Successfully reported this slideshow.

Biotecnología Avanzada - Ingeniería de proteínas

1

Share

Upcoming SlideShare
El hibridoma
El hibridoma
Loading in …3
×
1 of 38
1 of 38

More Related Content

Related Books

Free with a 14 day trial from Scribd

See all

Biotecnología Avanzada - Ingeniería de proteínas

  1. 1. Ingeniería de proteínas L.B.G. José Eduardo Almeyda Carbajal Asesor en el desarrollo de nuevos productos. CEMEX-México 17 de mayo de 2014
  2. 2. Índice Diseño Racional Diseño No Racional Diseño guiado por datos o información
  3. 3. $50 por contar todos los puntos rojos
  4. 4. ¿De qué estamos hablando? Producto Producción Anual (Tons) Producto Producción Anual (Tons) Bioetanol 26,000,00 L-Hydroxifenilalanina 10,000 Ácido L-Glutámico 1,000,000 Ácido 6- aminofocelanico 7000 Ácido cítrico 1,000,000 Nicotinamida 3000 L-Lisina 350,000 D-p-hidroxifenilglicina 3000 Ácido láctico 250,000 Ácido 7- aminocefalosporinico 1000 Enzimas de procesamiento de alimentos 100,000 Aspartame 600 Ácido glucónico 50,000 L-metioninca 200 Antibióticos 35,000 Dextran 200 Enzimas para alimentación animal 20,000 Vitamina B12 12 L-Treonina 10,000 Provitaina D2 5 Producto Mercado (Millones US$) Eritropoyetina 6803 Insulina 4017 Factores de coagulación sanguínea 2585 Factor estimulador de colonias 2181 Interferon b 2087 Interferon a 1832 Anticuerpos monoclonales (Cáncer) 1751 Hormona de crecimiento 1706 Antircuerpo monoclonal 1152 Activador de plasminógeno 642 Interleucina 184 Factor de crecimiento 115 Vacunas 50 Otros 2006
  5. 5. Necesaria y divertida introducción Catálisis Reguladoras Estructural Defensa Transporte Receptoras
  6. 6. Necesaria y divertida introducción
  7. 7. Necesaria y divertida introducción
  8. 8. ¿Y la introducción era para?
  9. 9. Ingeniería de proteínas La ingeniería de proteínas, como un sub-disciplina de la ingeniería genética, consiste en el diseño de nuevas proteínas o en la generación de proteínas con funciones nuevas o deseadas. Solvente Proteína mágica Mezcla mágica Exceso de proteína mágica
  10. 10. Lindo, muy lindo ¿Cómo se hace? Diseño racional Diseño No Racional (Evolución Molecular Dirigida) Diseño de proteínas dirigido por datos o información
  11. 11. Diseño racional Resonancia Magnética Nuclear Difracción de rayos X La visualización de determinados dominios o estructuras en las proteínas nos permite determinar cuales podrían convertirse en sustituciones candidatas a ser realizadas en la misma, además del posible efecto sobre la característica a modificar en nuestra proteína. Microscopía electrónica
  12. 12. Circulo de la racionalidad
  13. 13. Pero ¿Cómo le hacemos para racionalizar?
  14. 14. Variante: Proteína de novo Algunas estructuras de uso común en esta estrategia incluyen el uso de los motivos como “Ramillete de cuatro hélices a” (Generación de canales de protones), “Hélice- bucle-hélice” (reducción de tamaño del dominio de unión de inmunoglobulina G) y dedo de zinc.
  15. 15. Método racional: Casos de la vida real Proteína nativa Modificación Motivo Isomerasa de triosafosfato Mutación puntual de ácido glutámico a glutamina Termoestabilidad de 37oC a 26oC Fitasa con estructura de hélice de Bacillus sp. MD2 Mutaciones punctuales E229V y S283R) Incremento de actividad específica Proteína de unión a ribosoma Rediseño completo Cambio de actividad (Isomerasa de triosafosfato) - Usos de péptidos helicoidales Proteínas diiron El problema con el diseño racional es su dificultad de aplicación si se carece de la estructura tridimensional de la proteína.
  16. 16. Diseño NO racional Simula el proceso Darwiniano de evolución, mediante la combinación de mutagénesis al azar y/o técnicas de recombinación de DNA con técnicas de screening o selección de variantes de proteínas que hayan incorporado las propiedades deseadas
  17. 17. Pasos no racionales 1 „ Introducción de mutaciones en la secuencia 2 „ Screening y selección de variantes identificadas con el fenotipo necesario. 3 „ Recombinación entre variantes seleccionadas para producir nuevas combinaciones
  18. 18. Recomendaciones del tío Darwin Función físicamente posible La función debe ser biológica o evolutivamente factible. Debe ser posible construir librerías de mutantes lo suficientemente complejas Método rápido para el screening o selección de las proteínas
  19. 19. Darwin’s ways Método Descripción Mutagénesis por saturación Un aminoácido en determinada posición de una proteína es cambiado por cada uno de los aminoácidos naturales a fin de encontrar cual de ellos otorga propiedades de interés a la proteína analizada. Mutagénesis aleatoria localizada o de región específica” Representaría una combinación entre las estrategias Racional y no Racional, en el que los cambios aleatorios se realizan en regiones específicas de una proteína. DNA shuffling Un grupo de genes con un DNA de doble cadena o secuencias similares son obtenidos por varios organismos o producidos por la técnica de PCR propenso a error Duplicación de genes Se vale de los mecanismos de divergencia naturales que se ejercen sobre aquellos duplicados bajo una presión selectiva más laxa
  20. 20. Aplicaciones (Si, otra tabla) Objetivo Enzima Resultado Método Referencia Enantioselectividad Epóxido hidrolasa Incrementada 13 veces epPCR; DNA shuffling van Loo et al. (2004) Incremento en la promiscuidad de la actividad Anhidrasa carbónica Incrementada 4 veces con 2-naftil acetato Mutagénesis- Recombinación Gloud & Tawfik (2005) Eficiencia catalítica N- acetiltransferasa de glifosato Incrementada 10,000 veces 11 rondas de DNA shuffling Castle et al. (2004) Termoestabilidad Xilanasa Tm incrementada 35oC Mutación por saturación de sitio Palackal et al. (2004) Estabilidad en solventes orgánicos Subtilisina E Incrementada 170 veces en 60% de dimetilformamida Error-prone PCR+Screening Chen & Arnold (1993) Resistencia contra cetotaxima b-lactamasa Incrementada 32,000 veces DNA shuffling Stemmer (1994)
  21. 21. Diseño guiado por datos o información Utiliza secuencias aminoacídicas de las bases de datos y busca coincidencias entre las proteínas de una misma familia u homólogas, donde, se afirma que el aminoácido en la secuencia original debe ser mutado al aminoácido compartido por la mayoría de las secuencias homólogas
  22. 22. Vamos a mezclar a ver que sale Concepto consenso guiado por estructura Diseño Racional Diseño de proteínas dirigido por datos o información
  23. 23. Formula mágica Determinación de aminoácidos del sitio de interés a modificar Búsqueda de secuencias de proteínas con el dominio de interés en bases de datos Construcción de matrices de frecuencias de los aminoácido s del sitio de interés Introducción de las modificaciones mediante el uso de las técnicas del Diseño Racional
  24. 24. No más “tablas” „ Glucosa deshidrogenasa „ Fitasas procedentes del género Aspergillus y Bacillus Termoestabilidad „ Fitasas del tipo ácidas de histidina de hongos o de fitasas con estructura de hélice de bacterias Actividad de enzima „ Cambio en la dependencia de NAD a NADP de lactato deshidrogenasa Cambio de cofactor
  25. 25. Momento de entrar a internet procurando no caer en Facebook
  26. 26. Base de Datos de Proteínas o PDB Depósito de información de la estructura tridimensional de macromoléculas biológicas obtenida de manera experimental (Resonancia Magnética Nuclear, Microscopio electrónico y Rayos X). Archivo PDB RCSB- PDB MSD-EBI PDBj BMRB
  27. 27. Adivinen qué… UNA TABLA Método experimental Proteínas Ácidos nucléicos Complejos ácidos nucléicos proteínas Otros Total Difracción de rayos X 82537 1517 4296 4 88354 NMR 9139 1078 206 7 10430 Microscopía electrónica 523 52 173 0 748 Híbrido 59 3 2 1 65 Otro 155 4 6 13 178 Total 92413 2654 4683 25 99775
  28. 28. Sandra digo, BRENDA BRaunschweig ENzyme DAtabase” o BRENDA consiste en una base de datos se ofrece una visión representativa de las características y variabilidad de cada enzima, a partir de la cual el usuario puede referirse a la literatura original para un estudio más detallado
  29. 29. Pfam: Su familia Amplia colección de familias de proteínas (14831 familias de proteínas hasta marzo del 2013). Componentes Pfam A Pfam B
  30. 30. BioEdit Consiste en una herramienta para el análisis, alineamiento, edición y manipulación de secuencias de aminoácidos y nucleótidos Visualización de códigos de colores Generación e impresión de cromatogramas Generación de dibujos de plásmidos Agrupación de secuencias Vsualización rudimentaria de arboles filogenéticos Construcción de secuencias consenso integradas
  31. 31. Como en show de cocina
  32. 32. Swiss-PDB-Viewer Herramienta de visualización y análisis de la estructura de proteínas y ácidos nucléicos.
  33. 33. HotSpot Wizard
  34. 34. ¿Cómo ocurre magia?
  35. 35. Aún no es todo automático Asignación de los residuos catalíticos. Interacción de subunidade Datos insufientes
  36. 36. Se puso caprichoso el Java
  37. 37. Muchas gracias por su atención Presentación con certificación de:

×