Fisiologia comparada USP 2010

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Material criado pelo Curso de Inverno da USP com o título "Tópicos em Anatomia Comparada".

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Fisiologia comparada USP 2010

  1. 1.  
  2. 2. Comissão OrganizadoraAmanda de Moraes NarcizoCamila Helena de Souza QueirozCamila Lopes PetrilliCláudia Emanuele Carvalho de SousaDiego Jose Belato y OrtsFelipe Viegas RodriguesKelly Dhayane Abrantes LimaLeopoldo Francisco Barletta MarchelliMarco Antônio Pires Camilo LapaMaria Nathália de Carvalho Magalhães MoraesMarina Marçola Pereira de FreitasTatiana Hideko KawamotoCoordenador: Prof. Dr. Márcio Reis CustódioVII Curso de Inverno:“Tópicos em Fisiologia Comparativa”http://www.ib.usp.br/cursodeinvernoRealizaçãoPatrocínio
  3. 3. ApresentaçãoVII Curso de Inverno - IB/USP Pág. iAPRESENTAÇÃOA idéia da criação do Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa surgiuem 2002, quando alunos da pós-graduação do Departamento de Fisiologia Geral do Institutode Biociências da Universidade de São Paulo – USP, ansiavam a criação de um espaço quepossibilitasse alternativas de aprendizado complementar. Naquele momento de inquietude evontade discente, a decisão foi de empenho em realizar um curso no período de férias eoferecê-lo a graduandos e recém-graduados que almejassem ingressar na pós-graduaçãoem Fisiologia, ou mesmo para aqueles que se interessassem pelo tema de uma forma geral.Além disso, na última década, percebemos uma preocupação crescente emdescentralizar o desenvolvimento concentrado na região Sudeste do país e atingir áreasmais carentes tanto em pesquisa quanto em desenvolvimento humano. Em defesa desteconjunto de idéias e ações que a Comissão Organizadora do Curso de Inverno buscasempre ampliar o alcance do curso, colaborando cada vez mais efetivamente na construçãode um país com menos desigualdades.Sendo assim, o curso é voltado para alunos originários das diversas áreas doconhecimento que tenham interesse em Ciências Fisiológicas, mais especificamente emFisiologia Comparativa. Seu principal objetivo é promover discussões de conhecimentosfundamentais para uma boa formação em Fisiologia, assim como proporcionar uma vivênciano dia-a-dia da pesquisa do Departamento de Fisiologia do Instituto de Biociências - USP.Este livro visa complementar os conteúdos discutidos em sala de aula,proporcionando uma fonte adicional de consulta para os participantes. O livro é composto denove unidades que abrangem os mais variados temas dentro da Fisiologia Comparativa, osquais apresentam desde teorias básicas até as mais novas discussões da atualidade.Desejamos uma boa leitura a todos!Comissão OrganizadoraVII Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia ComparativaUniversidade de São Paulo5 a 23 de Julho de 2010
  4. 4. Mapa ConceitualPág. ii VII Curso de Inverno - IB/USPMAPA CONCEITUALNa tentativa de sempre melhorar a qualidade das aulas e a comunicação dos pós-graduandos, a edição 2010 do “Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa” foiorganizado em módulos conforme delineamento sugerido por um mapa conceitual, o qualmostra a interligação entre os diversos assuntos da Fisiologia e aponta as relaçõesexistentes entre os temas que serão abordados no decorrer do curso. Assim sendo, a partirdele, os módulos deste ano foram criados de acordo com as proximidades de cadatema. Desta maneira, podemos oferecer aos alunos participantes uma base mais sólida ecoesa a cerca da Fisiologia Comparativa, e ao mesmo tempo transmitiremos uma boa noçãoda diversidade de temas abordados no Departamento de Fisiologia.Mapa Conceitual mostrando as interligações existentes nos mais diversos temas abordados noDepartamento de Fisiologia Geral do Instituto de Biociências da USP, os quais serãoapresentados durante as aulas no Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa 2010.
  5. 5. SumárioVII Curso de Inverno - IB/USP Pág. iiiSUMÁRIOUnidade 1Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaCapítulo 1 O que é ciência e como praticá-la pág. 03Capítulo 2 Formulando perguntas em fisiologia comparativa pág. 09Capítulo 3 Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenhoexperimental e a estatística inferencial pág. 13Capítulo 4 O Fim da Picada: Comunicando Ciência pág. 17Glossário pág. 21Bibliografia pág. 22Unidade 2Sinalização CelularCapítulo 5 Comunicação celular: entendendo a ritmicidade endógena pág. 23Capítulo 6 Fisiologia celular do plasmodium durante a fase assexuada pág. 41Capítulo 7 RNAi: ouvindo a voz do silêncio pág. 49Bibliografia pág. 66Unidade 3NeurociênciasCapítulo 8 História da neurociência pág. 79Capítulo 9 Princípios básicos em fisiologia neural pág. 89Capítulo 10 Fisiologia sensorial pág. 103Capítulo 11 Neurofisiologia da visão pág. 115Capítulo 12 Causa e função pág. 121Capítulo 13 Percepção pág. 127Capítulo 14 Memória e seus aspectos evolutivos pág. 139Capítulo 15 Navegação espacial pág. 153Capítulo 16 Neurobiologia das emoções pág. 163Capítulo 17 Neurofisiologia da linguagem pág. 179
  6. 6. SumárioPág. iv VII Curso de Inverno - IB/USPCapítulo 18 Neurofisiologia da música pág. 187Bibliografia pág. 194Unidade 4MetabolismoCapítulo 19 Metabolismo e Temperatura: Conceitos e Implicações pág. 205Capítulo 20 Medindo a chama da vida pág. 217Capítulo 21 Ectotermia: um acesso de baixo custo à vida pág. 235Capítulo 22 Termorregulação em endotérmicos: febre e anapirexia. “Ana” o quê?pág. 247Capítulo 23 Metabolismo energético em câmera lenta: mecanismos de depressãometabólica sazonal pág. 257Capítulo 24 Custos e benefícios da reprodução: papel dos lipídios pág. 269Capítulo 25 A ecofisiologia no cenário das mudanças climáticas globais pág. 279Bibliografia pág. 286Unidade 5Neuroendocrinologia ComparadaLista de abreviações pág. 301Capítulo 26 Neuroendocrinologia comparada: análise comparativa entre o encéfaloe a hipófise de peixes e mamíferos pág.305Capítulo 27 Neuroendocrinologia comparada: o encéfalo e a hipófise de anfíbios,répteis e aves pág. 323Capítulo 28 Sistema neuroimunoendócrino pág. 337Bibliografia pág. 348Unidade 6Ecotoxicologia AquáticaCapítulo 29 Metal não essencial: o cádmio e seus efeitos pág. 361Capítulo 30 Transporte de Metais Essenciais em Organismos Aquáticos: o cobre eo zinco pág. 371
  7. 7. SumárioVII Curso de Inverno - IB/USP Pág. vCapítulo 31 Efeitos da toxicidade de metais no metabolismo de organismosaquáticos pág. 381Capítulo 32 Alterações neuroendócrinas resultantes da exposição a metaispág. 395Bibliografia pág. 407Unidade 7Fisiologia Comparada de Invertebrados Marinhos: Trocas Gasosas,Digestão e Sistema ImuneCapítulo 33 Trocas gasosas em invertebrados marinhos pág. 427Capítulo 34 Adquirindo energia: formas de alimentação e digestão em inverte-brados marinhos pág. 435Capítulo 35 Sistema Imune de Invertebrados marinhos: mecanismos, funções esimilaridades pág. 455Bibliografia pág. 467Unidade 8Fundamentos de ToxinologiaCapítulo 36 Co-evolução entre peçonhas e seus alvos pág. 473Capítulo 37 Produtos naturais e sua função como defesa química pág. 483Capítulo 38 Invertebrados marinhos: toxinas e seus mecanismos de ação pág. 493Capítulo 39 Lepidópteros: aspectos biológicos e toxinológicos pág. 501Capítulo 40 Raias – biologia e envenenamento pág. 511Capítulo 41 Serpentes peçonhentas do Brasil: biologia, fisiologia e epidemiologiapág. 519Bibliografia pág. 535
  8. 8. SumárioPág. vi VII Curso de Inverno - IB/USPUnidade 9Quantificação e Análise de DadosCapítulo 42 Quantificação de Fenômenos Fisiológicos pág. 547Bibliografia pág. 564
  9. 9. Unidade 1Método Científico Aplicado a Estudosem Fisiologia ComparativaCoordenador: Agustín Camacho GuerreroLaboratório de Herpetologiaagustin.camacho@usp.brEste capítulo tem três objetivos. A) Apresentar aos leitores os principais métodos usadospara gerar conhecimento científico, B) Mostrar como a fisiologia comparativa pode valer-sede dois destes métodos: o método indutivo e o hipotético-dedutivo, C) Revisar o processo degeração de conhecimento, desde o levantamento de perguntas científicas até acomunicação dos resultados de um projeto de pesquisa, passando por apresentar as basesdo desenho experimental e a análise estatística. O fim último deste texto e as aulasassociadas é que os alunos tenham uma visão básica e estruturada do método científico.Com esta visão, espero que lhes seja mais fácil aprender no futuro sobre temas maisespecíficos (desenho experimental, estatística, comunicação da ciência, etc). No final docapítulo, existe um glossário que define termos importantes em negrito. Os termos estão naordem em que são encontrados durante a leitura, para facilitar uma consulta inmediata.Por que ler este texto?Infelizmente, muitos cursos em biologia colocam as disciplinas de método científico comooptativas, em lugar de inserir este tipo de preparo, ao menos nas disciplinas obrigatórias dagrade curricular. Deste modo, muitos alunos não têm um preparo mínimo para planejar,executar projetos científicos, nem comunicar os resultados obtidos. Como conseqüência, osprimeiros trabalhos de um aluno perdem em qualidade, diminuindo também suaspossibilidades de obter bolsas no futuro. Este capítulo pretende mostrar alguns conceitosbásicos e dicas para auxiliar aos alunos nos seus primeiros encontros com o trabalho depesquisador. Durante as aulas relacionadas a este módulo veremos estes conceitos daforma mais didática possível, mas neste capítulo tem informações e dicas úteis que nãoserão explicadas na aula.
  10. 10. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 2 Julho/2010Todos os capítulos revisados pelos profsDr. Pedro Ribeiro e Dr. Pedro Luis Bernardo da RochaCapítulo 1 O que é ciência e como praticá-la pág. 03Agustín Camacho GuerreroCapítulo 2 Formulando perguntas em fisiologia comparativa pág. 09Agustín Camacho GuerreroCapítulo 3 Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenhoexperimental e a estatística inferencial pág. 13Agustín Camacho GuerreroCapítulo 4 O Fim da Picada: Comunicando Ciência pág. 17Agustín Camacho GuerreroGlossário pág. 21Bibliografia pág. 22
  11. 11. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 3O que é ciência e como praticá-la.Agustín Camacho GuerreroLaboratório de Herpetologiaagustin.camacho@usp.brO que é ciência?Uma bonita forma de começar a preparar-nos é conhecer a etimologia da palavraque definirá nosso trabalho, talvez pelo resto das nossas vidas. A palavra ciência provém dolatim “scientia” proveniente do verbo “scire = saber”, este está relacionado com o verbo,também latim, “scindo = dividir”. Existem várias definições de ciência, mais ou menoscompletas, seja com ênfase nos seus objetivos ou nos métodos que usam. Uma definiçãobastante completa é:“1. The systematic observation of natural events and conditions in order to discoverfacts about them and to formulate laws and principles based on these facts. 2. Theorganized body of knowledge that is derived from such observations and that can be verifiedor tested by further investigation. 3. Any specific branch of this general body of knowledge,such as biology, physics, geology or astronomy.” Academic Press Dictionary of Science &Technology.Neste módulo, seguiremos uma visão de ciência como busca e comunicação deconhecimento, o mais confiável possível, sobre a natureza.Métodos conceituais de obtenção do conhecimento.Desde séculos antes de Cristo, filósofos, empiristas e estatísticos, tais comoAristóteles, Bacon, Bayes, Fisher, Popper, Underwood e Jaynes, vêm aprimorando osmétodos conceituais de obter conhecimento do mundo natural, de forma a obter maisconhecimento e com maior confiabilidade. Assumo que um passo necessário para sermosbons cientistas passa por conhecer os diferentes modos de obtenção de conhecimento. Acontinuação, lhe introduzirei aos métodos mais conhecidos e utilizados. Deste modo, esperojustificar um esquema unificado de obtenção de conhecimento que lhe facilite a assimilaçãode conceitos apresentados em futuros cursos de estatística e delineamento experimental.Vamos lá:No século IV a. c., Aristóteles definiu o raciocínio demonstrativo, ou lógicaaristotélica, em seis obras conhecidas coletivamente como Organon. De acordo comAristóteles, existem termos gerais (Ex. os homens) e termos particulares (Ex. Socrates) quese referem a subconjuntos dos termos gerais. Segundo este método, estes elementospodem ser identificados e, relacionando estes através de construções lógicas (silogismos),é possível derivar conhecimento novo e necessariamente certo (inferências). Nestasconstruções, a combinação de dois ou mais enunciados verdadeiros (Ex. todos os homens
  12. 12. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 4 Julho/2010são primatas; Sócrates é um homem) permitem inferir um novo conhecimento, tambémverdadeiro (então Sócrates é um primata). O sistema lógico inventado por Aristóteles, nospermite até hoje combinar observações consideradas certas para fazer crescer nossoconhecimento. Porém, Aristóteles não criou um sistema formal para a determinação daveracidade ou generalidade dos termos, fazendo com que esta determinação fosse, durantemuito tempo, feita com base no conhecimento prévio e subjetivo dos naturalistas.Em 1620, Francis Bacon rompeu com a tradição da lógica aristotélica propondoevitar que prévias doutrinas intercedam nas nossas observações. Para Bacon, só erapossível aumentar nosso conhecimento através da experimentação e das observações. Oconhecimento gerado permitiria, segundo ele, explicar de forma cautelosa, situaçõesrelativamente similares. Produzir explicações sobre grupos de casos gerais com base noque sabemos de casos particulares é definido por ele como indução. Para Bacon, esteconhecimento deveria gerar novos experimentos e ser testado em diversas situações. Eledefendia que os cientistas deveriam ser céticos acima de tudo, e não aceitar explicaçõesque não possam ser verificadas pela observação e experiência. Bacon, entretanto, nãoclarificou quantas nem como deviam ser feitas as observações para assumir umconhecimento como certo.Em 1670, Bayes elaborou um método lógico de atribuir uma probabilidade aafirmações geradas por indução. Este método é conhecido como lógica probabilísticaindutiva. Assume que a probabilidade de uma hipótese ser verdadeira pode ser calculadamultiplicando: A) nossa expectativa de que a hipótese seja certa, expressada em forma deprobabilidade prévia, vezes B) um valor de verossimilhança (likelihood) obtido a partir denovas observações (Bayes 1763). Desta forma, a probabilidade bayesiana fornece umamedida de quanto é razoável acreditar em uma hipótese usando toda a informação de quedispomos (Jaynes 2003). Um problema com este método é que as probabilidades préviaspodem mudar subjetivamente com o pesquisador, e isto afeta ao resultado final. Outroproblema é exposto na continuação.Karl Popper (1934) enunciou o Método hipotético-dedutivo, chamado tambémprobabilismo ou falsificacionismo. Segundo este método, não é possível derivarprobabilidades para asserções geradas por indução (Popper 1959) (ex. o simples fato deque todos os corvos que vi até agora são pretos, não permite calcular a probabilidade deque o próximo corvo que eu veja será preto, pois não conheço quantos corvos existem nomundo). Para Popper, o conhecimento deve estar justificado de forma lógica. Deste modo,ele defende que só podemos justificar de forma lógica a crença em uma teoria, em quantoprevisões derivadas logicamente desta estejam sobrevivendo a testes com base emobservações. Segundo este autor, a validade de uma teoria pode ser testada de quatroformas diferentes: 1) Determinando se as conclusões de uma teoria contradizem-se entre
  13. 13. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 5elas (Para este autor, você pode considerar “conclusões de uma teoria” sinônimo deprevisões, predições ou hipóteses). 2) Verificando a estrutura lógica da teoria, paradeterminar se esta é empírica ou é uma tautologia; 3) Comparando com outras teoriaspara saber se o fato de superar nossos testes suporia um avanço científico; 4) Testarempiricamente as conclusões. Para testar as conclusões, Popper propõe testar aquelas quevão mais de contra com a teoria e que possam ser mais severamente testadas. Um dosproblemas principais apontados a este método é que não gera crescimento da certezarelativa nas diferentes teorias, por considerar-se que sempre existirão infinitas possíveisteorias competindo para explicar cada fenômeno.Outros autores tem defendido o uso da verificação para aumentar nossa certezasobre teorias (Ex. Sober 1999 e Lloyd 1987, citados por Lewin-koh et al. 2004). Apesar doproblema lógico apontado por Popper, vários autores baseiam-se no procedimento de“verossemelhança máxima” popularizado por Fischer (Aldrich 1997) para defender que averificação de certas hipóteses em várias instâncias (ex. uma relação entre taxa deventilação e percentagem de O2 no fluxo sanguíneo dos pulmões foi observada em váriosvertebrados) permite obter confiança objetivamente mensurável sobre predições feitas paranovas observações (Ex. relação entre a taxa de ventilação e percentagem de O2 no torrentesanguíneo de um novo vertebrado que ventila). A representação matemática destasrelações é comumente chamada de modelagem. Onde os modelos podem serconsiderados representações matemáticas que descrevem ou relacionam variáveis.Em geral, podemos observar que os métodos de obtenção de conhecimento desdeBacon valem se de concepções que representam o que pensamos do mundo real (Ex.teorias, modelos, hipóteses) e seu contraste com observações do mesmo (tambémrepresentadas em forma de variáveis, amostras, etc). Na literatura, podemos encontrar umadiversidade de significados para estes conceitos em função do autor e a área da ciência(Suppes 1960). Pessoalmente, opino que para que grupos de conceitos sejam úteis e maisfacilmente ensináveis estes devem ter significados específicos e estar relacionados entreeles de forma lógica. Por isto, neste capítulo combinei a relação entre modelo e teoriaproposta por Suppes (1960) e a relação entre modelo e hipótese proposta por Underwood(1997). Desta forma estes conceitos ficam hierárquica e logicamente relacionados, e seussignificados são aceitáveis desde os diferentes modos de obtenção de conhecimento(compare com Jaynes 2003, durante sua apresentação de raciocínio plausível, umaabordagem verificacionista da obtenção de evidência). Assim, é possível inserir-los numprocesso unificado de obtenção de conhecimento científico que combina teoria eobservação. O mapa de conceitos na figura 1 representa tais relações.
  14. 14. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 6 Julho/2010SistemasbiológicosTeoriasModelosHipóteses(=predições)Variáveisdos que sederivamrelacionam oudescrevemrepresentados porcompostasporexplicampredizem valoressob determinadascircunstanciasFigura 1 - Relações lógicas entre conceitos centrais ao processo de obtenção deconhecimento. Mapa de conceitos baseado nas propostas de Suppes (1960) e Underwood(1997).O que é Fisiologia Comparativa?Em 1950, Prosser listou alguns objetivos da fisiologia comparativa como disciplina.Estes foram:1) Descrever como os organismos obtêm seus requerimentos no ambiente onde moram.2) Prover bases fisiológicas para entender a ecologia.3) Chamar a atenção sobre animais particularmente bons para estudar processosfisiológicos.4) Encontrar generalizações derivadas do uso de distintas espécies animais em estudosfisiológicos.Um campo com grande desenvolvimento da fisiologia comparativa é a fisiologiaevolutiva, que busca entender a evolução dos parâmetros fisiológicos (Garland & Carter1994). Uma vez que as técnicas moleculares têm acelerado nosso conhecimento dasrelações filogenéticas entre as espécies, muitos cientistas tentam desvendar processosevolutivos através da comparação de características em linhagens de espécies comfilogenias conhecidas (Wiens, 2008).Este campo da fisiologia comparativa nos proporciona um exemplo de como dois oumais métodos de obtenção do conhecimento podem ser combinados (Fig. 2). Imagine quequeremos saber se, em lagartos, morar em hábitats abertos provoca um aumento da taxa
  15. 15. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 7metabólica com relação a morar em florestas. Para isto, poderíamos comparar espécies deárea aberta com espécies de floresta. Assim, poderíamos obter que espécies de áreasabertas têm uma maior taxa metabólica (Fig. 2, esquerda). Entretanto, as espécies sãoelementos que apresentam relações filogenéticas. Imagine que estas fossem representadaspelo gráfico A, veríamos que as espécies de área florestada pertencem à linhagem daesquerda e as de área aberta à linhagem da direita. Poderíamos ter certeza que é o tipo dehábitat quem faz aumentar a taxa metabólica? Teríamos mais certeza se nossa hipótesefosse representada por B?taxametabólicafloresta áreaabertasp1sp2sp3sp4sp5sp6sp7sp8sp5 sp6 sp7 sp8sp1 sp2 sp3 sp4sp5 sp1 sp7 sp2sp6 sp2 sp8 sp4BAFigura 2. Comparação hipotética da taxa metabólica entre espécies de lagartos de áreas de floresta ede área aberta. Os cladogramas A e B mostram diferentes relações filogenéticas entre as espéciescomparadas. Sob a hipótese de parentesco A, as espécies de cada tratamento são aparentadas,implicando em que a taxa metabólica mais baixa pode ser devida a viver em floresta ou a sersimplesmente uma característica compartilhada do grupo. Sob a hipótese de parentesco B, a menortaxa metabólica não pode mais ser explicada pelo parentesco, pois em todos os pares de espéciesmais aparentadas a que mora na mata tem a taxa metabólica mais baixa que a que mora em umhábitat aberto.Hoje em dia, métodos indutivos (análise bayesiana) e verificacionistas (análise daverossimilhança máxima) estão entre os mais usados para escolher dentre hipóteses derelações filogenéticas (Amorim 2002). Por outro lado, tanto métodos falsificacionistas(Ex.Teste de Fisher) quanto verificacionistas nos permitiriam testar de maneira objetiva se ataxa metabólica aumenta em função do tipo de habitat, com base em amostras da taxametabólica das espécies referidas. Deste modo, os produtos dos diferentes métodos deobter conhecimento podem ser combinados dentro de uma disciplina científica. Porexemplo, na fisiologia comparativa. Você concorda com esta forma de proceder, ou opinaque só podemos confiar em um modo de obtenção de conhecimento? Aqui não é possível
  16. 16. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 8 Julho/2010estender-se mais sobre este assunto, mas lhe recomendo que consulte Sober (2008) antesde decidir-se.
  17. 17. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 9Formulando perguntas em fisiologia comparativaAgustín Camacho GuerreroLaboratório de Herpetologiaagustin.camacho@usp.brBuscando trabalho: como levantar uma pergunta a responder.Centremo-nos agora sobre o seu trabalho: fazer ciência. Você sempre deverácomeçar com uma pergunta que, para ter certeza de que vale a pena respondê-la, deveráter surgido do conhecimento do estado da arte da disciplina de interesse. Quandorealizamos perguntas baseadas sobre conhecimento levantando por outros pesquisadores,as chances de gerar um maior avanço científico se multiplicam. “Levante-se sobre osombros dos gigantes” diria Issac Newton. É necessário pensar duas vezes antes descreverum aspecto da fisiologia de uma espécie ou grupo de espécies sob o pretexto único de que“nunca foi estudado”. Isto pode estar escondendo o problema de que não sabemos o que émais relevante saber sobre nosso objeto de estudo (Peters, 1987).Existem várias ferramentas em internet e nas bibliotecas para encontrar esteconhecimento (Web of Science, Biological Abstracts, Zoological Records, GoogleAcadêmico etc.). Através destas ferramentes podemos procurar artigos ou livros que falemsobre nosso tema de interesse. É importante uma cuidadosa seleção de palavras chave,para encontrar o grupo de artigos que tratam o tema de nosso interesse (uma opção: use osconceitos relacionados na sua hipótese de estudo). Uma vez conseguidas algumasreferências devemos procurar o material. Nas universidades públicas brasileiras o portal deperiódicos da CAPES garante acesso a vários jornais científicos on-line. Em são Paulo, aFapesp ainda fornece acesso ao site Jstor, com artigos mais antigos. “O sistema COMUT debibliotecas brasileiras permite, mediante prévio pagamento, a solicitação de xérox ouarquivos ”.PDF” de quaisquer artigos ou separatas que se encontrem numa bibliotecabrasileira. Por último, você pode pedir diretamente ao autor ou conseguir na internet do seusite pessoal, ou site do laboratório onde trabalha. Exija da sua universidade maior acesso arevistas científicas e participe da solicitação de livros na biblioteca da sua unidade! Emseguida, leia organizadamente o material bibliográfico e busque mais entre as referênciasbibliográficas destes trabalhos. As perguntas podem surgir como hipóteses que refutam asprevisões centrais da teoria comumente aceita sobre um determinado tema, ou bem como anecessidade de dados sobre aspectos fisiológicos de determinadas espécies ou grupos quea complementam.
  18. 18. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 10 Julho/2010Como ser objetivo: Transformação dapergunta em um gráficoUma vez que tenhamos uma pergunta econfiamos em que esta tem relevância suficientepara investir o esforço necessário, deveremosformulá-la da maneira mais clara possível. Isto éfundamental para: A) determinar o que queremosmedir exatamente, desenhar nossas observaçõesde modo a evitar que estas nos confundam; B)fazer testes estatísticos que nos permitamcalcular, de maneira objetiva, confiança sobre aresposta indicada pelas nossas observações e C)determinar se os custos para responder estapergunta são altos demais como para tentarresponde-la. Uma pergunta clara é aquela quepode ser expressa como uma previsão, ouhipótese, Ex. “a testosterona estimula ocomportamento agressivo na piranha?” ou “a taxade crescimento dos girinos é mais alta em presença de Iodo na água?” Um indício de que apergunta está bastante clara é que você pode ver nos dois exemplos, é que podemostransformar a pergunta em hipótese só tirando o ponto de interrogação.Levantar uma pergunta clara sobre o mundo implica necessariamente que possamosrepresentá-la em um gráfico cartesiano (Magnusson e Mourão, 2004) (ou tal vez em unspoucos, caso responder sua pergunta precise de algumas sub-perguntas). Fazer umarepresentação gráfica dos nossos objetivos ajuda a esclarecer quais os tipos de variáveisdevemos e podemos medir. Ainda, ao facilitar a exposição dos nossos objetivos e resultadosesperados a outras pessoas (Cleveland, 1984), permite que as outras pessoas realizemsugestões ou críticas mais importantes antes de começar todo o trabalho (Magnusson eMourão, 2004).Os eixos do gráfico devem representar as partes de nossa pergunta. Os fatores ouvariáveis independentes serão representados sempre no eixo horizontal e as variáveisdependentes ou de interesse são representadas sempre no eixo vertical (Cleveland,1984).Agora estamos em condições de decidir se usaremos variáveis contínuas oucategóricas para representar nossos fatores e variáveis de interesse. Variáveis contínuasrepresentam características da natureza atribuindo-lhes números reais, enquanto quevariáveis categóricas dividem estas variáveis sob critérios subjetivos para representá-las4. Desenho das observaçõesque respondem à perguntaQuadro 1.  Esquema básico do processo de  trabalho científico.1.Leitura e observaçõesprévias2. Identificação da lacuna de conhecimento3. Emissão da pergunta cuja resposta preenchea lacuna5. Execução e análise das observações7. Interpretação8. Comunicação de resultados e conclusões.
  19. 19. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 11(etiquetas, categorias). Entre os exemplos mais comuns de variáveis contínuas estão:comprimento de onda, peso, comprimento, concentração, etc. como variáveis categóricaspodemos citar cores, sexo, tratamento. As variáveis contínuas proporcionam maisinformação, enquanto as categóricas são mais simples de entender e manejar. O melhortipo de variável vai depender essencialmente da sua pergunta e dos recursos disponíveis.Os tipos de variáveis escolhidas determinarão o tipo de gráfico utilizado. Entre osgráficos mais informativos e fáceis de entender estão os gráficos de nuvens de pontos,gráficos de dispersão, ou scatter plots (Magnusson e Mourão, 2004). Podemos encontrardois tipos básicos, o primeiro tem variáveis categóricas no eixo horizontal, o segundo usavariáveis contínuas no eixo horizontal (Fig. 3).O CHUMBO NA ÁGUA INFLUENCIA A TAXA METABÓLICA DOS GIRINOS?muitochumbopoucochumboconcentração dechumbo na águaA BtaxametabólicataxametabólicaFigura 3. Exemplos de gráficos de dispersão. A) gráfico com fator categórico. B) Gráfico comfator contínuo (modificado de Magnusson e Mourão, 2004).Como mostra a Fig. 3, quando categorizamos variáveis podemos perder informação(Magnusson e Mourão, 2004). Se na pergunta anterior o pesquisador tivesse escolhidocomparar duas concentrações de chumbo, não teria detectado o efeito do chumbo sobre ocrescimento dos girinos, mesmo quando realmente existe uma relação entre as variáveis.Por outro lado, as categorias podem ser mais didáticas e fáceis de manejar. Por isto énecessário estar seguro sobre qual informação se quer obter para decidir sobre que tipo devariável usar.
  20. 20. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 12 Julho/2010
  21. 21. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 13Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenhoexperimental e a estatística inferencial.Agustín Camacho GuerreroLaboratório de Herpetologiaagustin.camacho@usp.brAgora que já sabemos qual é nossa pergunta e como representá-la, deveremosrealizar observações que a respondam. Entretanto, um dos maiores problemas pararesponder perguntas sobre sistemas naturais é que estes são afetados por múltiplos fatores.Estes são fatores cujo efeito se mistura com o do nosso fator de estudo, de maneira quepode ser impossível saber se a variação observada na variável dependente é derivada denosso fator ou destes fatores (Hurlbert, 1984). Por exemplo, um experimentador poderiadeterminar que a secreção de saliva é controlada pela presença de alimentos na boca, umavez depositados alimentos na boca de um animal e medindo variações no volume de saliva.Entretanto, se ele não tiver o cuidado de administrar alimentos sem que o animal os veja ouos cheire, a secreção de saliva poderia ser provocada pela visão ou cheiro destes antes quepela sua presença na boca do animal. Para um cientista, é crucial aprender a enxergar eevitar fatores que confundam suas conclusões de maneira não desejada ou oculta. Odesenho experimental representa nossa decisão de quantas observações necessitamos ecomo as distribuímos para evitar que fatores de confusão, influenciem em nossa resposta(Quinn e Keogh, 2002).Erros cometidos durante o desenho amostral podem fazer com que o efeito defatores inadvertidos seja indistinguível do efeito dos teus fatores de estudo. Para evitarconfusões ao comunicar-se com colaboradores durante a fase de planejamento éconveniente aprender claramente os seguintes conceitos: Unidade amostral, repetição ouréplica: elas são cada uma das observações que gera uma resposta a sua pergunta (são ospontos nos gráficos); Universo amostral: é aquela parte da natureza sobre a qual se querobter informações por meio de observações e a qual se aplicam nossas conclusões.O que significa testar uma hipótese?Como vimos antes, para avançar em ciência derivamos hipóteses a partir de modelosconsiderados válidos cuja rejeição/aceitação com base em observações implicaria norefinamento ou rejeição das teorias que possuímos sobre o mundo. Testar uma hipótese émesmo isto: contrastar os valores das nossas observações com os valores queesperaríamos para ela (No falsificacionismo, compararíamos com os valores esperadoscaso nossa hipótese não fosse correta. No verificacionismo, compararíamos as observaçõescom diferentes possibilidades teoricamente justificadas).
  22. 22. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 14 Julho/2010Frequentemente, queremos realizar algum de dois tipos de testes: A) se os valoresde nossa variável de interesse estão relacionados com uma ou mais variáveisindependentes (fatores), ou B) Se os valores de nossa variável de interesse feitas em duasou mais situações diferentes (tratamentos) são iguais ou diferentes (Fig.4).variaçãoprovocadapelo fatorruídofatorvariáveldependentetratamento1tratamento2ruídovariaçãoprovocadapelo fatorA BvariáveldependenteFigura 4. “Scatter-plots” mostrando a distribuição da variação em dois tipos básicos de análise: A)análise da relação entre duas variáveis e B) comparação do efeito de dois tratamentos sobre umavariável.Você pode estar-se perguntando: “para que toda esta complicação?” A resposta é aseguinte: como normalmente só conseguimos observar uma parte da variação de nossosistema de estudo, é possível que o resultado de nosso experimento seja esperado peloacaso. Os testes estatísticos nos permitem estimar o quanto é seguro aceitar a resposta anossa pergunta (= houve/não houve relação; houve /não houve diferença, que hipótesesuporta melhor os dados), em função de como a variabilidade está partilhada nos dados querepresentam nossas observações.Uma forma comum de fazer isto é distribuir-se a variação encontrada em tal conjuntode dados em variação provocada por um fator (efeito) e a variação não devida a este fator(ruído) (Fig. 4). Neste caso, a finalidade de um experimento é avaliar se a variaçãoprovocada pelo fator é, uma vez isolados possíveis fatores de confusão, maior do que oruído. Associado a este tipo de experimento, um teste falsificacionista compararia adistribuição de freqüências observadas com a distribuição de freqüência teórica (=hipótese):esperada no caso de que o ruído seja maior que o efeito. Um teste verificacionistacompararia a distribuição de freqüências observadas com as distribuições de freqüênciasteóricas para os dois casos possíveis: que o efeito seja maior ou vice-versa.
  23. 23. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 15Repetição, pseudorepetição e confiança.Lembra do problema no final do capítulo 1? Quando um fator altera os valores denossas repetições, de modo que faz com que seu valor esteja relacionado, as repetiçõessão chamadas de pseudorepetições. Aumentar o número de repetições nos permiteaumentar nossa confiança no resultado, mas isso não acontece com as pseudorepetições,apesar de que aumentar o número de pseudorepetições pode nos dar uma falsa sensaçãode confiança.Para entender a relação entre fatores de confusão, confiança e pseudorepetição, leiao seguinte exemplo: Imagine que você quer ir “bonito(a)” a uma festa. Em que caso você sesentiria com maior confiança sobre as opiniões: depois de perguntar a sua mãe? Depois deperguntar a sua mãe, avós e tias? Depois de perguntar a um(a) colega, ou depois deperguntar a várias meninas não muito próximas? Como pode ter deduzido, perguntar a suasavós e tias depois de perguntar a sua mãe não vai trazer tanta confiança, pois é provávelque vão dizer que você está muito bonito(a). Na opinião de cada uma delas está embutido ofator de confusão “parentesco” (que, vamos lá, é importante neste caso!). Agora, se vocêpergunta a um(a) colega, e sua resposta é que você está “muito bonito(a)”, você poderiaainda pensar que “ele(a) quer te agradar”. Finalmente, se a resposta deste(a) colega)concordar com a de outros(as) colegas não relacionados(as) com ele(a), sua confiança emque você está bonito(a) aumentará muito! Cair na pseudorepetição é acreditar querepetições aumentaram nossa confiança sobre a resposta a nossa pergunta quando estas,na realidade, estão relacionadas por um fator de confusão. Busque sempre respostasindependentes para suas perguntas!Provocam pseudorepetição aqueles fatores que não fazem parte do estudo e quefazem com que os valores de nossas observações não sejam independentes entre eles.Tipos gerais de pseudo-repetição incluem: espacial= as observações tem valoresrelacionados por causa da sua posição no espaço, temporal= quando o fator que relacionaos valores das observações é o tempo, filogenética= provocada por relações de origemcomum entre as observações e técnica= quando é um elemento do equipamento ouprocedimento experimental que está relacionando os valores obtidos nas observações.Obtenha informações mais detalhadas e mais exemplos em Hulbert (1984) e Magnusson eMourão (2004).Existem outros aspectos do desenho de um experimento. Por exemplo, decidirquantas observações serão necessárias, se estas serão dispostas aleatória ousistematicamente, e como serão feitos os controles. Explicar isto está fora do tempodisponível para este módulo, mas todos estes passos são críticos para o sucesso do seutrabalho. Lhe recomendo que leia a maior quantidade de literatura possível sobre desenhoexperimental e estatística antes de começar a coletar seus dados. Comece pela tabela de
  24. 24. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 16 Julho/2010Magnusson e Mourão (2004), pag. 4. Parafraseando a Peters (1987): Não fazer isto “porquevocê não teve tempo” facilmente acabará em que todo o esforço e dinheiro público investidonão sirvam para nada.
  25. 25. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 17O Fim da Picada: Comunicando Ciência.Agustín Camacho GuerreroLaboratório de Herpetologiaagustin.camacho@usp.brPense por um segundo no momento no qual você terminará seu experimento. Foi umcaminho árduo: você teve que ler vários artigos que não entendia bem ou com os quais nemconcordava para levantar uma pergunta não respondida até agora. Passou tempo lendo,pensando e discutindo o projeto com outras pessoas que, às vezes, não lhe entendiam bem.Suas idéias sofreram críticas, você teve que esperar longas burocracias (licenças,solicitação de fundos) e repetir seu experimento várias vezes, resolvendo inúmerosproblemas (animais que morrem antes de obter os dados, infra-estrutura falha, falta dinheiro,segurança, etc.). Conseguiu imaginar? Com certeza você vai lembrar-se deste parágrafodepois do seu mestrado...Bom, se você não tem cuidado no que vem agora, tudo isso pode não ter servido denada. A valia dos cientistas se mede grandemente a través da qualidade e quantidade deartigos científicos que publicam. Para isto, uma grande dose de experiência é necessária.Recomendo que você a procure em seu orientador e lendo artigos nas revistas ondepretendam publicar. Assim mesmo, busque textos (Ex. referências neste capítulo, manuaisde redação de jornais científicos) e faça cursos especializados no tema. A continuação,veremos algumas dicas básicas para estruturar textos científicos. Estas dicas estãobaseadas no livro de Peters (1984), e você deve dominá-las desde o começo.Repassaremos aqui as partes de um relatório de pesquisa, as relações lógicas entre elas ealguns elementos básicos que devem conter.Partes e estrutura de um relatório de pesquisa.Um relatório de pesquisa deve ser tão claro, preciso e curto quanto seja possível.Basicamente, consta de 7 partes: título, resumo, introdução, material e métodos, resultados,discussão, agradecimentos e referências. Veja dicas úteis sobre o título, agradecimentos ereferências na tabela 1. Iremos nos estender mais nas seções de resumo, introdução,material e métodos, resultados e discussão.O resumo se compõe normalmente de um parágrafo que demonstra a relevância eos objetivos do estudo, e explica de forma sucinta os métodos empregados e os principaisresultados e conclusões.Dentro da introdução devem ficar claros: A) o problema que vamos abordar e suarelevância B) o estado da arte sobre o problema, mostrando a lacuna de conhecimento quepretendemos preencher e porque precisa ser preenchida e C) as decorrências dos possíveis
  26. 26. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 18 Julho/2010resultados de nosso trabalho. Por último, os objetivos devem aparecer da forma mais clarapossível. Concretamente, em forma de hipótese a ser testada.O “material e métodos” deve conter uma explicação clara dos métodos empregadospara alcançar o objetivo declarado no fim da introdução. Desta forma, as técnicas, odesenho experimental e as análises devem aparecer explicados e justificados de forma queos leitores sejam capazes de: A) entender como alcançam o objetivo escolhido B) Repeti-loC) perceber possíveis fraquezas no delineamento. Se evitarmos mostrar claramente nossodesenho experimental pode ser que rejeitem nosso relatório na revista que o queremospublicar. Pior ainda, podemos enganar aos nossos leitores.A seção de “resultados” deve dar toda a informação necessária para respondernossa pergunta inicial e que outros possam avaliar se a respondemos mesmo ou não. Istoimplica em descrever as observações feitas, estabelecendo as relações que foramestatisticamente significativas e as que não foram. Os dados, quando numerosos, devemser apresentados em forma de tabelas. Os gráficos devem expor a parte mais importantedos nossos resultados (nossa pergunta e as observações que a respondem) e informarsempre o número de repetições. Se nos nossos resultados, os gráficos não representam aspartes de nossa pergunta, a evidência gerada para respondê-la parecerá fraca a vista dosoutros (Magnusson, 1966). Tanto tabelas quanto gráficos devem ter uma legenda curta eauto-explicativa, e serem numerados, de forma que possam ser referidos no texto. Dadosapresentados em tabelas e gráficos devem ser explicados também no texto, mas evitandoredundância.Na discussão, devemos expor como nossos resultados se relacionam com ahipótese que pretendíamos testar, reconhecendo as fraquezas que puderem comprometeros resultados. Em seguida, mostrar a consistência (ou inconsistência) dos nossos resultadoscom os resultados de outros trabalhos levantados na introdução, mostrando quais asimplicações dos nossos resultados sobre a lacuna de conhecimento levantada. Por último,este é o lugar onde se deve apontar, curtamente, futuros experimentos ou hipótesestestáveis que permitam avançar no entendimento do problema abordado.Se o relatório tem vários objetivos, estes devem seguir a mesma ordem naintrodução, material e métodos, resultados e discussão. A fim de facilitar a interpretação doleitor. Veja uma lista de verificação básica para identificar problemas em seu relatório depesquisa (Tab.1).Busque críticas, seja crítico e ajude à ciência progredir.Einstein dizia que se você não consegue explicar seu trabalho a seu avô, é porquevocê não entende bem o que está fazendo. Agora, eu digo a você que, explicandocorretamente para ele, até seu avô poderia fazer críticas imprevistas e acertadas sobre o
  27. 27. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 19seu trabalho. A comunidade científica deve ajudar-se a través de visão crítica e sentidoconstrutivo.Lembre-se que em ciência, tratamos com assuntos que, via de regra, sãocomplicados. Isto faz com que todos nós cometamos erros. Para evitar erros em seuexperimento, a melhor saída é apresentar seu projeto a pessoas com visão crítica. Se estaspessoas conseguem entendê-lo perfeitamente, poderão julgar se foram convencidas ou nãopelos seus argumentos. Encontrar falhas nos aspectos do desenvolvimento lógico dotrabalho de um colega pode ser de grande ajuda para ele, antes que invista grande esforçoe dinheiro em um projeto mal planejado. Assim mesmo, podemos evitar que um trabalhoconfunda a comunidade científica através da geração de evidências ou argumentos quepermita mostrar que este está errado.Considerações finais.Terminou este capítulo que pretendia mostrar-lhe um pouquinho do que vem pelafrente. A melhor forma de enfrentar os próximos anos de preparação é você que deveplanejar. A lista de referências que segue é uma seleção da literatura que fez muitadiferença na minha própria formação (alguma delas chegou um pouco tarde). Espero quelhe ajude.
  28. 28. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 20 Julho/2010Tabela 1: Lista de verificação na redação de um relatório de pesquisa.No títuloO titulo representa os elementos da sua pergunta? E o universo de estudo?Na introdução:A lacuna de conhecimento está clara?Esta se deriva logicamente do estado da arte da disciplina?Os objetivos buscam preencher esta lacuna?Os conceitos mantêm o significado ao longo do texto?Os objetivos buscam testar ou verificar uma hipótese?Nos métodos:Há pontos importantes para julgar a validade do trabalho que não foram explicados?Está claro para que serve cada seção dos métodos?As medidas realizadas e os procedimentos adotados estão claramente justificados?No caso de várias hipóteses, as análises estão redigidas na mesma ordem que osobjetivos?Nos resultados:Um gráfico de dispersão representa a resposta a nossa pergunta principal?O número de observações está claro no gráfico?Existe redundância entre a informação mostrada no texto e os dados apresentados nosgráficos e/ou tabelas?No caso de vários objetivos, os resultados foram apresentados na mesma ordem que asanálises dos métodos?Os dados mostrados permitem julgar se as análises foram feitas corretamente?Na discussãoForam discutidos problemas que possam ter interferido na resposta?Os resultados de estudos comparados com o nosso são mesmo comparáveis?As conclusões e sugestões derivam logicamente dos resultados?Mostraram-se novas hipóteses para avançar no entendimento do tema abordado?Nos reconhecimentosAs pessoas/organizações que prestaram a ajuda ou licenças mais fundamentais estãopresentes?Nas referênciasTodas as citações, e só as que estão no texto, aparecem na seção referencias?
  29. 29. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 21GlossárioEtimologia: parte da gramática que estuda da história ou origem das palavras.Lei científica: relação tão demonstrada empiricamente que é assumido que sempre vai serobservada em determinadas condições.Princípio científico: pode ser considerado sinônimo de lei científicaEpistemológico: relativo ao estudo do funcionamento da ciência.Silogismos: arranjos de três proposições lógicas onde a última se deduz necessariamentedas duas anterioresInferência: conclusão, seja esta tomada sobre uma população, a partir de uma amostra damesma, ou bem tomada a partir da combinação lógica de duas premissas verdadeiras (Ex:Se as premissas de que todos os homens tem coração e que Sócrates é um homem sãoverdadeiras, então podemos inferir que Sócrates tem coração)Casos gerais e particulares: Para Aristóteles e Bacon, são duas categorias que mostramgeneralidade de aplicação de um conceito.Indução: Raciocínio ou forma de conhecimento pelo qual passamos do particular aouniversal, do especial ao geral, do conhecimento dos fatos ao conhecimento das leis.Probabilidade prévia: estimação subjetiva da probabilidade de um evento, prévia a umexperimento.Verossimilhança: Dado um conjunto de dados observados, a verossimilhança valoriza aplausibilidade de um descritor hipotético deste conjunto, sobre outro possível descritor.verossimilhança é proporcional à probabilidade de observar os dados sendo umdeterminado descritor verdadeiro.Teoria: explicação sobre um fenômeno. Para Popper, deve ser um conjunto de enunciados.Diferencia-se de lei porque a teoria não precisa ter sido demonstrada amplamente comdados empíricos.Conclusões, previsões, predições ou hipóteses: uma proposição aceitável do ponto devista de uma teoria ou um modelo, mas ainda não conferida.Modelo: tem variados significados dependendo do contexto, porém a maioria pode serconsiderada como “representação simplificada”. Dentro do processo de geração deconhecimento um modelo pode ser considerado como uma representação de relações entrevariáveis acorde com a teoria da que forma parte tal modelo.Teoria empírica: Segundo Popper, aquela teoria que pode ser testada.Tautologia: uma afirmação lógica onde as premissas são iguais à conclusão.(ex. estes animais não são aquáticos, logo eles não moram na água)Filogenia: representação de relações de parentesco entre espécies ou grupos de espécies.Caráter ancestral: característica considerada original para um grupo de espécies.Teste: prova, ensaio, exame.
  30. 30. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 22 Julho/2010Tratamento: aqui tratado como manipulação.Fatores ou variáveis independentes: elemento ou circunstância que contribui a produzirum estado em uma variável influenciada por ele.Variáveis dependentes ou de interesse: variável cuja variação estamos interessados emexplicar, sendo influenciada pelos fatores.Efeito: influencia de um elemento sobre outro.Ruído: variação não devida ao fator.Pseudorepetições: observações cujos valores estão afetados por um fator de confusão.BibliografiaAldrich, J. 1997. R. A. Fisher and the Making of Maximum Likelihood 1912-1922. StatisticalScience.12;162-176.Amorim, D. S. (2002) Fundamentos de sistemática filogenética. Editora Holos, Ribeirão Preto, Brazil,154 pp.Aristóteles (350 A.C). Prior Analytics (livro 1). Trad. Por A.J. Jenkinson. Disponível em:http://ebooks.adelaide.edu.au/ (Maio 2009). 59 pp.Bayes, T. (1763) An Essay towards solving a Problem in the Doctrine of Chances. PhilosophicalTransactions of the Royal Society of London 53, 370–418.Cleveland, W. S. (1987) Graphs in scientific publications. American Statistician 38: 26-19.Francis Bacon. (1620) Novum Organum.Trad por J. Spedding (1858). Disponível em:http://en.wikisource.org/wiki/Novum_Organum (Maio 2009).Jaynes, E. T. (2003) Probability Theory: The Logic of Science. Cambridge University Press,Cambridge. Disponível em: http://www-biba.inrialpes.fr/Jaynes/prob.html (maio 2009).Lewin-Koh, N., Taper, M.L, Subhash R.L. 2004. A brief tour of statistical concepts. The nature ofscientific evidence, statistical, philosophical and empirical considerations(eds. Taper, M.L, eSubhash R.L.). The university of Chicago Press. 567p.Magnusson, W. E. (1996). How To Write Backwards. Bulletin of Ecological Society of America 77, 88-88.Magnusson, W. E.; Mourão, G. (2004) Statistics without Math. 1. ed: Editora Planta / SinauerAssociates. Londrina. 136 pp.Morris C. (1992) Academic Press Dictionary of Science & Technology. Morris Books, Escondido,California, USA. 2342 pp.Peters, R. H. (1991) A Critique for Ecology. Cambridge University Press, New York 366 pp.Popper, K. R.(1959). The logic of scientific discovery. First English edition by Hutchinson & Co. 545pp.Quinn G.P.; Keogh M.J. (2002) Experimental design and data analysis for biologists. CambridgeUniversity Press; Cambridge. 557pp.
  31. 31. Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia ComparativaJulho/2010 Pág. 23Huey, R. B. (1987) Reply to Stearns: Some acynical advice for graduate students. Bulletin of theEcological Society of America 68: 150-153.Scheiner, S. M.; Willig, M. R. 2008. A general theory of ecology. Theoretical_Ecology. 1:21–28.Sober, E. 2008. Evidence and Evolution: The Logic Behind the Science, Cambridge UP, 392pp.Stearns, S.C. 1987. Some modest advice for graduate students. Bulletin of the Ecological Society ofAmerica 68: 145-150.Suppes, P. 1960. A comparison of the uses and the meaings of models in mathematics and physics.Technical report Nº 33. Proceedings of the colloquium “La notion et Ie role du modele dans lessciences mathematiques, naturelles et sociales”. North Holland press.Underwood, A. J. 1997. Experiments in ecology: their logical design and interpretation under analysisof variance. Cambridge university press. 522 pp.Underwood, A. J.; Chapman M. G. e Connell. S. D. (2000) Observations in ecology: you can’t makeprogress on processes without understanding the patterns. Journal of Experimental MarineBiology and Ecology 250, 97-115.Wiens, J. J. 2008. Systematics and herpetology in the age of genomics. Bioscience 58, 297–307.
  32. 32. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 24 Julho/2010
  33. 33. Unidade 2Sinalização CelularMaria Nathália de Carvalho Magalhães MoraesLaboratório de Fisiologia Comparativa da Pigmentaçãonathalia.moraes@usp.brA sobrevivência dos organismos multicelulares depende de uma redeelaborada de comunicação inter e intracelular, que coordena o crescimento, adiferenciação e o metabolismo das células em diversos tecidos e órgãos. Nestemódulo, serão abordados os aspectos da evolução da multicelularidade e osmecanismos básicos da transdução de sinais, bem como a contextualização dessesmecanismos dentro de patologias, como é o caso da malária. Além disso, seráapresentada a técnica do RNAi (RNA de interferência) como ferramenta de estudopara a fisiologia, com destaque para as vias de transdução do sinal em diversosmodelos.
  34. 34. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 26 Julho/2010Capítulo 5 Comunicação celular: entendendo a ritmicidade endógena pág. 27Maria Nathália C. Magalhães MoraesRevisado por Dra Ana Maria de Lauro CastrucciCapítulo 6 Fisiologia Celular do Plasmodium durante a fase assexuadapág. 41Laura Nogueira da CruzRevisado por Dra. Célia R. S. GarciaCapítulo 7 RNAi: ouvindo a voz do silêncio pág. 49Maísa CostaRevisado por Dr. Daniel Carneiro CarrettieroBibliografia pág. 66
  35. 35. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 27Comunicação Celular: Entendendo a Ritmicidade EndógenaMaria Nathália de Carvalho Magalhães MoraesLaboratório de Fisiologia Comparativa da Pigmentaçãonathalia.moraes@usp.brEvolução da MulticelularidadeO grande passo obtido através da evolução da unicelularidade para apluricelularidade certamente foi a capacidade de comunicação entre as células, por meio daevolução a partir de uma única célula, a qual desempenhava todas as funções necessáriaspara o organismo, para um conjunto de células especializadas proporcionando interaçõesentre elas (Ben-Shlomo e col., 2003). Os ancestrais dos organismos multicelulares seriamsimples agregados de seres unicelulares, que formavam estruturas designadas colônias.Inicialmente todas as células da colônia desempenhavam a mesma função. Contudo, aolongo do tempo algumas das células da colônia especializaram-se em determinadasfunções. A diferenciação celular, relacionada com a função especifica acentuou-se nodecorrer da evolução, originando os verdadeiros seres multicelulares. Neste processo foramsurgindo diferentes tipos de células, que mais tarde originaram tecidos, os quais levaram aoaparecimento de órgãos. A especialização celular permitiu uma melhor utilização da energia,levando a uma diminuição da taxa metabólica, além de uma maior independência emrelação ao ambiente.Para que as células pudessem sincronizar as tarefas e perceber informações doambiente, foi necessária a especialização de células para percepção do ambiente(receptores sensoriais), centros integradores dessas informações (sistema nervoso) eefetuadores de ajustes homeostáticos (sistema muscular, endócrino e exócrino) (Isoldi eCastrucci, 2007).Para garantir o sucesso e a diversificação da vida, foi necessário o aparecimento deestruturas de ligação e principalmente de comunicação entre as diferentes células. Nosorganismos multicelulares, a manutenção da homeostase é dependente de umprocessamento continuo de informações através de uma complexa rede de células. Alémdisso, para que o organismo responda a constantes mudanças do ambiente, sinaisintracelulares devem ser transduzidos, ampliados e finalmente convertidos para umaresposta fisiológica adequada (Pires-da-Silva e Sommer, 2003). Muitos hormônios,neurotransmissores, quimiocinas, mediadores locais e estímulos sensoriais exercem seusefeitos sobre as células através de ligação a diferentes classes de receptores. Essestransdutores altamente especializados são capazes de modular a sinalização de várias viasque levam a diversas respostas biológicas (Cabrera-Vera e col., 2003). A maioria das
  36. 36. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 28 Julho/2010famílias de receptores evoluiu com o advento da multicelularidade e com a necessidade deum comportamento coordenado do organismo (Ben-Shlomo e col., 2003).Alvos para ação dos mensageiros químicosOs mensageiros químicos intercelulares devem atingir células alvo, que possaminterpretar os sinais. Para que as células interpretem esses sinais devem apresentarelementos que reconheçam esses mensageiros, os chamados receptores, que mudam suaconformação quando os mensageiros se ligam a eles. A ligação mensageiro-receptor iniciauma cascata de sinalização que irá evocar a participação de diversos segundosmensageiros, ativando múltiplas vias de sinalização. Cada classe de receptor ativasegundos mensageiros específicos, os quais amplificam o sinal e desencadeiam respostasintracelulares específicas para o sinal inicial. Os princípios moleculares nos quais atransdução do sinal se baseia são representados por associações específicas de proteínase sua fosforilação ou desfosforilação, onde a fosforilação de alvos protéicos leva geralmentea mudanças imediatas em sua configuração e atividade. Deste modo, o balanço entrefosforilação e desfosforilação é determinante para a transdução do sinal intracelular. Ainda,os receptores podem evocar tipos diferentes de efeitos celulares. Alguns deles são muitorápidos em escala de milissegundos, enquanto os efeitos produzidos por hormôniosesteróides, por exemplo, ocorrem dentro de algumas horas ou dias (Fig. 1) (Rang e Dale,2007).Os mensageiros químicos extracelulares podem ser classificados de acordo com adistância que percorrerão do local de sua síntese até a célula alvo, bem como o tipo deinter-relação entre a célula produtora e a célula alvo. Os sinalizadores secretados pelaprópria célula produtora e que atuam em células adjacentes próximas são chamados deparácrinos, enquanto os sinalizadores que atuam na própria célula produtora sãoconhecidos como autócrinos, além dos sinalizadores que são lançados na correntesanguínea, cuja célula alvo encontra-se distante, os quais são chamados de hormônios. Ossinalizadores parácrinos produzidos por células nervosas são denominadosneurotransmissores, os quais são lançados na região entre neurônios, entre neurônios efibra muscular ou entre neurônios e glândula exócrina ou endócrina; essa região éconhecida como fenda sináptica. Os ligantes podem ainda ser classificados quanto à suasolubilidade, em hidrossolúveis e lipossolúveis. Os hidrossolúveis são incapazes deatravessar a membrana celular, e dessa forma, devem ser reconhecidos por receptoreslocalizados na membrana. Já os compostos lipossolúveis apresentam alta afinidade químicapela membrana podendo, portanto, atravessar a membrana e atuar dentro das células,chegando muitas vezes ao núcleo, dessa forma sendo reconhecidos por receptoresintracelulares (Isoldi e Castrucci, 2007).
  37. 37. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 29Figura 1 – Relação receptor e tempo de ação. Adaptado de Rang e Dale, 2007Interação molécula-receptorExiste uma diferença importante entre agonistas e antagonistas. Agonistas eantagonistas são poderosas ferramentas que permitem a caracterização de estruturas efunções de subtipos de receptores (Squire e col, 2003). Os agonistas ativam os receptores,enquanto os antagonistas podem se combinar com os mesmos sítios, porém sem causarativação desse receptor, e dessa forma bloqueando o efeito dos agonistas. A ocupação deum receptor por uma molécula de um ligante pode ou não resultar na ativação dessereceptor. A ativação do receptor ocorre através da ligação da molécula de tal modo quedesencadeie uma resposta tecidual. A ligação e ativação representam duas etapas distintasda geração de uma resposta mediada por um receptor, que é iniciada por um agonista. Atendência de um ligante se ligar aos receptores é dada através de sua afinidade. Os ligantescom alta potência geralmente apresentam alta afinidade pelos receptores e,consequentemente, ocupam uma porcentagem significativa dos receptores, mesmo embaixas concentrações (Rang e Dale, 2007).Tipos de receptoresSegundo a estrutura molecular e a natureza do mecanismo de transmissão, osreceptores são agrupados em quatro superfamílias, a saber: (1) superfamília tipo 1 -receptores-canal (ou ionotrópicos), receptores de membrana que formam o próprio canal
  38. 38. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 30 Julho/2010iônico; (2) superfamília tipo 2 - receptores acoplados à proteína G (GPCRs ou 7-TM oumetabotrópicos), receptores de membrana acoplados a sistemas efetores intracelulares pormeio de proteína G; (3) superfamília tipo 3 – receptores enzimáticos, receptores demembrana com domínio intracelular de proteína quinase (em geral, tirosina quinase,fosfatase e outras) e (4) superfamília tipo 4 - receptores reguladores da transcrição de genes(ou receptores nucleares ou receptores intracelulares), receptores solúveis no citosol (Fig.2).Figura 2 - Tipos de famílias de receptoresSuperfamília tipo 1: receptores-canalOs íons são incapazes de penetrar na bicamada lipídica da membrana celular, e sópodem atravessá-la com a ajuda de proteínas transmembrânicas na forma de canais outransportadoras. Os receptores do tipo canal são compostos por 4 ou 5 subunidades (α, β, γ,δ) combinadas para formar um canal iônico através da membrana (Fig. 3). Cada subunidadeconsiste de 4 segmentos transmembrana (TM) referidos como TM1-TM4. Na ausência deum neurotransmissor, esses canais iônicos permanecem em estado fechado e sãoimpermeáveis aos íons. A ligação do neurotransmissor induz uma rápida mudançaconformacional que abre o canal, permitindo o fluxo dos íons (Fig. 4). As mudanças nacorrente da membrana resultante da ligação do ligante ao canal ionotrópico são geralmentemensuradas numa escala de milissegundos. O fluxo iônico cessa quando o transmissor sedissocia do receptor ou quando o receptor se torna dessensibilizado (Squire e col., 2003). Oprimeiro receptor dessa família a ser clonado, foi o receptor nicotínico da acetilcolina(nAchR), o qual é usado como modelo para o estudo da estrutura dos receptoresionotrópicos. Sua estrutura pentamérica (2α, β, γ, δ) possui dois sítios de ligação àacetilcolina, cada um na interface das duas subunidades α. Para que o receptor seja
  39. 39. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 31ativado, duas moléculas de acetilcolina devem se ligar a esses sítios e, dessa forma, o canalse abre quase que instantaneamente, permitindo a passagem de íons (Rang e Dale, 2007).Os canais controlados por voltagem abrem-se quando a membrana celular édespolarizada. Essa abertura (ativação) induzida pela despolarização da membrana é decurta duração, mesmo quando a despolarização é mantida. Os canais mais importantesnesse grupo são os canais seletivos para sódio, potássio e cálcio.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             Figura 3 – Estrutura do receptor canal. Figura 4 - Esquema de abertura do canal.Retirado de Squire e col., 2003. Retirado de Squire e col., 2003.Os canais controlados por ligantes são ativados através da ligação de ummensageiro químico extracelular a um sítio na molécula do canal. Os receptores desse tipocontrolam os eventos sinápticos mais rápidos do sistema nervoso. A maior parte dosneurotransmissores excitatórios, como acetilcolina, glutamato, ácido gama-amino butírico(GABA) e ATP agem dessa maneira e causam aumento na permeabilidade ao Na+e K+.Alguns canais controlados por ligantes respondem a sinais intracelulares e nãoextracelulares, tais como: (i) canais de potássio ativados por cálcio, se abrem,hiperpolarizando a célula, quando ocorre um aumento da [Ca2+]i; (ii) canais de potássiosensíveis a ATP, se abrem quando a concentração intracelular de ATP cai. Esses canaissão distintos daqueles que medeiam os efeitos excitatórios de ATP extracelular; (iii) existemainda outros canais que respondem a ligantes intracelulares, como canais de potássiosensíveis a diacilglicerol, cujas funções ainda não estão bem esclarecidas. Dependendo doíon para o qual o canal é seletivo a alteração no potencial de repouso da célula poderá atuarde forma diferente, podendo levar à despolarização celular, como é o caso de algunssubtipos de receptores de acetilcolina e glutamato, que são canais de sódio ou cálcio; oudificultando uma eventual resposta de despolarização a um estimulo excitatório, como é ocaso de GABA e glicina, que são canais de cloro (Squire e col., 2003).Os receptores canais de glutamato são responsáveis pelo fenômeno de potenciaçãode longo termo (LTP), plasticidade sináptica e neurodegeneração. O influxo de íons através
  40. 40. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 32 Julho/2010do canal aberto é conseqüência da liberação de glutamato do neurônio pré-sináptico e dadespolarização da membrana do neurônio pós-sináptico, essa mudança de voltagem damembrana expele íons Mg2+que estavam bloqueando o canal, fazendo com que estepermita o influxo de cálcio e a geração de oxido nítrico e/ou espécies reativas de oxigênio(Kloda e col., 2007).Superfamília tipo 2: receptores acoplados a proteínas GOs receptores da família tipo 2 são de origem antiga, sendo os primeiros receptoresa emergirem entre os organismos unicelulares. O papel central desses receptores emorganismos multicelulares é refletido por suas divergentes estruturas e funções. A ligação domensageiro ao receptor acoplado a proteína G (GPCRs) induz uma mudançaconformacional no receptor, o qual recruta e ativa diferentes proteínas G, as quaisestimulam a geração de adenosina 3’,5’ monofosfato (AMPc), fosfoinositídeos, diacilglicerol eoutros segundos mensageiros. Em termo, esses segundos mensageiros disparam eventoscomo ativação de cascatas cinéticas e fosforilação de fatores citosólicos e transcrição defatores nucleares (Brivanlou e Darnell, 2002). Os estímulos extracelulares que ativam osGPCRs incluem luz, íons, nucleotídeos, lipídeos, esteróides, aminoácidos modificados,peptídeos e hormônios glicoprotéicos (Ben-Shlomo e col., 2003)Estrutura da proteína GA interação de hormônios, neurotransmissores ou glicoproteínas com os receptores7TM na superfície da célula induz uma mudança conformacional do receptor que ativa aproteína G – composta das subunidades α, β, γ – no interior da célula. No estágio inativoGDP liga-se à subunidade Gα. (Fig. 5). Quando a proteína G é ativada, o GDP é liberado, eo GTP liga-se à subunidade Gα e assim ocorre a dissociação do complexo Gα-GTP docomplexo Gβγ. Dessa forma tanto Gα-GTP quanto Gβγ encontram-se livres para ativar seusefetores, como por exemplo canais iônicos ou enzimas (Pierce e col., 2002). A duração dosinal é determinada pela taxa de hidrólise do GTP da subunidade Gα e subseqüentereassociação de Gα-GDP com Gβγ (Hamm, 1998). A cinética da ativação da proteína Gatravés dos GPCRs tem sido descrita recentemente. Baseado em observações de que aatividade GTPásica de proteínas G isoladas é mais baixa do que sob condições fisiológicas,postulou-se a existência de mecanismos que aceleram a atividade GTPásica. Váriosefetores tem sido apontados como promotores da atividade GTPásica da subunidade α daproteína G. Recentemente, uma família de proteínas chamadas “reguladoras da sinalizaçãoda proteína G” (proteína RGS), capaz de aumentar a atividade GTPásica da subunidade αda proteína G foi identificada (Wettschureck e Offermanns, 2005).
  41. 41. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 33Classicamente, as proteínas G são divididas em quatro famílias baseadas nasimilaridade de suas subunidades α: Gαi/0, Gαs, Gαq e Gα12/13 (fig. 7) (Cabrera-Vera e col.,2003; Pierce e col., 2002). Cada família consiste de vários membros que frequentementemostram padrões de expressão específicos. Membros de uma família são estruturalmentesimilares e frequentemente compartilham algumas de suas propriedades funcionais.Figura 5 - Mecanismo de ação do receptor acoplado a proteína G. A interação do ligante exógenocom o receptor de membrana promove a ativação do receptor e sua interação com a proteína Gintracelular. O acoplamento do receptor a proteína G faz com que ocorra uma mudança de GDP paraGTP na subunidade Gα. Gα-GTP então se dissocia do complexo Gβγ e do receptor. Ambassubunidades estão livres para modular a atividade de uma grande variedade de efetoresintracelulares. O sinal é finalizado quando a γ-fosfatase do GTP é removida pela intrínseca atividadeGTPásica da subunidade Gα, levando a ligação do GDP a Gα. A reassociação de GDP com Gαcompleta o ciclo.Após ativação do receptor acoplado a proteína Gs, adenililciclase (AC) é ativada pelasubunidade α da proteína Gs passando a sintetizar AMPc, como representado na figura 6(Isoldi e Castrucci, 2008). Existem 9 tipos de adenililciclases conhecidas em mamíferos, asquais podem ser ativadas pelo complexo cálcio/calmodulina, outras inibidas por baixasconcentrações de cálcio ou por calcineurina (uma proteína fosfatase dependente de ca2+) oupela fosforilação de proteínas quinases II dependentes de Ca2+/calmodulina (CAMK II). Emalguns casos, a subunidade α da proteína G inibe a adenililciclase (Gi), promovendo assimuma diminuição dos níveis de AMPc, ou pode ainda ligar-se a canais modulando-os e dessaforma não exercendo função reguladora sobre adenililciclase (Schwartz, 2001). Para estudaras funções das proteínas Gi tem sido muito utilizada uma toxina extraída do Clostridiumbotulinum (toxina de pertússis ou PTX) a qual é capaz de ribosilar ADP dessas proteínas
  42. 42. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 34 Julho/2010tornando-as incapaz de interagir com o receptor. Dessa forma o tratamento com PTX resultaem um desacoplamento do receptor com a proteína Gi (Wettschureck e Offermanns, 2005).Figura 6 – Representação esquemática da via de sinalização intracelular envolvendoadenililciclase.Depois de formado, o AMPc liga-se a proteínas quinases dependentes de AMPc(PKAs). Na sua forma inativa, a PKA é formada por duas subunidades reguladoras (R), eduas subunidades catalíticas (C). Ativação da PKA ocorre através da ligação do AMPc nassubunidades (R), e subsequente liberação da subunidade (C). Após ativação, PKA podeatuar em diferentes substratos e desencadear uma variedade de respostas. Na ausência deAMPc, a subunidade (C) volta a inibir a PKA pela reassociação com a subunidade (R). Assubunidades C livres são capazes de fosforilar o fator de transcrição CREB, levando a célulaa um aumento da transcrição de genes específicos. CREB liga-se a regiões do gene quecontêm um elemento de resposta ao AMPc (CRE) e sob fosforilação inicia a cascata deexpressão de genes (Schwartz, 2001).
  43. 43. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 35Figura 7 - Representação esquemática da cascata de sinalização evocada por proteínas G. Assetas em vermelho representam inibição de um componente da via, e as setas em verde a ativação.A subunidade Giα inibe adenililciclase, promovendo a diminuição de AMPc. A subunidade Gsα aocontrario de Giα promove aumento do concentração de AMPc. A subunidade Gqα ativa a produção deDAG e IP3, e dessa forma IP3 atua em receptores do reticulo promovendo liberação do cálcio.A família da proteína Gq é uma das mais bem caracterizadas entre as proteínas G(ver fig. 8). Quando a proteína Gq é estimulada, promove a ativação da enzima fosfolipaseCβ (PLCβ). Uma vez ativada, a PLCβ promove a catálise do fosfolipídio de membrana 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol, gerando 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol(DAG). IP3 difunde-se da membrana para o interior da célula, onde se ligará aos receptoresde IP3 (IP3R), que são canais de cálcio existentes na membrana do reticulo endoplasmáticoou sarcoplasmático. Essa ligação promove a abertura desses canais de cálcio e aconseqüente liberação dos estoques desse íon para o citoplasma. Em muitos tiposcelulares, a liberação de cálcio dos estoques intracelulares induz a abertura de canais decálcio da membrana celular, promovendo assim um influxo de cálcio do meio extracelularpara o interior da célula. O DAG permanece na membrana podendo promover ativação daproteína quinase C (PKC) desencadeando assim uma cascata de fosforilação, ou ainda,podendo ser clivado, gerando ácido araquidônico, o qual dá inicio à via de síntese deeicosanóides como as prostaglandinas (Isoldi e Castrucci, 2007).
  44. 44. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 36 Julho/2010Figura 8 – Representação esquemática da via de sinalização intracelular envolvendo aparticipação da fosfolipase C.Existe ainda uma superfamília de proteínas G, referidas como proteínas Gmonoméricas (são formadas somente pela subunidade α), ou Ras. Essas proteínas Rasestão envolvidas em uma variedade de processos celulares, incluindo proliferação,diferenciação, migração, maturação e apoptose. A ativação de Ras sob estimulação deGPCRs e receptores de fatores de crescimento é regulada pela mudança do fatornucleotídeo de guanina, o qual estimula uma mudança na atividade de GDP/GTP resultandona ligação do GTP em seu estado ativo à proteína (Schaafsma e col., 2008). As proteínasRas processam sinais vindos de receptores tirosina quinase e GPCRs, para o interior dascélulas, afetando a transcrição gênica (Schenk e Snaar-Jakelska, 1999).Superfamília do tipo 3: receptores enzimáticosSão encontrados quatro receptores com diferentes domínios enzimáticos: tirosinaquinase, serina/treonina quinase, tirosina fosfatase, guanililciclase. Os receptores do tiposerina/treonina apresentam como ligante o fator de crescimento transformante beta (TGFβ).Esses receptores se apresentam em dois sub-tipos, os receptores do tipo I e II, os quais sãoclassificados de acordo com suas propriedades estruturais e funcionais. O domíniocitoplasmático do receptor tipo II é constitutivamente ativo e este fosforila o receptor tipo Iem resíduos serina e treonina em resposta à ligação do mensageiro extracelular. O receptortipo I ativado tradicionalmente fosforila proteínas SMAD citoplasmáticas, dessa formaativando a transdução do sinal para o núcleo. As proteínas SMAD ligam-se ao DNAreprimindo ou estimulando a transcrição de genes e, desse modo, essa cascata de
  45. 45. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 37sinalização de TGF-β pode representar um papel chave na patogênese de várias doençasincluindo o câncer (Wright e col., 2009).As proteínas tirosina quinase foram identificadas em 1980 como as maioresrepresentantes no câncer resultando na investigação desses receptores como alvosterapêuticos. (Levitzki, 2003). Receptores tirosina quinase (RTK) são glicoproteínastransmembrânicas que são ativados pela ligação de ligantes cognatos e transduzem o sinalextracelular para o citoplasma através da fosforilação do resíduo de tirosina no próprioreceptor (autofosforilação) (Hubbard e Till, 2000). Os RTKs ativam numerosas vias desinalização dentro da célula, levando a proliferação, diferenciação, migração, ou mudançasmetabólicas. A família dos RTKs inclui os receptores de insulina e muitos fatores decrescimento, tais como fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento defibroblasto (FGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimentoendotelial vascular (VEGF). Os RTKs consistem de uma porção extracelular que se liga aosligantes polipeptídicos, uma hélice transmembrânica e uma porção citoplasmática quepossui tirosina quinase com atividade catalítica (Fig. 9). A grande maioria de RTKs émonomérica e dimeriza-se na presença do ligante. A ativação do receptor pelo ligante leva àativação da porção quinásica do receptor, resultando em autofosforilação e fosforilação desubstratos SHC, o que culmina com a ativação da proteína G monomérica Ras. Nas vias desinalização de receptores monoméricos, a cascata de MAP quinases (MAPK) é recrutada,resultando na ativação de fatores de transcrição como CREB, c-Fos e Elk-1, envolvidos natranscrição de genes relacionados à proliferação celular. Em adição aos RTKs, existe umaampla família de tirosina quinases citosólicas não receptoras (NRTKs), as quais incluem Src,Janus Kinases (Jaks), Ab1 (Fig 10). Os NRTKs são componentes das cascatas desinalização disparadas por RTKs e por outros receptores de superfície como receptoresacoplados a proteína G e receptores do sistema imunológico (Hubbard e Till, 2000).Em contrapartida, os receptores tirosina fosfatase, quando ativados por ligantes,desfosforilam proteínas celulares. Esses receptores têm sido implicados na angiogênese ena adesão celular (Isoldi e Castrucci, 2007).Os receptores guanililciclases (GC) são ativados por um hormônio peptídicodenominado peptídeo atrial natriurético (ANP), o qual possui um importante papel naregulação da homeostase cardiovascular, através da manutenção da pressão arterial. Asações dos peptídeos natriuréticos são mediadas por sua ligação a três tipos de receptores.Os receptores NPR A e B (receptor peptídico natriurético A e B) são guanililciclases queaumentam a concentração intracelular de GMPc e ativam proteínas quinases dependentesde GMPc. A ativação dos receptores NPRC resulta na inibição da atividade da adenililciclase(Woodard e Rosado, 2008)
  46. 46. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 38 Julho/2010Figura 9 – Receptores tirosina quinase. Via de sinalização envolvendo a participação das MAPquinase.Figura 10 – Via de sinalização dos receptores tirosina quinase, envolvendo a participação dastirosinas quinases citosólicas.
  47. 47. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 39Superfamília do tipo 4: receptores reguladores da transcrição de genesA família de receptores reguladores da transcrição de genes ou receptores nucleares(NR) compreende fatores de transcrição de uma grande família de genes, incluindoreceptores de hormônio da tireóide (TH), esteróides, retinóides, vitamina D, colesterol entreoutros. Os receptores nucleares são bem difundidos e representam importante papel nodesenvolvimento, metabolismo, homeostase e doenças (Togash e col., 2005). A ativaçãodos receptores nucleares ocorre através de ligantes lipofílicos, fosforilação e interação comoutras proteínas. Estes podem ativar ou reprimir genes alvos pela ligação direta ao elementoresponsivo ao DNA como homo- ou hetero-dímeros ou pela ligação de outras classes defatores de transcrição ligados ao DNA. Essa atividade tem sido relacionada à formação decomplexos com moléculas que parecem servir como co-ativadoras ou co-repressoras,causando modificação local da estrutura da cromatina para regular a expressão dessesgenes alvo (Hart, 2002).Os receptores nucleares representam uma classe evolutiva altamente conservada defatores de transcrição em mamíferos, e podem ser classificados de acordo com o tipo dehormônio que se liga a eles. Desse modo os receptores são divididos em: esteróides(glicocorticóides, mineralocorticóides, andrógenos e estrógeno), derivados de esteróides(vitamina D3), não esteróides (hormônios da tireóide, retinóides, prostaglandinas) ereceptores para os quais não foi encontrado ainda um ligante específico (receptores órfãos).A diferente classificação é baseada no modo de ligação ao elemento responsivo ao DNA, eassim são classificados dentro de quatro grupos, dependendo de sua habilidade para seligar à sequência de DNA e dimerizar: (1) os receptores esteróides são associados com aproteína de choque térmico (“shock heat” hsps). A ligação do hormônio leva a mudançaconformacional, dissociação da proteína hsps e ligação a sequências do DNA como homo-dímeros. Deste modo o papel do hormônio é induzir a ligação ao DNA; (2) a segunda classerepresenta os receptores tais como hormônios da tireóide, retinóides, prostaglandinas evitamina D3. Membros dessa classe são ligados ao DNA na ausência do hormônio. Aligação do ligante ao receptor leva a mudança conformacional do domínio de ligação aohormônio e conseqüente ativação transcricional. Os receptores dessa classe sãopredominantemente ligados ao DNA como hetero-dímeros; (3) os receptores órfãos quepodem se ligar ao DNA como formas monoméricas; (4) ou como dímeros (Tenbaum eBaniahmad, 1997).Em geral, os receptores nucleares possuem em comum três domínios: um variáveldomínio amino-terminal de ligação ao promotor, um domínio de ligação ao DNA altamenteconservado (DBD), e um domínio c-terminal menos conservado, de ligação ao ligante (LBD),como apresentado na figura 11 (Ribeiro e col., 1995). O motivo de ligação ao DNA é
  48. 48. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 40 Julho/2010essencial para o reconhecimento do elemento responsivo pelo receptor. O motivo de ligaçãoconsiste de 66 aminoácidos contendo dois motivos em dedos de zinco. Quatro resíduos decisteína altamente conservados são requeridos para coordenar a ligação dos íons Zn2+(Ribeiro e col., 1995; Tenbaum e Baniahmad, 1997). O LBD confere especificidade naligação ao ligante e possui um número de funções reguladas por essa ligação. Essasfunções incluem a liberação do receptor do complexo hsps, translocação para o núcleo,homodimerização, heterodimerizção e ativação transcricional (Ribeiro e col., 1995).Figura 11 – Estrutura dos receptores nucleares. O esquema apresenta os diferentes domínios dosreceptores nucleares. Modificado de Rang e Dale, 2007.
  49. 49. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 41Fisiologia Celular do Plasmodium durante a fase assexuadaLaura Nogueira da CruzLaboratório de Fisiologia Celular e Molecular do Plasmodiumlaurancruz@gmail.comMaláriaMalária é uma das mais importantes infecções por protozoários no mundo causandomorte de mais de 2 milhões de pessoas anualmente (Who, 2005). A Africa subsaarianaconcentra 90% dos casos, no entanto mais de 40% da população mundial está sob risco dadoença, principalmente os habitantes das regiões tropicais e subtropicais do globo (Fig. 1)onde ocorre a distribuição geográfica do mosquito do gênero Anopheles (A. darling, no Brasile A. gambiae, na África), que transmite as espécies infectantes humanas P. falciparum, P.malariae, P. vivax e P. ovale, sendo as três primeiras espécies encontradas no Brasil.P. falciparum é o parasita que mais causa morte por malária no mundo ocorrendo emmaior incidência na África. No Brasil, a maioria dos casos é de P. vivax (Who, 2005).É importante lembrar que a malária pode ser muito mais antiga que a humanidade eexistem quase 100 espécies de plasmódios, 22 dos quais infectam macacos e 50 parasitamaves ou répteis (que tiveram seu apogeu nos períodos Permiano e Triássico, quando osinsetos hematófagos já existiam).Plasmódios de roedores e aves são freqüentemente utilizados, no laboratório, comomodelos experimentais. Entender a complexa biologia do parasita é fundamental para odesenho de novas e mais eficientes drogas e desenvolver novas estratégias para combatera epidemia.Figura 1: Potencial mundial de transmissão de malária.(Fonte : http://en.wikipedia.org/wiki/File:Malaria_geographic_distribution_2003.png)
  50. 50. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 42 Julho/2010Combate à maláriaNos últimos cinqüenta anos muitas pesquisas foram realizadas fomentando odesenvolvimento de drogas sintéticas antimalaricas. A mais importante dessas foi acloroquina que possui baixa toxicidade, baixo custo e necessidade de ser aplicada apenasuma vez por semana. Atualmente, no entanto, um grande problema no combate à maláriadeve-se ao aumento da resistência dos parasitas a cloroquina, derivados de cloroquina e agrande maioria de antimaláricos introduzidos (Olliaro e col., 1996). Para inibir oaparecimento de resistência a WHO recomenda que o tratamento utilize pelo menos ocombinado de 2 anti-maláricos.A incidência da malária, no Brasil, por exemplo, aumentou cerca de 10 vezes nosúltimos 30 anos, sendo que hoje 99% desses casos ocorrem na Amazônia Legal (FNS,2002), área endêmica do país, composta pelos estados do Acre, Amapá, Amazonas,Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins. Nos Estados fora daAmazônia Legal, o risco de transmissão local é pequeno ou inexistente e a quase totalidadedos casos de malária registrada é importada da Amazônia Legal ou de outros países,principalmente da ÁfricaLimitações da quimioterapia no controle da malária demonstram a necessidade denovas drogas, preferencialmente contra novos alvos (McKerrow e col., 1993; Rosenthal,1998), pois apesar de todas as pesquisas e informações adicionais o número de casos demalária vem aumentando e uma vacina eficiente provavelmente não estará disponível nofuturo próximo (Hoffman, 1996). Além disso, os esforços para controlar o mosquitoAnopheles tiveram pouco sucesso (Alonso, 1991).Atualmente o que pode ser feito são medidas de profilaxias para pessoas que sedirigem a áreas de maior transmissão. O regime profilático consiste em prescrição médicados medicamentos antimaláricos de acordo com as espécies de Plasmodium predominantes,grau de risco da infecção da área de destino, perfil de resistência ás drogas e avaliação dosefeitos colaterais associados ao uso das mesmas (Farias, 2005)A quimioprofilaxia deve ser iniciada uma semana antes da viagem, para avaliaçãodos efeitos colaterais, e prolongada por quatro semanas após a saída da área endêmica, afim de sustentar a ausência dos parasitas na corrente sangüínea, mesmo após a suatransição pelo estágio hepático, período de incubação que pode levar á formação de formaslatentes do parasita, responsáveis por recaídas. Contudo, apesar das medidas preventivas,febre no período de dois meses após o curso da quimioprofilaxia ainda pode ser originadapela infecção. Outro propósito da profilaxia se estender por um tempo depois da visita a áreade risco é para evitar que se importe doença para a origem do viajante.
  51. 51. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 43Trabalhos recentes mostram que o controle com telas mosquiteiras impregnadas cominseticida ajuda no combate da malaria. (Chouaibou e col., 2006). A malaria caiu na décadade 50 pelo esforço combinado da cloroquina e do DTT, que combatia o mosquito!Ciclo de vidaO Plasmodium é um parasita eucarioto unicelular, de vida intracelular obrigatória, quemede 1,6 X 1,0 uM e pertence ao filo Apicomplexa. Possui um ciclo de vida caracterizadopela sucessão de várias formas especializadas de desenvolvimentoEm vertebrados, a infecção se inicia pela picada do mosquito Anopheles, fêmea, queretira 3 a 4 microlitros de sangue, enquanto injeta saliva contendo alguns esporozoitos. Umavez na corrente sanguínea, os esporozoitos invadem os hepatócitos e se desenvolvem parao estágio assexuado de merozoito. Durante este período a infecção é assintomática e cadaesporozoito forma 30,000 merozoitos. Estes são liberados diretamente na correntesangüínea e invadem os eritrócitos (Sturn e col., 2006). Na corrente sangüínea amadurecempassando pelos estágios de anel, trofozoito e esquizonte. Por um processo aindadesconhecido, alguns merozoitos não invadem os eritrócitos e se diferenciam emgametócitos, a forma infectante do mosquito (Garcia, 2001).Para o fechamento do ciclo, o mosquito – onde ocorre o ciclo sexual do parasita -terá que picar o vertebrado que tem gametocitos presentes na circulação. Estes, após ociclo no mosquito formarão os esporozoitos que migrarão até a glândula salivar e serãotransmitidos ao hospedeiro vertebrado (Fig. 2).Figura 2: Ciclo de vida da malária (Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Malaria).
  52. 52. VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa”Pág. 44 Julho/2010O ciclo intraeritrocítico é, portanto, o responsável por toda manifestação clínica namalária, sendo na ruptura do eritrócito infectado e conseqüente liberação do parasita parainfecção de novas células que ocorrem febre e tremedeira, típicas da doença (Hawking,1970). Dependendo da espécie de parasita, estes sintomas ocorrem em intervalos distintos –3 ou 4 dias para P. falciparum e P. vivax, respectivamente (Garcia, e col., 2001) (Tab. 1).Função da melatoninaA transição do estágio intraeritrocítico, bem como o processo de invasão in vivo e aprodução de gametócitos são processos altamente sincronizados (Garcia, 2001) e namaioria mamíferos estudados seguem ciclos múltiplos de 24h (Tab. 1)Tabela 1- Período do ciclo intraeritrocítio de diversasespécies de Plasmodium (Modificado de Garcia, e col., 2001).Parasita Hospedeiro vertebrado Período do ciclointraeritrocíticoP. knowlesi primata 24hP. cathemerium pássaro 24hP. vinckei roedor 24hP. chabaudi roedor 24hP. berghei roedor 24hP. yoelii roedor 18hP. gallinaceum galinha 36hP. falciparm homem 48hP. vivax Homem 48hP. cynomolgi Primata 48hP. coatneyi Primata 48hP. malariae Homem 72hP. inui Pássaro 72hP. brasilianum Primata 72hNo caso do desenvolvimento intraeritrocítico do Plasmodium, os processos de divisãocelular e expressão gênica específicas de cada estágio são de extrema importância. Foidemonstrado por Hotta e col., (2000) que o hormônio melatonina é capaz de sincronizar odesenvolvimento do Plasmodium in vivo e in vitro. Quando se mantém parasitas em cultura,
  53. 53. Sinalização CelularJulho/2010 Pág. 45a sincronia é perdida, um dos fenômenos que sugeriram que o hospedeiro tem papelfundamental no estabelecimento do ritmo. (Hotta e col., 2000).A melatonina tem um largo espectro de atuação (vertebrados, plantas e protozoários)podendo ser sintetizada em vários tecidos, porém sua síntese rítmica é confinadaprimariamente à glândula pineal. Este hormônio é sintetizado a partir de serotonina, que estápresente em grande quantidade na glândula pineal.É interessante observar ainda que os precursores da melatonina, que são deviradosdo triptofano, têm o mesmo efeito da melatonina tanto no ciclo celular do Plasmodium quantona mobilização de Ca2+de estoques intracelulares (Beraldo e col., 2005).Hotta e col., (2000) consideram que a melatonina é capaz de ativar a cascata dafosfolipase C que, por sua vez, ativa a via de inositol 1,4,5-triposfato (IP3) e libera Ca2+doretículo endoplasmático (RE), nos estágios trofozoitos do Plasmodium.Homeostasia e sinalização por cálcioVariações na concentração de cálcio intracelular exercem papel fundamental emmuitos processos biológicos de células eucarióticas, como organização do citoesqueleto,divisão e diferenciação celular (Berridge, 2003).As células eucarióticas possuem mecanismos para manter a homeostasia de Ca2+estes incluem uma bomba de cálcio na membrana plasmática, no retículo endoplasmáticoalém de trocadores em organelas intracelulares e na membrana plasmática (Passos eGarcia, 1997; Garcia e col., 1998).Especificamente, para o parasita da malária foi demonstrado a existência de 2compartimentos de Ca2+: um é o clássico retículo endoplasmatico (Passos and Garcia, 1997,Varoti e col., 2003) e o outro é um compartimento ácido (Garcia e col., 1998, Varotti e col.,2003).Sabe-se que para Plasmodium falciparum o Ca2+extracelular é indispensável noprocesso de invasão do eritrócito pelo parasita e estudos fisiológicos mostram envolvimentoda sinalização de Ca2+no processo de maturação do parasita. (Garcia, 1999, Gazarini e col.,2003).Como qualquer célula eucariótica, o citoplasma do eritrócito possui baixaconcentração de cálcio (menor que 100 nM ), sendo que o ambiente extracelular encontradopela maior parte das células eucarióticas situa-se ao redor de 1 mM. A ausência de Ca2+extracelular é normalmente incompatível com as funções normais da célula e suasobrevivência.Dentro deste contexto, nosso laboratório demonstrou que o parasita resolve oproblema de pouco Ca2+no meio em que sobrevive, através da invaginação da membranacitoplasmática do eritrócito, pois no momento da infecção forma o vacúolo parasitóforo (VP)

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