O documento descreve várias técnicas de biologia molecular, incluindo gel de agarose para visualização de DNA, Southern blotting para detecção de DNA específico, enzimas de restrição para corte de DNA em sequências específicas, vetores para transporte de DNA recombinante, reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação de DNA, e sequenciamento de DNA.

1. 01/06/2016
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Técnicas de Biologia molecular
Natalia Bernardi Videira
nataliabvideira@gmail.com
BG515 – Prof. Gonçalo
TÉCNICAS PARA ESTUDO DO DNA E
RNA

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Gel de Agarose
• Objetivo: visualização da presença ou ausência do DNA
• Princípio: Após aplicação de uma corrente elétrica, o DNA
(carga negativa) migra para o polo positivo.
• Através da comparação com um marcador de peso
molecular conhecido é possível comparar o tamanho do
DNA da amostra
Gel de Agarose
• Material:
– Gel de agarose (0,8 a 2%)
– Tampão TAE (tris-acetato-EDTA) ou TBE (tris-borato-EDTA)
– Intercalante de DNA para visualização (brometo de etídeo,
gel red)
– Marcador de peso molecular (DNA ladder)
– Amostra de DNA
• Aplicações:
– Visualização do tamanho do DNA
– Qualidade do DNA (x degradação)
– Permite extração do DNA após purificação do gel

3. 01/06/2016
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Southern Blotting
• Objetivo: detectar um
DNA específico em uma
mistura
• Princípio: uso de sondas
marcadas (de DNA ou
RNA, complementar a
sequencia de interesse)
que hibridizam com o
DNA de interesse
• Técnica desenvolvida
por Edwin Southern.
Southern Blotting
1) DNA é
fragmentado
E aplicado em gel
de eletroforese
2)DNA é
desnaturado
3,4,5,6) DNA é
transferido do
gel para
membrana
7)A membrana
Northern Blotting: Localização de RNA através de sondas
Western Blotting: Localização de proteínas através de anticorpos

4. 01/06/2016
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Enzimas de Restrição
Histórico:
• Werner Abner: descobriu a enzima de restrição (“tesouras
moleculares”)
Estudo com bacteriófagos → bactérias digeriam o DNA viral
• Hamilton Smith: Descreve mecanismo de ação das enzimas de
restrição
O corte gera um par de extremidades coesivas idênticas e as
enzimas clivam as mesmas sequências em qualquer DNA
• Daniel Nathans: primeiro a mostrar
a aplicação tecnológica
Enzimas de restrição : são produzidas
naturalmente por bactérias como
mecanismo de defesa à infecção de DNA viral
Enzimas de Restrição
• Objetivo: clivagem de uma região específica do DNA.
• Princípio: Reconhecem e fazem cortes bifilamentares na
ligação açúcar-fosfato das moléculas de DNA em
sequencias específicas.
• Sítio de restrição: 4 a 6pb – regiões palindrômicas

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Enzimas de Restrição
• Extremidades coesivas (Sticky-ends) ex: EcoRI, HindIII,
BamHI
• Extremidades cegas (Blunt-ends) Ex: NsbI, HaeIII, AluI.
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762009000200006
Vetores
Vetores: molécula de DNA usada como
veículo para transportar artificialmente
um material genético exógeno para
outra célula, onde ele pode ser replicado
e/ou expresso.
Um vetor contendo o inserto de DNA
exógeno é chamado DNA recombinante.
Um vetor contém:
- sítio múltiplo de Clonagem (com sítios
para várias enzimas de restrição),
- marcador de seleção
- origem de replicação adequada
ao hospedeiro (célula que recebe o vetor)

6. 01/06/2016
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Exemplo de tipo de Vetor
Plasmídeos:
Encontrados naturalmente em bactérias
Pequena molécula de DNA circular dentro
da célula
Se replica de forma independente.
Fisicamente separada do DNA cromossomal
Na natureza, os plasmídeos frequentemente carregam
informação adicional que pode beneficiar a sobrevivência
do organismo, por exemplo genes de resistência a
antibióticos.
Plasmídeos artificiais são usados na biologia molecular como vetores,
transportando sequências de DNA recombinante em organismos hospedeiros
Clonagem de DNA
Inserção de um fragmento de DNA em um vetor.

7. 01/06/2016
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Objetivo: amplificação do número de cópias do DNA em
bilhões de vezes
• Princípio: reação enzimática de polimerizaçãodo DNA in
vitro – utiliza DNA polimerase
• Material:
– Amostra de DNA
– DNA polymerase
– Primer Forward e Reverse
– Tampão da enzima
– MgCl2
– dNTP
Tempo
Temp (C)
Desnaturação
95°- 30s
Anelamento
55°- 1min
Extensão
72°- 1min
*Repete ciclo
35 vezes
Ciclo PCR
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

8. 01/06/2016
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Aplicações:
– Diagnóstico de patógenos e doenças hereditárias
– Identificação de anormalidades cromossomais
– Identificação de mutações
– Mutagênese
– Clonagem de genes
– Sequenciamento
– Genotipagem
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

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• Limitações:
– Baixa sensibilidade
– Colorações não quantitativas
– Pobre discriminação entre o
tamanho dos produtos de
PCR
– Resultados não são expressos
em número
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR Real Time
• Objetivo: método quantificativo baseado no PCR
• Princípio: análise da fase exponencial do PCR

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PCR Real Time
• Uso de sondas fluorescentes para quantificar o número de
cópias
PCR Real Time
• Aplicações
– Análise da expressão gênica
– Identificação de polimorfismos e mutações
– Quantificação da carga viral ou outras infecções
– Identificação de translocações genéticas (ex em leucemia
mielóide crônica)

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Produção de cDNA
Objetivo: Como o RNA é muito instável, é
interessante produzir cDNA (DNA complementar) a
partir do mRNA
Princípio: Utiliza a enzima Transcriptase Reversa
que é capaz de realizar a síntese de DNA a partir
de um molde de RNA
Transcriptase Reversa: enzima encontrada nos vírus
de RNA (retrovírus). Quando o vírus infecta seu
hospedeiro ele utiliza a Transcriptase Reversa para
produzir cDNA a partir do seu material genético de RNA,
para depois integrar o cDNA no genoma do hospedeiro
Funciona como se fosse uma reação de PCR no
qual ocorre o anelamento do primer oligo-dT
(TTTTT) com o RNA e síntese do cDNA com a
Transcriptase Reversa, e depois a síntese da
segunda fita do DNA com a DNA polimerase
Sequenciamento de DNA
Objetivo: Obter a sequência de nucleotídeos de uma molécula de
DNA
Princípio: Síntese de cópia do DNA de interesse utilizando-se
nucleotídeos modificados

12. 01/06/2016
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Sequenciamento de Sanger
Desenvolvido na década de 1980
Utiliza ddNTP (trifosfato de didesoxinucleotideo)
Nucleotídeo modificado com capacidade de bloquear a síntese
contínua do DNA
Não possui o grupo 3’-hidroxila, portanto a DNA polimerase não
consegue adicionar outro nucleotídeo após o ddNTP
A reação de síntese da fita de DNA é interrompida quando a
polimerase adiciona o ddNTP
São criadas fitas de DNA com diferentes tamanhos dependendo de
quando o ddNTP foi incorporado
Essas fitas de DNA são aplicadas num gel de acrilamida e “correm”
de acordo com seu tamanho (da menor para a maior)
O equipamento lê a fluorescência dos diferentes ddNTP e indica a
ordem em que eles foram incorporados
Sequenciamento de Sanger
Método inicial era manual
A reação era realizada em quatro tubos separados,
um para cada tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP)
O resultado era visto numa eletroforese em gel
GATC

13. 01/06/2016
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Sequenciamento de Sanger automatizado
Sequenciamento de nova geração
Também conhecido como: Next-generation sequencing (NGS),
high-throughput sequencing.
Termo usado para descrever diferentes novas tecnologias de
sequenciamento:
Illumina (Solexa) sequencing
Roche 454 sequencing
Ion torrent: Proton / PGM sequencing
SOLiD sequencing
Essas técnicas novas permitem sequenciar DNA e RNA de
maneira muito mais rápida e barata, e revolucionaram o
estudo de genômica e biologia molecular.
RNA – seq : sequenciamento de todo o mRNA transcrito na
célula naquele momento.

14. 01/06/2016
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Illumina
https://youtu.be/HMyCqWhwB8E
1) o DNA é fragmentado
2) o DNA é ligado a adaptadores
3) Através do adaptador, o DNA se liga na
placa
4) Através de um PCR de ponte, o número
de cópias do DNA de interesse é aumentado
5) Ocorre o sequenciamento do DNA de
interesse. A polimerização da fita é contínua
e o equipamento consegue ler a
fluorescência de cada base que é
adicionada
http://www.illumina.com/content/dam/illumina-
marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf
Exemplo
Produção de insulina humana em bactéria
Região Codante
Região não-codante
Extração RNA
Células beta
Do pâncreas
Síntese de
cDNA de
Todo mRNA
PCR do cDNA
Da insulina
Clonagem no vetor
Sequenciamento
do vetor
recombinante
Inserção do vetor
(transformação)
da bactéria
Expansão do
número de
bactérias
Produção de
insulina
Extração DNA
humano
X

15. 01/06/2016
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