄心肌的電氣特性之外, 還可以使用微電極的方式對單一顆細胞進行量測其細胞膜電位,而且目 前以微電極的方法來記錄膜電位可以說是一種標準了。 膜電位是生物體內部的各種細胞因為細胞膜內外的離子分布不相同 而產生的,在平常靜止狀態時,細胞內所帶的電荷是負電荷,而細胞外 通常帶正電荷,此時所測得的電位差就是所謂的靜止膜電位(resting membrane potential)或稱「極化現象」(Polarization),亦即細胞在休息或是 靜止時所具有的膜電壓。 在細胞膜上有很多通道,藉這些通道,細胞與外界進行物質交換。 這些通道由單個分子或多個分子組成,能允許一些離子通過,當細胞興 奮,如神經傳導、內分泌細胞分泌或是外界刺激超過某種限度時,會造 成細胞膜上離子通道開啟,讓細胞外高濃度的正離子順著濃度梯度流向 細胞內,造成這些細胞膜迅速地「去極化」(depolarize),使膜內電位增高, 甚至成正電位,此電位稱為階級電位(grade potwntial),若在神經細胞即 為刺激型後突觸神經電位(EPSP)。當細胞膜上的某些離子通道發生去極 化,又會影響附近細胞膜上的離子通道開啟,使更遠的細胞膜去極化, 動作電位如此接續傳遞,直到去極化訊號傳遍了整個細胞甚至整個組織。 - 11 -
  27. 27. 1.5 膜片鉗簡介 膜片箝技術是一種,以紀錄通過離子通道的離子電流,來反應細胞 膜上單一個或是多個的離子通道分子活動的技術,該技術可將微電極尖 端所吸附的一至數平方微米面積的細胞膜的電位固定在同一個水準,對 通過離子通道的微小離子做動態或是靜態的觀察。同時,因為膜片箝吮 吸(sucking)的動作,使得這一小面積的細胞膜形成孤立與高阻抗的情形, 可以有效的減少紀錄膜電位時的背景雜訊,相對地也可以增加紀錄的頻 寬,提高分辨率,另外,它還必須具備良好的機械性質與化學穩定性。 - 12 -
  28. 28. 1.6 文獻回顧 1.6.1 離子通道的發展 在 1890 年時,世界上的第一個物理化學家奧斯華 瓦爾德(Wilhelm Ostwald,1909 年諾貝爾化學獎得主)就認為在活體組織中所量到的電流 訊號,應該是來自於離子穿透過細胞膜的進出而產生的,而這個屬於電 化學的想法也很快地廣為接受,一直到了 1920 年代,才又興起了另一種 看法,認為應該會具有某種狹窄的離子通道存在。[12] 1940年代,凌寧(Ling)和吉瑞德(Gerard)發明了玻璃微電極。他們將 玻璃管拉到零點幾個微米的粗細,成功地測量到青蛙縫匠肌內肌肉細胞 的靜止膜電位,藉著玻璃微電極的發明,後人也逐漸發現所有的生物細 胞都會有極化的現象。[13] 1952年,霍奇金(Alan Hodgkin,1963年的諾貝爾醫學獎得主)、哈克 斯利(Andrew Huxley,1963年的諾貝爾醫學獎得主)和卡茲(Katz)利用烏賊 外套膜裡面的巨大神經纖維成功地做了電壓箝制(voltage-clamp),並且在 後續所進行一系列的實驗與研究中顯示,透過神經細胞膜的離子傳輸, 所產生的訊號可透過一個個神經細胞,以接力賽的方式傳遞下去,而這 些反應裡面最主要的角色就是鈉離子與鉀離子,證明了細胞中動作電位 發生的基本原因,就是細胞膜對鈉、鉀離子的通透能力發生了變化,這 樣的發現開啟了神經生理學的新頁。而鈣離子通道的存在也接著被證 實,並且關於迅速運輸、離子選擇性、通道開關、通道去活化等概念也 發展齊備,但其分子機制依然不明。[14] 1976年,兩位德國的生理學家Erwin Neher(1991年的諾貝爾醫學獎得 - 13 -
  29. 29. 主)和Bert Sakmann(1991年的諾貝爾醫學獎得主)他們在實驗中使用微細 之玻璃電極緊密地吸附著肌細胞膜,並精確測量到離子通過細胞膜時産 生十分微弱的電流,在實驗中,他們利用與離子通道直徑近似的鈉離子 或氯離子,並在最後達成共識:離子通道是存在的。他們證實了在與單 一鈉離子或是氯離子有關的情況下,對離子通道開啟或關閉有何影響, 有些離子通道的開關是由位在於通道分子一邊的接受體(receptor)所調節 的,端賴其形狀活化與否。Neher和Sakmann證明了部分分子可作為感知 器(sensor),以及作為通道的內壁。他們也證明出通道蛋白是如何調節正、 負荷電荷離子的通行。這項新知及其分析方法是過去十年來現代生物學 的重大變革,促進了學術研究,並且有助於對一些疾病其胞內機制的了 解,例如糖尿病(diabetes)和囊胞性纖維症(cystic fibrosis)。[14] 雖然在 1970 年代的研究就已顯示,離子通道只能讓某些離子通過, 是因為它裝有某種“離子過濾器”,但研究人員後續發現一件有趣的事 情,雖然鈉離子比鉀離子要小,卻發現有一種通道只能讓鉀離子通過, 卻不會讓鈉離子通過。有人猜測這可能是由於蛋白質中的氧原子們扮演 了一個重要的取代角色,取代了原先溶於水中的鉀離子周圍所包的水分 子層,當鉀離子要進入通道中,必須先脫離這個水層的包圍。但是要進 一步要證實這個猜測卻很困難,因為真正必須做的是要取得只有 X 射線 晶體繞射才能得到的清楚圖像,問題是運用這種方式去解膜蛋白的結構 是非常困難的,當然要去解鉀離子通道的結構也不會例外。[15] Roderick Mac Kinnon 在修完生化的學位後,轉入了醫學的領域,成 為一個合格的醫師。在成為醫師之後若干年,他開始對離子通道產生極 - 14 -
  30. 30. 高的興趣,並開始了這方面的研究。他自承“我的研究生涯從 30 歲才開 始”,不過他的研究卻快速的起飛。由於體認到要了解離子通道如何運 作,必須要有更好而且更高解析度的結構圖像,他決定從最基本的 X 射 線結晶學開始學起,在短短的數年之後,他在 1998 年的 4 月提出了一個 清楚的離子通道圖像而震撼了整個學界。[15] Mac Kinnon 所決定的第一個高解析度的離子通道結構稱為 Kcs A, 乃是由一個稱為 Streptomycesliridans 的菌株得到的,這是第一次展示了 在原子的層次,一個離子通道是如何運作的,那個只允許鉀離子通過而 拒絕鈉離子的離子過濾器,他不僅弄清楚離子如何通過這個通道,在其 晶體結構中甚至於可看到正在通道前被水包圍著的離子,在過濾器之中 的離子,以及離開過濾器的離子,水是如何的來迎接它們,圖 1.12。Mac Kinnon 也能解釋為何是鉀離子而非鈉離子被允許通過此過濾器,說穿 了,這主要是由於鉀離子在過濾器中,周圍所圍繞的氧原子之位置,與 在外面被水分子包圍著時,水分子的氧原子之位置是相同的,但是對較 小的鈉離子而言,它在過濾器中與氧原子的相對位置,就無法與在水中 時一樣,圖 1.13,因此就較喜歡留在水中,其在水中的能量態較低。這 種能讓鉀離子脫離水層,通過通道而且不損失能量的做法,屬於一種所 謂選擇性催化的離子傳輸。[15] - 15 -
  31. 31. 圖 1.12 離子通道的晶體結構[15] 圖 1.13 鈉、鉀離子通過離子通道的示意圖[15] 1.6.2 微機電整合膜片鉗的發展 2001年,德國Ludwig-Maximilians-Universita¨t的物理系,發表了在玻 璃的基板上,利用濕試蝕刻搭配離子術蝕刻(ion track etching)技術,成功 製作出了平面的膜片鉗,圖1.14到圖1.16則是此元件的製作流程。[16] - 16 -
  32. 32. 圖 1.14 在玻璃基板背後以氫氟酸蝕刻出一個凹槽[16] 圖 1.15 定義出金的蝕刻罩幕[16] 圖 1.16 蝕刻完畢的孔洞[16] - 17 -
  33. 33. 2002 年,丹麥的Sophion公司發表APATCHI-1,為全球第一台自動 以玻璃吸管電極為系統的商業化膜片箝制紀錄系統[17]。 2002 年,德國慕尼黑大學(Munich University)的奈米科學中心(Center of Nanoscience) 的 Niels Fertig 團 隊 利 用 平 面 微 結 構 之 石 英 玻 璃 晶 片 (Planar micro structured quartz chip),圖1.17到圖1.18,使原本只使用水生 蛙蛙卵(Xenopus oocytes)的細胞貼附式(cell-attached mode)提升至可使用 哺乳動物細胞(mammalian)的全細胞式(whole-cell mode),且Nanion 公司 也將此產品加以商業化[18]。 圖1.17 石英玻璃晶片工作示意圖[18] 圖1.18 晶片微孔洞[18] - 18 -
  34. 34. 2002 年 , 耶 魯 (Yale) 大 學 的 Kathryn 的 團 隊 利 用 PDMS(Polydimethysiloxane)取代玻璃管製造出模片鉗晶片,圖1.19,使量 測過程更符合巨歐姆阻抗封接(Gigaomh Seal)與極少漏電為其優點,孔洞 較難縮小為其缺點,圖1.20為其工作示意圖 [19]。 圖 1.19 PDMS 模片鉗晶片之製程與微結構 SEM 圖[19] - 19 -
  35. 35. 圖1.20 PDMS模片鉗晶片之工作示意圖[19] 2002年,瑞士聯邦科技學院(Swiss Federal Institute of Technology)微 電子系統所(Institute of Microelectronics and Microsystems)的Lehnert與德 國漢堡大學(Hamburg)之Evotec OAI AG的Netzer發表利用二氧化矽(SiO2) 作為微噴嘴(micronozzle),圖1.21,使其可應用於吸取細胞之用途[20]。 圖1.21 晶片之製程與微結構之SEM圖[20] - 20 -
  36. 36. 2003 年,日本立命館大學與松下電子合作的Masato TANABE 團隊 製作一MCA (Micro Channel Array)結構,圖1.22,可用其陣列電極來偵測 細胞[21]。 圖1.22 陣列電極之晶片之工作示意圖[21] 2003年,德國醫療科學協會發表了在聚亞醯胺(polymide)薄膜上製作 出膜片鉗,利用氮化矽當作蝕刻罩幕,經過微影製程將微孔洞做出來, 將聚亞醯胺進行氧電漿蝕刻與聚焦離子術蝕刻(focus ion beam etching), 成功做出2μm與4μm之膜片鉗,圖1.23 圖1.24。[22] 2 μm 2 μm 圖1.23 氧電漿蝕刻孔洞之SEM圖[22] 圖1.24 聚焦離子束蝕刻孔洞之SEM圖[22] - 21 -
  37. 37. 2003年,德國Cytocentrics CCS公司研發了CytoPatch晶片,利用聚焦 離子束在石英玻璃(quartz)上做出了玻璃微電極型態的膜片鉗,圖1.25到 圖1.26。[23] 圖1.25 晶片之工作示意圖[23] 2 μm 圖1.26 晶片之SEM圖[23] 2003年,美國加州大學,在矽晶圓上以乾、濕蝕刻製作出3μm大小的 微孔,如圖1.27,再利用低壓化學氣相沉積(Low Pressure Chemical Vapor Deposition , LPCVD)2μm 之 二 氧 化 矽 來 縮 小 孔 徑 至 2.5μm 左 右 , 如 圖 1.28 ,再將晶片以LPCVD沉積或以濕式氧化成長2μm之二氧化矽,孔徑 可以縮小至1μm以下,如圖1.29,晶片製程如圖1.30。[24] - 22 -
  38. 38. 圖1.27 3μm之微孔[24] 圖1.28 2.5μm之微孔[24] 圖1.30 微縮孔洞之晶片製程圖[24] 圖1.29 1μm以下之微孔[24] - 23 -
  39. 39. 2003年,在國際微機電與奈米自動化系統研討會上,發表了一篇利 用兩片矽晶圓結合做出來的膜片鉗,晶圓一:利用氮化矽作為蝕刻罩幕, 再以氫氧化鉀蝕刻穿矽晶圓;晶圓二,利用1μm之二氧化矽當作蝕刻停止 層,以乾蝕刻至此層停止後再將二氧化矽薄膜開出一個3μm之孔洞;再將 兩片晶圓接合(bonding),成為可自動導引的膜片鉗,圖1.31到圖1.32。[25] 圖1.31 自動導引膜片鉗晶片製程圖[25] 圖1.32 自動導引膜片鉗晶片微結構SEM圖[25] - 24 -
  40. 40. 2004年,美國加州大學奈米系統所,利用ICP進行體型微加工(bulk micromachining),製造出約2μm大小的孔洞,再以電槳輔助化學氣相沈積 (Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition , PECVD) 將 孔 洞 縮 小 至 0.7μm左右,圖1.33,並且在結合了PDMS微流道結構,成為一個具有微 流系統的膜片鉗,圖1.34。[26] 圖1.33 結合微流系統晶片的製程圖與孔洞PECVD前、後的SEM圖[26] 圖 1.34 膜片鉗結合微流系統示意圖[26] - 25 -
  41. 41. 2004年,美國柏克萊之感應器與制動器中心(Berkeley Sensor and Actuator Center)的J.Seo團隊利用玻璃基材與PDMS做出開孔在水平方向 的微結構,以側向的孔洞做膜片箝制,並聲稱此結構可以降低量測時的 串聯電容,圖1.35到圖1.37。[27] 圖1.35 側向鉗制晶片工作示意圖[27] 圖1.36 側向鉗制晶片上視圖[27] 圖1.37 上圖打圈處側向孔洞之SEM圖[27] - 26 -
  42. 42. 2006年,美國柏克萊的Adrian Y. Lau,Paul J. Hung等人改進了上一 個晶片,將開孔的位置提高,使得細胞膜被鉗制的位置較佳,圖1.38到圖 1.40。[28] 圖1.38 新側向鉗制晶片製程圖[28] 圖1.39 晶片改進示意圖[28] 圖1.40 新側向鉗制晶片孔洞之SEM圖[28] - 27 -
  43. 43. 2006年,美國加州大學Brian Matthews等人改進了他們在2003年所製 作的晶片,將BOSCH ICP製程過的微孔洞,利用先進行濕式氧化再以氫 佛酸去除氧化層的方式使得微孔洞管璧更平滑(smooth),如圖1.41。[29] 圖1.41 管璧平滑化流程圖[29] - 28 -
  44. 44. 2006年,法國Thomas Sorde等人利用PECVD將微孔洞縮小,針對 PECVD可能沉積的情況提出兩種模型,並明確以實驗數據指出再以 PECVDE縮小的微孔能提供更有效的隔離品質,圖1.42到圖1.43。[30] 圖1.42 PECVD前(左)、後(右)的SEM圖[30] 圖1.43 PECVD後的兩種孔洞模型[30] - 29 -
  45. 45. 2007年,日本的Z.L. Zhang團隊以矽晶絕緣體(SOI)晶圓,利用鑽石研 磨搭配濕式蝕刻將晶圓從底部掏空到晶圓的絕緣層處,再以聚焦離子束 從正面蝕刻出直徑大約0.5μm的孔洞,圖1.44。[31] 圖1.44 SOI晶圓膜片鉗製程圖(左)與孔洞的正面(右下)與背面(右上)SEM圖[31] - 30 -
  46. 46. 2007年,美國柏克萊之感應器與制動器中心在矽晶圓上沉積了低溫 氧化層(low temperature oxide,LTO)和金屬層搭配微影製程和聚焦離子束 蝕刻,製作出一個可以有4個量測電極的膜片鉗,圖1.45到圖1.48。[32] 圖1.45 LTO膜片鉗晶片工作示意圖[32] 圖1.46 LTO膜片鉗晶片製程圖[32] - 31 -
  47. 47. 圖1.47 LTO膜片鉗晶片上視圖[32] 圖1.48 LTO膜片鉗晶片孔洞SEM圖[32] - 32 -
  48. 48. 1.7 研究動機 離子通道的性質與細胞動作電位之間關係密不可分,目前如果我們 想要了解離子通道上電流的微細變化量,已經有模片箝技術的幫忙,但 非常可惜的是傳統膜片箝制技術在人工操作上卻需要相當純熟的技術, 才能將玻璃吸管精準地移動到所要紀錄的細胞上,然後進行量測的動 作,過程中非常耗費時間與精力,而因此造成實驗紀錄數據的產量會相 當少。 所以本文的研究目的就是期望能利用微機電的方法,開發一套製程 來做出具有膜片箝制功能的晶片,並再搭配上微流管道以及軟微影技 術,將能進行細胞自動定位並觀測,另外,若是能以微機電製程實現此 晶片還可以擁有以下優點: (1)微機電製程技術純熟: 以現今的微機電製程設備來製造此晶片,可以非常輕易地將晶片上的 各個構造做到符合細胞大小的等級,如晶片平台必須做到大約十幾到數 十微米,而用來做膜片箝制的微孔必須達到一到數微米的等級,以現在 的技術來說並非難事。 (2)模組化、多功化: 可以在製程上整合其他的技術,如在晶片上再整合能用來做細胞電破 功能的電極,或是其他量測細胞物理性質、化學性質的裝置,最吸引人 - 33 -
  49. 49. 的是可以將訊號擷取、放大甚至處理電路放置在晶片平台的附近,可以 增加訊號處理的速度,減少傳輸時產生的雜訊,更精準地觀察細胞動作 電位的變化。 (3)陣列化: 在設計時,可以將晶片的位置以陣列化的形式分布,相對於傳統的玻 璃微電極必須一個細胞一個細胞的量測,陣列化的分布不單單可以針對 單一細胞的紀錄與觀察,還可以同時平行紀錄非常大量的細胞,甚至透 過特殊的電路設計還可以觀察群體的細胞一起表現出來的行為。 (4)自動化: 晶片設計將以自動的方式黏取細胞到特定位置,實驗資料的取出也可 利用電腦做紀錄以及觀察,晶片化的結果可讓大部分需要極輕巧的人工 動作以自動化來實現,因此免去了許多人為的誤差,也省去了學習使用 傳統電極所需要的時間。 (5)批次化: 以微機電製程生產此類晶片將可非常大量的批次化製造,有效降低成 本。 事實上,依照本實驗室長久的努力之下,所製造出來的成品已經擁 有能將細胞自動黏取到特定位置的功能,在結構上也實現將用來進行膜 - 34 -
  50. 50. 片鉗的微孔洞安置到會黏取細胞的位置上,雖然礙於實驗儀器不足還無 法對此晶片之巨阻抗封接情形做觀察,但從世界各地的研究文獻來看, 我們有足夠的信心相信其效能,只不過在製程上仍舊存些許小問題,使 整體的良率一直無法有效提高到五成以上,在產出數量無法如預期的情 況下讓此晶片之後續研究發展上較受限制,因此本文的研究目標是在不 改變晶片整體結構設計前提下,保持其原始的功能,或者增進其各種功 能之效益,並且利用改變製程順序或材料選擇來設法提升良率,以期此 晶片能夠更快投入電生理研究領域,讓從事細胞研究之人員能擁有更好 的工具,進而能夠真正為社會做出貢獻。 - 35 -
  51. 51. 1.8 本文架構 本文共分為六章,如圖 1.49 所示。第一章為簡介膜片鉗晶片與其重 要性,並包含了文獻回顧與研究動機。第二章則介紹傳統上利用玻璃微 電極來對細胞做膜片鉗制量測時的方法、理論以及操作方式。第三章介 紹了本實驗室先前所研發出來的晶片,並以改進它的缺點當做本文中的 研究與設計的目標之描述。第四章對此晶片所有製程進行更詳細地討 論,以及一些製程上的小技巧。第五章提出此晶片製造過程中所遇到的 問題以及克服的構想,並提出本研究未來可能的走向。 圖 1.49 本文架構圖 - 36 -
  52. 52. 第二章 膜片鉗制 2.1 前言 1976 年,Neher 和 Sakmann 建立了膜片鉗技術(patch clamp recording technique),這是一種以紀錄通過離子通道的離子電流來反應細胞膜上單 一的或是多數的離子通道分子活動的技術,由於巨歐姆阻抗封接 (Gigaohm seal)方法的確立以及後續多種方法的創建,1980 年以來,此類 技術已經可以用於許多細胞系統的研究。然而,這種技術也點燃了細胞 和分子平衡生理學研究的革命之火 它與基因克隆(gene cloning)技術一起 , 給予生命科學研究帶來了巨大的前進動力,這一項偉大的貢獻,也讓 Neher 和 Sakmann 眾望所歸地獲得了 1991 年度的諾貝爾醫學與生理學獎。 2.2 膜片鉗技術的原理與操作 膜片鉗技術是用玻璃微電極接觸細胞膜,以千兆歐姆以上的阻抗將量 測部份封接,使與電極尖端開口處相接的細胞膜小區域(膜片)可以與周圍 的環境電性隔離,在這樣的情況下固定電位,對此膜片上離子通道的離 子電流(pA等級)進行觀測紀錄的方法。 用運算放大器構成的I-V轉換器(converter)是這個量測迴路的核心部 份,在運算放大器的正負輸入端為等電位,因此若是向正端輸入一個指 定電壓(command voltage,VCMD)時,則因為虛短路的關係放大器的負端 與被量測的膜片部份都會到指定電壓而達成鉗制的目的。當玻璃微電極 尖端與膜片之間形成10GΩ以上的封接時,此時的分流電流(即流過Rseal的 - 37 -
  53. 53. 電流)達到最小,因此橫跨膜片的電流可以幾乎看成100%來自於玻璃微電 極的紀錄電流,而將信號取出來,圖2.1。 圖2.1 膜片鉗制原理圖 圖2.1中Rs是與膜片阻抗相串聯的局部串聯電阻,Rseal為封接阻抗, Ip R seal Rs通常為1~5MΩ,如果Rseal大於10GΩ以上時, = -1 ,則此Ip I (Rs+R seal ) 即會導致在I-V轉換器中的高阻抗回授電阻(Rf)上的電壓下降而被檢測出 來,可以發現此時運算放大器A1的輸出電阻會包含著膜電阻的部份,而 這個部份會在第二級的運算放大器A2的輸出部分消失。 2.3 膜片鉗制的各種模式 圖2.2是表示膜片鉗制的各種模式的示意圖,最先建立的單通道記錄 法(Single channel recording)是細胞吸附式(Cell-attached mode),之後又建 - 38 -
  54. 54. 立了膜內面向外式(Inside-out)和膜外面向外式(Outside-out),近代又分別 建立了開放的細胞吸附式膜內面向外(Open cell-attached inside-out mode) 和穿孔囊泡膜外面向外式(Perforated vesicle outside-out mode),而全細胞 紀錄法是指在傳統的方法上,再加上穿孔膜片式(Perforated patch mode)。 Inside-out Open-cell-attached On cell cell open pull nystatin suck Perforated-vesicle Outside-out Perforated-patch Hole-cell pull pull 圖2.2膜片鉗制的各種模式 2.3.1 細胞吸附式(Cell-attached mode 或 On-cell mode) 這是一種將玻璃微電極吸附在細胞膜上對單離子通道電流進行紀錄 的模式,其優點是在細胞內環境保持正常的條件下,可以對離子通道的 活動進行觀察與紀錄,但是,由於此方法不能人為地直接控制細胞內環 境條件,也不太能夠確切地判斷目前細胞內的電位,所以其缺點就是不 - 39 -
  55. 55. 清楚膜片上的實際電位,此外,另一個缺點是即使在溶液中加入刺激性 的物質,也不能到達與電極內液接觸的膜片的細胞外面,相對的,如果 膜片離子通道對於溶液中的刺激性物質有反應,則可以說明這種刺激性 物質是透過某些細胞內其他信號的傳導而間接引起的作用,因此可以說 是優點也是缺點。 2.3.2 膜內面向外式(Inside-out mode) 以細胞吸附式將已經形成巨歐姆阻抗封接(Gigaohm seal)的玻璃微電 極向上提起時,則膜片就會從細胞體上被切割分隔下來,得到切割膜片 (excised patch membrane)形成膜內面向外式,此種模式,可以直接地且自 由地藉由改變溶液而調控細胞內液的條件,還可以在和細胞活動無關的 形式下觀察到單一離子通道的活動,但是由於細胞質出現漏滲(washout) 的現象,所以如果在此處存在某種離子通道調控因子,則要注意此實驗 很有可能成為忽略了此調控因子的情況發生,但也可以利用這樣細胞質 漏滲的情況來反向思考提醒離子通道調控因子的存在。在細胞吸附式, 可以很清楚地觀察到離子通道的活動在切割(excision)之後逐漸消失(或者 是變得活躍),這叫做run down (或run up) 現象,如果出現此現象,則提 示細胞內存在有維持和興奮離子通道的因子(或抑制因子)。 - 40 -
  56. 56. 2.3.3 開放細胞吸附膜內面向外式(Open cell-attached mode) 將上述細胞吸附式的膜片以外某部份的細胞膜進行機械性破壞,經 由被破壞處的孔洞來調控細胞內液,並且在細胞吸附狀態下進行膜內面 向外式的單一離子通道紀錄,若是要以這種模式來做研究的話,儘可能 選擇體積較大細胞,因為被破壞的部份會導致細胞質內因子外流的情 況,因此若是細胞質液的量較多或是破壞的孔洞儘可能縮小,會比較適 合。 2.3.4 傳統全細胞模式(Conventional whole-cell mode 或 Hole cell mode) 在細胞吸附模式上將膜片處吸破成為一開孔,以記錄膜片以外部份 細胞膜全部離子通道的離子電流,此稱為全細胞模式。最近,在全細胞 模式(Whole cell mode)前面加傳統(Conventional)兩個字,或者改稱為孔細 胞模式(hole cell mode),其目的是為了要與後述的穿孔膜片式(Perforated patch mode)相區別。在此傳統全細胞模式下,透過這個膜片處的開孔可 以用電極腔內液對細胞進行透析,藉此可以控制細胞內的環境,但是相 對的,此時細胞內的可動小分子亦可以從此孔洞漏滲(washout)到玻璃微 電極的腔內液中,這是非常需要注意的地方,此外,這個模式也可以在 電流鉗制的情況下測定細胞內電位。 - 41 -
  57. 57. 2.3.5 膜外面向外式(Outside-out mode) 將上述的全細胞模式,將玻璃微電極向上提起可得到切割分離的膜 片,由於它的細胞膜內側,面對著玻璃微電極腔內液,而細胞膜外側面 朝外且會自然封閉,所以這個模式被稱為膜外面向外式,利用這種模式, 可以在自由改變細胞外液的情況下,紀錄單一離子通道的電流活動,當 然在這種情況下也不該忘記細胞質內離子通道調控因子會被忽略的可能 性。 2.3.6 穿 孔 膜 片 式 (Perforated patch mode) 或 緩 慢 全 細 胞 式 (Slow whole-cell mode) 為克服傳統全細胞模式的細胞質漏滲問題,Horn和Marty將與離子親 和的制真菌素(nystatin)或兩性黴素 B(amphotericin B)經玻璃微電極灌流 到含類甾醇的細胞膜片上,形成只允許一價離子通過的孔洞,因此可以 阻止許多重要的細胞質因子漏滲,利用此方法在膜片上做很多導電性孔 洞藉此對全細胞膜電流進行紀錄,這個方法被稱為穿孔膜片式或制真菌 素膜片模式(nystatin-patch mode),此外,因為此模式下,細胞質與細胞外 電解液的交換速度極為緩慢,局部串聯電阻(series resistance,Rs)較傳統 全細胞模式來的高,所以鉗制速度會很慢,也因而稱為緩慢全細胞模式。 - 42 -
  58. 58. 2.3.7 穿孔囊泡膜外面向外式(Perforated vesicle outside-out mode) 以上述的穿孔膜片式將玻璃微電極向上提起,之後膜內面向外式的 膜片斷端會融合封閉,因此在微電極的尖端處就形成了一個囊泡膜,如 果條件控制得當,此囊包內不單單會有細胞質內因子還可能有粒線體等 胞器存在,所以在比較接近正常的細胞內信號傳遞條件和代謝條件之基 礎上,也可能記錄到膜外面向外式的單一離子通道行為。 2.4 膜片鉗技術的優缺點 膜片鉗技術最主要之優點在於巨阻抗封接形成的結果使漏出的電流 極少,所以能正確的進行電位固定的動作,然而其缺點是,在形成巨阻 抗封接時,由於腔內負壓的環境使膜片被吸入微電極腔內後,形成所謂 的”Ω”型膜片,造成不可避免的機械性刺激。 由巨阻抗封接帶來的第二大優點就是背景雜訊極低,因為由熱雜訊 (Johnson noise)引起的漂移標準誤差與阻抗的平方根值成正比,所以當巨 阻封接形成時,可以將此影響降至極低,此外,雖然所使用的膜片鉗放 大器為場效電晶體構成的運算放大器其雜訊較少,但是此時任何雜訊都 不容忽視,而當封接阻抗(seal resistance,Rseal)值越大,玻璃微電極在工 作時產生之阻抗性電流雜訊也隨著減小,故此干擾也可因為巨阻抗封接 而大大減少。 在膜片鉗制技術發展出來之前,在電壓固定條件下進行的細胞膜電 流記錄法,只能向細胞內刺入電極或者用蔗糖和凡士林進行雙重縫隙法 - 43 -
  59. 59. (dual gap)從細胞外進行記錄,但是這兩種方法只適用於非常大的細胞, 反觀膜片鉗技術,對於一般較小的細胞也能在電位固定的條件下紀錄出 膜電流,這也是膜片鉗方法的一個很大的優點,此外膜片鉗技術還可以 直接地控制細胞內環境的優點,而對於之前所述的細胞質中一些較小的 可動分子會發生漏滲的情況,這是其稍嫌不足之處。 2.5 傳統膜片鉗技術的操作步驟 2.5.1 玻璃微電極的製作 2.5.1.1 拉制(Pulling) 玻璃微電極是將玻璃毛細管用拉管(puller)拉制而成,在全細胞模式 記錄時,用軟質蘇打玻璃管(也可以直接使用血球容量計或微升吸量管) 即可,而在單一離子通道記錄時,則應該選擇導電率低、雜訊小的硬質 硼 矽 酸 鹽 (borosilicate) 性 玻 璃 ( 如 Pyrex) 或 更 硬 質 的 鋁 矽 酸 鹽 玻 璃 (aluminosilicate玻璃)。由於玻璃微電極不是刺入的,因此尖端的形狀不宜 尖銳,所以應儘可能地使尖頸部(靠近尖端的部份)短粗些(即使電極尖部 短一些)這樣也可以減低Rs,通常利用兩次或是多次性拉制的電極比一次 性拉制的容易得到適用者,由圖 2.3 中兩次拉制的玻璃微電極和一次拉制 在形狀上比較即可以明顯發現Rs’>Rs”,而一般使用的微電極尖端直徑為 1~5μm,充灌林格氏液之後阻抗約為 1~5MΩ,由於玻璃微電極最忌諱沾 染灰塵或是其他粒子,更忌諱觸碰到尖端附近部份,所以盡量要求要在 當天使用之前製作。 - 44 -
  60. 60. 圖 2.3 ㄧ次拉致與二次拉致的玻璃微電極比較 2.5.1.2 塗矽酮樹脂(Sylgard coating) 在極短的時間內,欲記錄高頻開閉現象的單一離子通道小電流時, 背景的雜訊除了熱雜訊和封接阻抗雜訊外,最成問題的是從浸在溶液中 的玻璃微電極產生的浮游電容(stray capacitance,Cs)雜訊,而減少 Cs 雜 訊的方法是在微電極尖頸部的裡面塗一層具有疏水性、非導電性的物 質,通常會使用矽酮樹脂,將此樹酯塗於微電極的最尖端以外的部份, 並將其以透過鎳鉻電阻線圈的加熱而烘乾變成固狀。經過這樣的處理之 後,浸入溶液中的微電極的表面會成為疏水性,其外表面形成一層水膜 可防止電容的增高,同時,玻璃的電容(Cg)與矽酮樹酯層電容(Cc)實際上 是串聯的,結果使微電極整體電容量驟減,圖 2.4。 - 45 -
  61. 61. 圖 2.4 玻璃微電極塗上矽酮樹酯的電容模型 2.5.1.3 熱拋光(heat polish) 在顯微鏡觀察下,將微電極尖端接近熱源,如通電加熱的白金絲等, 進行熱拋光處理可以提高巨阻抗封接的成功率,這是因為經過熱拋光處 理,玻璃微電極的尖端表面會變的更加寬闊與圓滑的緣故。塗矽酮樹酯 時,若是將樹酯的溶劑塗到尖端的部份而阻礙巨阻抗封接的形成,則在 做熱拋光處理時也可以除掉此情況。 2.5.1.4 充灌電解液(solution filling) 用於充灌微電極的液體需要經過微孔濾膜過濾,除去可能會妨礙巨 - 46 -
  62. 62. 阻抗封接形成的粒子(particle) 通常將一次性注射器的過濾膜(孔徑 0.2μm) , 裝在注射器內使用來取得電解液,而充灌的方法很多,在微電極尖端較 粗的情況下,用注射針或聚乙烯的細塑料管直接從電極尾部充灌即可, 這種方式叫做反向充灌(back-fill)。而在尖端較細的情況下,首先將電極 尖端浸於此液中,利用毛細現象,或是抽吸注射器加負壓,使得只讓尖 端部份充滿液體,然後再從其尾部充灌,如果過程中有產生氣泡,只要 讓微電極的尖端部份朝下,用手指輕彈幾下管壁即可去除,一開始電解 液不需要充灌太多,否則在將探針插入玻璃微電極時,可能會有電解液 溢出,若是滲入其他儀器內部會造成故障。 2.5.2 巨歐姆阻抗封接(Gigaohm seal)的形成 本文在接下來的部份將綜合討論一般使用玻璃微電極做膜片鉗制時 的後級量測放大器,因此接下來將會有許多操作放大器時調校之參數或 是旋鈕名稱,而這裡將以美商HEKA公司所出產的EPC-7 型為主,在網頁 http://www.heka.com/download/manuals/m_epc8+7.pdf 內有此型號之使用 手冊供參考。 首先將膜片鉗放大器的紀錄模式調到 Search 檔,接下來,因為在形 成封接之前,是屬於低阻抗的狀態,極微小的電壓變化都可能會帶來巨 大的電流變化,所以在電壓箝制(Voltage clamp,VC)模式下,信號可能會 從示波器螢幕上突然消失(off scale),為了防止此情形發生,應先將放大 器的增益檔設置在較低的檔次。 - 47 -
  63. 63. 將玻璃微電極浸入溶液中,然後給其施加一個正壓,可以利用電極內 液和浴液液面差產生之靜水壓來施加,以防止氣液介面上沈降的灰塵或 是溶液中的粒子附著在電極尖端而妨礙巨阻抗封接的形成,接著使電極 接近細胞(還不用接觸到細胞)按下放大器的 Reset 鍵做歸零的動作,然後 調整 Vp-OFFSET 旋鈕,把要作為銀到氧化銀電極的分壓或是電極內液到 浴液之間的擴散電位等等總合之電極電壓(Vp)補償到零。 接下來外加一個振幅 1mV 週期 10~50ms 的方波,並且觀察此時所對 應的電流值,將電壓值除以電流值可以得到起始的電阻值,然後將玻璃 微電極尖端接觸細胞,此時應停止給予微電極腔內的正壓,甚至可以給 予一個負壓,如果發現螢幕上的電流突然變成零,電流雜訊也隨之減少, 則表示巨阻抗封接可能已經形成了,然後將輸入方波電壓振幅調成 10mV,若發現電流也大致上可以保持在零的狀況,這樣就幾乎可以確定 封接已經形成了,之後就可以將加在電極腔內的負壓停止了,有些需要 注意的是某些細胞比較難以形成巨阻抗,所以會先利用蛋白質分解酶預 先對細胞表面稍微進行處理。 2.5.3 單一離子通道記錄 在取得巨阻抗封接之後,將放大器的紀錄模式從”SEARCH MODE” 變換到”VC(Voltage Clamp) MODE”,而當輸入方波在 On 與 Off 交界處時 會出現漂移電流(Surge current),此被稱為瞬時電容電流(fast transient),他 是由電極的寄生電容容量而產生的,對此只需要調節膜片鉗放大器上 - 48 -
  64. 64. 的”C-FAST”和”r-FAST”旋鈕即可補償(補償方法將在後面敘述) 在電路上 , 消除,另外,此寄生電容和浸在溶液中的玻璃微電極表面積成正比,也 就是說,若是盡量減少電極浸於液體中的長度,可以縮小此一寄生電容。 在此時進行的單一離子通道電流記錄法即為細胞吸附式,或稱為 On-cell 記錄法,此時將放大器的增益調到較高的檔次(50~200mV/pA)。 若此時將電極的電位鉗制於 Vp,膜片上的電位差(Vm)就成為細胞內電位 (Vin)減去 Vp,並假設細胞膜外為含高濃度鉀離子之電解液,則細胞內電 位大約為零,因此可以看成 Vm= -Vp。 以細胞吸附式將玻璃微電極提起,將吸附在電極尖端的膜片切割 (excised)下來,即可以進行膜內面向外式的記錄,此時因為膜片的細胞內 面暴露在浴液中,所以可以直接調控細胞內面的成分,當然現在 Vm= -Vp,同理可知若是從全細胞模式提起微電極獲得膜外面向外式,則此時 Vm=Vp。 2.5.4 全細胞記錄 在細胞吸附式下施加一個負壓(-30 ~ -200cm H2O)入玻璃微電極腔內 . 破壞膜片,或用高壓電給予電擊(zapping)破膜片,要注意電流盡量不要超 過 20nA並事先將放大器的增益調小至 10mV/pA左右,之後即獲得傳統全 細胞模式,在模式改變之後膜片處的寄生電容量一定會隨之改變,因此 也會出現新的漂移電流(Surge current),這時的電流稱為緩慢電容電流 (slow transient)。 - 49 -
  65. 65. 如 果 將 膜 片 鉗 放 大 器 的 記 錄 模 式 轉 換 為 ”CC(Current Clamp) MODE”,則可以記錄在電流鉗制模式下的細胞內電位,將模式設定 為”CC+COMM MODE”時,可以進行電刺激並可以誘發和記錄動作電位。 調節”V-HOLD”旋鈕可以將鉗制的電位(Holding potential)設定至想要 的大小,若切換到”VC MODE”時可以記錄到在膜電位固定時的全細胞膜 電流的總和,此時當然 Vm=Vp,然而需要注意的是為了可以觀察記錄到 正確的應變電流,當細胞吸附式換成全細胞模式或是其他可能改變寄生 電容的情況下,應當先將緩慢電容電流利用”C-SLOW”和”C-SERIES”旋 鈕進行補償,補償完成後查看 ”C-SLOW”和”C-SERIES”旋鈕的刻度可以大約得到膜電容(Cm)和局部串 聯電阻(Rs)的值,另外,由於在全細胞模式下的電流會比較大,因而局部 串聯電阻的上的壓降也會比較大,造成此壓降變的不可忽視,這時就必 須調節”%-COMP”旋鈕來盡量消除壓降,此動作稱為局部串聯電阻補償 (Series resistance compensation) 但電阻補償完後能須重新調整”C-SLOW” , 和”C-SERIES”。 在全細胞模式下,細胞外液可以隨意改變,但是要交換細胞內液是 需細胞內灌流的特殊技巧。 在單一離子通道的通透性非常小的情況下,細胞吸附式或其他切割 膜片的模式觀測不到單一離子通道的活動(single channel event) 此時可以 , 透過對全細胞電流的雜訊分析來得到單一離子通道的通透率;反之,在 離子通道密度非常小的情形下且所觀察的單一離子通道的通透率非常大 時,即使在全細胞模式下的記錄也很可能只觀察到單一離子通道的活動。 - 50 -
  66. 66. 2.5.5 制真菌素(nystatin)穿孔膜片鉗法 緩慢全細胞記錄(slow whole-cell recording)法是一種旨在克服傳統全 細胞模式中胞質漏滲的問題而設計的技巧,然而在技術上還是有存在一 些缺點,制真菌素用高濃度(50mg/ml 左右)的 DMSO 溶解保存,縱使保 存在-20°C 下也只能持續幾天,然而在實驗開始之前將其溶於電極內液 中,因為溶解度的關係有時候用超聲波震盪也難以溶解,而殘留的粒子 往往會阻礙巨阻抗封接的形成,制真菌素溶於水中只能使用 1~2 小時, 而高濃度的 DMSO 對細胞也會有傷害。 建立了 perforated patch 之後再進行 excise 時,如果膜片斷端能夠很 好的融合,電極內液側可獲得具有 nystatin 孔的囊泡(perforated vesicle), 藉此,在保持細胞代謝系統或信號系統完整的狀態下,可獲得 outside-out mode 的單一離子通道記錄。 2.6 膜片電容測定法 2.6.1 膜片電容性漂移電容的測定法(Capacitive surge measurement) 在全細胞膜片鉗模式下給予一個振幅V0方波時可用式 2-1 表示其應 變電流 V0 Rm -t RmRsCm I(t) = ( ) × (1+ )exp( ) , where τ = (式 2-1) Rm+Rs Rs τ Rm+Rs ,等效電路如圖 2.5,式 2-2 右邊第二項即為飄移電容電流,將其做積分 - 51 -
  67. 67. 處理可以得到總電荷值 q ,而 q 會與 V0Cm 相等因此求出 Cm 值,假如 Rm>>Rs 的條件成立並且在玻璃微電極施加一個三角波,且波形為V=βt 時則應變電流方程式成為式 2-2 V dV βt I(t) = ( ) + Cm( )=( ) + Cmβ (式 2-2) Rm dt Rm 可以發現應變電流無論何時都只是伴隨著 Cmβ 項的簡單形式,所以可以 從應變電流的躍升值(jump value)來估算 Cm 的大小,然而,在實際上 Rs 和 Rm 在值很接近的情況下,對 Cm 的測定還是相當不簡單的。 圖 2.5 膜片電容測定等效電路 - 52 -
  68. 68. 2.6.2 相位敏感性檢測法(phase-sensitive detection method,PSD method) 假如 Rm>>Rs,則輸入的高頻交流訊號在疊加之後,電阻性電流和電 容性電流之間有 90 度的相位差,對此可以利用鎖相放大器 (Lock-in amplifier)來進行分離觀測,Neher 和 Marty 將這個原理應用於傳統全細胞 模式,對於細胞外吐(exocytosis)過程中膜表面積的增大,用膜電容的增 加來進行測量,發展和建立了相位敏感性檢測方法,然而實際上,由於 Rs 是串聯在 Rm 上的,因此完全正交的看法並不算正確,真正實驗上時 必須交替的操作與觀察出他們的相位差 φ 使得電阻上的些許變化也不會 , 影響到”電容性”的電流觀察,電容些許的變化也不會影響到”電阻性”電 流,利用這個方式來求出膜電容。 用 PSD 法可以測定 0 度電流、90 度電流或輸入阻抗,如果 Em 是已 知的,透過一些計算可以求出未知參數 Cm、Rm 和 Rs,只是有些特殊情 形下還是不能使用此方法,像是伴隨離子通道激活(膜阻抗和膜電位會發 生大變化)的胞吐情況下就不行。 2.7 參數補償 2.7.1 瞬時電容電流補償(fast capacitance compensation) 巨阻抗封接時的電容性漂移電流(capacitative surge) 主要是對於微電 , 極電容所形成的寄生電容(Cp)進行充電所引起的,如果Cp太大將引起放 大器輸入飽和,即使Cp不是非常大,再將輸入訊號疊加上一個指令脈衝 (VCMD)後也會立刻引起快速應變電流的漂動 因為微電極的寄生電容與浸 , - 53 -
  69. 69. 入浴液中的玻璃表面積成正比,所以應盡量縮短浸入電極的長度,此外, 由於微電極電容與玻璃的導電性成正比而與玻璃壁的厚度成反比,使用 硬質的厚壁玻璃較適當,此外再塗上矽酮樹酯的方法可以使Cp大幅減小。 採取了以上措施減少Cp後,殘餘的部分仍可以用膜片鉗放大器內設 的補償電路,圖 2.6,來補償,即透過緩慢地增減調節VCMD輸入後的第一 級積分電路和運算放大器(A3)前方的第二級電路,來減緩VCMD輸入後瞬 間電流的不穩定。此積分波形的時間常數可透過第二級電路的可變電 阻 ”C-FAST” 旋鈕來調整,而其振幅可透過 A3 的增益 ”R-FAST”旋鈕來調 節,因此經由C1傳導對波形進行的微分可將電極電容性的漂移電流和逆 向電流導向探針,而大致上將寄生電容Cp消除。 圖 2.6 瞬時電容電流補償電路 - 54 -
  70. 70. 2.7.2 緩慢電容電流補償(Slow capacitative compensation) 在全細胞模式時,膜電容Cm由於局部串聯電阻(Series resistance,Rs) 的傳導而充電,因而發生了新的緩慢電容性電流,這時與Cm並聯的輸入 模阻抗(Rm)比Rs大得多,因此可以忽略它。現在假設Rs=5MΩ,Cm=20pF 的情況下,緩慢電容電流的時間常數也可以達到 100μs,而補償緩慢電容 電流的補償電路,圖 2.7,即利用與瞬時電容電流相同的補償方法,緩慢 地增減調節VCMD,此時將由R2和C2所形成的時間常數設定在比瞬時電容 電流補償大 100 倍左右的值,積分波形的時間常數能透過可變電阻 R2(”C-SERIES”旋鈕)和電容C2(”SLOW RANGE,pF”旋鈕)調節,其大小用 A4 增 益 ”C-SLOW” 旋 鈕 進 行 調 節 , 將 A4 輸 入 和 fast capacitance compensation用的放大器A3的輸入進行累加,最後經過C1的傳導成為積分 波形,再將逆向電流流入探針,則大致可以抵消掉緩慢電容電流。 圖 2.7 緩慢電容電流補償電路 - 55 -
  71. 71. 2.7.3 局部串聯電阻電流補償(Series resistance compensation) 局部串聯電阻(Rs)是從測量對象的細胞膜以外部份所產生之阻抗,主 要是由玻璃電極和膜片碎片所產生的,此Rs如果和從RsCm所產生的緩慢 電容電流 (SLOW transient) 的問題包括在內,在電流較大的全細胞紀錄 時,此時電流流經Rs所產生的電壓下降是一個很大的問題,例如,Rs=5 MΩ,微電極紀錄電流Ip=2pA時,Rs上的壓降導致鉗制電位的誤差會達到 10mV , 則 此 電 壓 下 降 部 份 會 因 為 可 變 電 阻 ( 圖 2.8 中 的 Rs compensation,”%-COMP”旋鈕)而分壓了百分之幾的電壓輸出,並將其作 為補償電壓加於VCMD後再返回探針而補償了Rs電流。 圖 2.8 局部串聯電阻補償電路 - 56 -
  72. 72. 第三章 晶片設計 本文中的目的除了著重於能使用微機電製程將此膜片鉗晶片實現之 外,更進一步的希望能透過實驗的參數設計與測試,藉以得到穩定的製 作流程,使得本文所製作出來的晶片除了能達成之前所設計製作的功 能,甚至更優越,又再考慮到製作的成本、良率與再現性的問題,並想 辦法加以解決。 3.1 先前的晶片設計、製作流程以及其改進策略 本實驗室在經過兩年的開發與設計,已經能製作出一個性能優良的 膜片鉗晶片,製程圖如下圖3.1,並由其完成圖中可以看出來,晶片正面 有一個高起可以用來進行軟微影的平台,平台中央處的微孔洞可以用來 進行細胞膜的鉗制,但是礙於某些製程步驟的實驗再現性太低,使得晶 片的良率最高只能到達六成左右,以下將先以圖文介紹此晶片原本的設 計製作流程,再指出其中會導致實驗再現性低的一些關鍵點,並提出其 改進的策略。 - 57 -
  73. 73. 步驟一:晶圓清洗 525um 步驟二:微影 步驟三:RIE蝕刻 步驟四:成長二氧化矽1μm - 58 -
  74. 74. 步驟五:微影 步驟六:BOE濕蝕刻 步驟七:TMAH濕蝕刻 步驟八:BOE濕蝕刻 - 59 -
  75. 75. 步驟九:微影 步驟十:BOSCH ICP 步驟十一:二氧化矽成長 圖3.1 先前的晶片製程圖 此晶片製作流程比較可能出現問題的步驟為步驟三、四、五,實驗 再現性會較低的步驟為步驟七,以下將針對這些步驟做探討與思考是否 - 60 -
  76. 76. 能再做改進。 步驟三到步驟四是晶片平台的微影與RIE蝕刻,此兩個流程本身沒有 問題,但是到了步驟七TMAH蝕刻之後就可能會出現瑕疵,因為RIE蝕刻 之後的Wafer表面就會比較不平整,而經過步驟四再成長氧化層,很可能 會使得氧化層的結構不夠緻密,或是在某些出現直角的地方會因為氣體 流動不均勻導致缺陷,而在經過長時間的TMAH蝕刻後,這些錯誤很可 能會放大,此步驟的濕蝕刻不只是要在高溫(80°C~90°C)下進行,而且動 輒十幾個小時的常時間浸泡,蝕刻時攪拌子處還會不停的產生氣泡衝擊 晶片正面,一點點的氧化層針孔(pin hole)或是過薄處,都會導致蝕刻穿 孔,若是剛好發生在晶片平台上或是附近都難保只有1μm~2μm高度的平 台不會造成傷害,而本文的解決策略為將晶片平台的製作步驟往後移, 以盡量確保TMAH蝕刻時保護晶片表面的薄膜平整度,並且改善夾具, 大量減少攪拌子的氣泡衝擊,經過實驗之後的結果可以發現確實有效降 低穿孔的情況。 步驟五的微影步驟問題,可以大致上細分成兩方面來討論,第一, 此微影步驟是使用微機電製程中之體加工技術,因此必須用到背面對準 (back side alignment)曝光,而我們知道背面對準的誤差會較大,以同一台 曝光機來說,若是正面對準精確度可以到達1μm,而經過良好設計的背面 對準系統,背面的準確度最好也只能達到4μm以上,而製作此晶片的曝光 機正面對準的精確度大約為4μm,由此,誤差的產生是可想而知的;第二, 在此步驟的光罩設計為了節省製程成本是採用塑膠光罩,而我們知道塑 膠光罩本身的誤差就大於20μm,因此此光罩上面的alignment key圖形除 - 61 -
  77. 77. 了會形變之外,也會發生位移的情況,所以接下來以BOE開出來的背面 蝕刻孔,相對於晶片正面的平台不一定能夠處於非常正確的位置,有很 大的機率會錯位,也因為這樣,此晶片設計在完成TMAH蝕刻之後,蝕 刻停止面之矩形必須控制在50μm×50μm以上,減少錯位的機會,但是如 果此矩形面積增加,則TMAH蝕刻後薄膜的厚度也必須相對上升,防止 結構強度不夠而易產生損壞,然而,此晶片微孔洞必須維持3μm的大小的 情況來說,厚度增加,則蝕刻選擇比也必須大量增加,無疑會增加後續 的製程難度與成本,而本文的解決策略也可分為兩個方向,第一個是前 述的,將平台製作之流程往後移,使光罩上平台的圖形能直接去對準蝕 刻停止面之矩形,而大量減少錯位的情況發生;第二個是改變製程的材 料,使得此對準步驟利用正面對準即可完成,更加精確。 步驟七的問題事實上與上一個問題是相關的,依照此晶片原本的設 計,在TMAH濕蝕刻到設定的停止面時,也就是當在顯微鏡下觀察矩形 之面積若是縮到預定的大小時,剩餘薄膜的厚度應該會如預期的剩下 20μm左右,但是我們知道,這樣嚴格的要求對如此長時間的濕蝕刻是非 常難以達成的,因為TMAH的蝕刻,溫度的改變會影響其對Si Wafer的各 個結晶面的選擇比,溫度越高,選擇比越差,對長時間的蝕刻來說,只 利用觀察底面矩形的面積來判斷剩下的厚度還是不能夠很準確,而且在 當蝕刻終止點快要到達的時候,必須常常將晶片取出來,用DI Water稍做 清洗後在拿到顯微鏡下觀察,如果未到達所求則繼續浸泡,而這樣的冷 卻、加熱的重複動作事實上也稍微會造成終止點的誤判,此晶片最大的 難題就是出現在此步驟,膜厚難以確定的結果,會造成後續的ICP製程難 - 62 -
  78. 78. 以拿捏確切的蝕刻深度,而本文的解決策略為改變製程材料,使TMAH 蝕刻終止點會出現在兩不同材料之間的介面,可以非常明確,濕蝕刻結 束後的薄膜厚度也能精確的控制。 針對以上所有問題的詳細改進策略與實驗安排,將在後面的文章中 再進行敘述。 3.2 本研究之晶片設計 針對先前的晶片缺點,本文中所做的改變為不採用矽來當作結構 層,而是採用二氧化矽或是氮化矽來當作結構層,其好處有以下幾點: (1)濕蝕刻化學選擇比高: TMAH溶液不管是在多少的溫度之下,對於二氧化矽或是氮化矽的 蝕刻率都極微小,用來作為蝕刻停止層(Etching stop layer)時,就算是不 小心晶片浸泡的時間比預期還長很多 還是不用擔心過蝕刻(Over etching) , 的情況發生,另外,就算蝕刻液有發生漏滲的情況造成穿孔,TMAH也 不會對細胞平台做破壞,多了一層保障。 (2)結構層厚度拿捏容易: 不管是要拿二氧化矽或是氮化矽來當作結構層,以本文中所使用的 沉積製程來說,二氧化矽是採用氧化製程加上電槳輔助化學氣相沈積製 程;氮化矽是採用低壓化學氣相沉積製程加上電槳輔助化學氣相沈積製 程,以上無論是哪一種製程以目前的技術來說,把厚度的精準度控制到 - 63 -
  79. 79. 數十奈米的程度是輕而易舉的,因此在後續ICP製程中蝕刻的深寬比參數 設計,則也能夠相對明確。 (3)材料本身透明: 若是結構薄膜為透明的話,在到達濕蝕刻終止點時,會發現晶片上 面出現陣列狀的透光點,可以根本不需要再用顯微鏡觀察,以肉眼就能 夠做即時辨別,因此就算是要進行快到達終止點之前的觀察,將晶片取 出後,不需要將晶片用去離子水清洗吹乾,只要讓TMAH溶液大致上滴 幾下,就可以拿起來看,就算是還沒到達終止點必須再繼續浸泡,晶片 的溫度也不會跟拿出來之前相差很多,儘可能地減少蝕刻進行時的環境 變異,提升實驗再現性;另外,在濕蝕刻結束後的平台製作微影步驟中, 從曝光機用來做正面對準的顯微鏡中,就可以清楚觀察到蝕刻停止面之 矩形的形貌,因此能夠將光罩上面的平台的圖案直接與其對準,有點類 似自我對準(self alignment)的感覺,大量改進先前晶片需要背面對準的不 準度。 3.2.1 光罩設計 本文的晶片設計共採用了三層光罩,以下分別對三層光罩的設計理 念以及圖樣安排做介紹: 第ㄧ層(膠片光罩,不需要定義 alignment key): 此光罩在圖案上的安排理念是,可以讓九個元件以陣列式的方式平 - 64 -
  80. 80. 均分布在一平方公分之內,此光罩設計的目的是要定義出背面濕蝕刻開 孔的位置、大小以及形貌,本文中所設計的開孔的形狀為正方形,而其 邊長為 640μm,從理論上來說,若是按照計算,假設 Wafer 的厚度為 525μm,並且希望蝕刻到底部停止層時的矩形邊長寬度為 15μm 大小,再 假設 TMAH 對 Si-100 面與 Si-111 面的選擇比為 30:1,則正方形的開孔 本來應該定義為 723μm 左右,但是我們可以發現此光罩設計的開孔大小 為 640μm,而為何採用這樣的大小,因為按照本文在實驗中的觀察, TMAH 對 Si-100 面與 Si-111 面的選擇比並不如想像中理想,從下圖 3.2TMAH 蝕刻完畢照片內可以看出來,蝕刻阻擋層下面的矽被掏空的距 離去計算,選擇比會較 30 小得多,另外,依照本文的實驗結果中發現, 若是將蝕刻液的溫度維持在 80°C 以下,TMAH 溶液可以大約維持這樣的 選擇比(30 左右),但若是將溶液升高到 80°C 以上,可以發現選擇比會開 始降低,甚至如果將溫度與選擇比做圖,可以發現當溫度升高到 90°C 左 右,還會發現選擇比開始大量下降,初步觀察的結論為,可能在溫度升 到 90°C 以上之後 TMAH 對 Si-111 面的蝕刻率開始大量上升 而對 Si-100 , , 面的蝕刻率上升幅度較小,所以造成此現象的發生,但是由於此部份不 是本文所著墨研究的範圍,因此並沒有對此現象更深入去做量化的研究 與探討,只針對實驗中的觀察、經驗以及感想指出可能的情況,當然也 是很有機會是其他因素,如是否為蝕刻液滲入蝕刻阻擋層與矽之間縫隙 之類的問題等,下圖 3.3-(a)和圖 3.3-(b)為此光罩之兩種不同安排圖樣。 - 65 -

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