Validación Métodos Lab Clínico

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Validación Métodos Lab Clínico

  1. 1. Validación Métodos Analíticos Cuantitativos, Cualitativos y Semicuantitativos. Rigoberto Marcelo Yáñez Vera Diciembre 2011
  2. 2. Norma NCh2547.Of 2003 <ul><li>5.5 Procedimientos Analíticos. </li></ul><ul><li>5.5.2 El laboratorio debe usar sólo procedimientos validados . </li></ul>VALIDAR VERIFICAR
  3. 3. Validación <ul><li>“ Confirmación mediante el examen y la obtención de evidencias objetivas que aseguran el cumplimiento de una serie de requerimientos particularmente definidos para aplicaciones concretas” </li></ul><ul><li>(ISO 8402-1994 o NCh2000 – ISO 8402). </li></ul>
  4. 4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS CUANTITATIVOS <ul><ul><ul><li>Parámetros de calidad (desempeño analítico): </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- LINEALIDAD </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- EXACTITUD: </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><li>PRECISIÓN: *Repetibilidad </li></ul></ul></ul></ul><ul><li> *Reproducibilidad </li></ul><ul><li>- VERACIDAD, Trazabilidad </li></ul><ul><li>- INCERTIDUMBRE </li></ul><ul><ul><ul><li>-SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- SENSIBILIDAD </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- LÍMITE DE DETECCIÓN </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- LÍMITE CUANTIFICACIÓN </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>- ROBUSTEZ </li></ul></ul></ul>
  5. 5. LL = L. de linealidad LC = L. de Cuantificación LD = L. de Detección ANÁLISIS CUANTITATIVO Concentración Respuesta del instrumento Intervalo lineal LL LC LD
  6. 6. - LINEALIDAD Capacidad del método analítico de obtener resultados linealmente proporcionales entre la concentración del analito y su respuesta. <ul><li>Análisis estadístico : </li></ul><ul><li>*Curva regresión y = a + b x </li></ul><ul><li>*Coeficiente de determinación r 2 </li></ul><ul><li>*Análisis de varianza (regresión) con </li></ul><ul><ul><ul><ul><ul><li>Estimación falta de ajuste </li></ul></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><ul><li>Error residual puro . </li></ul></ul></ul></ul></ul>ANÁLISIS CUANTITATIVO Si p>0,05 es significativo y por ende los datos tienden a ser lineales.
  7. 7. <ul><li>Selección del modelo: Normalmente una línea recta </li></ul><ul><li>y = a + b x </li></ul><ul><li>Establecimiento del diseño experimental: </li></ul><ul><ul><li>dominio experimental: rango de concentraciones </li></ul></ul><ul><ul><li>distribución de las medidas </li></ul></ul><ul><ul><li>número de medidas. </li></ul></ul><ul><li>Estimación de los parámetros del modelo. Regresión por mínimos cuadrados. </li></ul><ul><li>Validación del modelo: ANOVA. </li></ul>ETAPAS DE LA REGRESIÓN
  8. 8. Linealidad: Curva de Calibración IgG INMUNONEFELOMETRÍA Medición instrumental (señal): intensidad de la luz dispersada por los complejos antígenos-anticuerpos .
  9. 9. CURVA CALIBRACION IgG CONCENTRACION mg/dL LECTURA 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200
  10. 10. CURVA CALIBRACIÓN IgG log conc. log lectura INMUNONEFELOMETRÍA -0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4
  11. 11. Exactitud Grado de concordancia entre el resultado de una medición y el valor de referencia aceptado o verdadero Nota: El término “exactitud” cuando se aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la combinación de los componentes aleatorios y de un error sistemático común o de un componente de sesgo (Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)
  12. 12. Exactitud (Norma ISO 3534-1) -Precisión: grado de concordancia entre resultados de mediciones obtenidas independientes bajo condiciones establecidas. -Veracidad: grado de concordancia entre el valor medio obtenido a partir de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado. Exactitud = Precisión + Veracidad
  13. 13. Precisión La precisión depende sólo de la distribución de errores aleatorios y no tiene ninguna relación con el valor verdadero o el valor especificado. -Repetibilidad -Precisión intermedia o reproducibilidad intralaboratorio -Reproducibilidad (Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)
  14. 14. <ul><li>REPETIBILIDAD: </li></ul><ul><li>Es la medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones, sobre el mismo analito, con el mismo método,con el mismo operador, utilizando el mismo instrumento de medida y durante un corto intervalo de tiempo. </li></ul>PRECISIÓN: Grado de concordancia entre resultados de mediciones obtenidas de una serie repetida de análisis, sobre una muestra homogénea , bajo condiciones establecidas (Norma ISO 3534). ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
  15. 15. <ul><li>Media </li></ul><ul><li>Desviación estándar </li></ul><ul><li>Coeficiente de variación </li></ul><ul><li>Análisis de varianza F (comparación de la desviación estándar) </li></ul><ul><li>Estudio homogeneidad muestra: </li></ul><ul><ul><ul><ul><ul><li>Análisis de varianza (F) </li></ul></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><ul><li>Prueba de “t”de Student . </li></ul></ul></ul></ul></ul>ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA PRECISIÓN
  16. 16. REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA LA DETERMINACIÓN IgG. Homogeneidad muestra
  17. 17. <ul><li>REPRODUCIBILIDAD: </li></ul><ul><li>Es la medida de la precisión de los resultados de un método analítico efectuado sobre el mismo analito, pero en condiciones diferentes (diferentes equipos utilizados, el operador, el período de tiempo, etc.) </li></ul>ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN PRECISIÓN
  18. 18. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG IgG mg/dL DÍA 1 DÍA 2 DÍA 3 1556 1568 1564 1568 1543 1606 1624 1556 1585 1481 1598 1556 1598 1602 1535 1518 1413 1568
  19. 19. REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRÍA PARA DETERMINACIÓN DE IgG Análisis de Varianza -------------------------------------------------------------------------------------- Fuente var. SC gl CM F P -------------------------------------------------------------------------------------- Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626 Intra grupos 40682,8 15 2712,19 -------------------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 42179,6 17
  20. 20. VERACIDAD: Grado de concordancia entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y el valor de referencia aceptado (certificado). Norma ISO 3534 <ul><li>Análisis estadístico </li></ul><ul><ul><ul><li>Media experimental </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Desviación estándar experimental </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Prueba de “t” de Student </li></ul></ul></ul>ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
  21. 21. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA PARA DETERMINACIÓN DE IgG MRC DB Lote 084705 931,8 IgG mg/dL 942,3 n = 10 951.8 924,8 918,6 927.1 920,5 938,4 935,2 918,8 Media experimental 930.9 Media certificada 925.0
  22. 22. VERACIDAD INMUNONEFELOMETRÌA PARA DETERMINACIÓN DE IgG Se acepta la hipótesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
  23. 23. Incertidumbre Magnitud asociada con el resultado de medición que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente podrían ser asignados al mesurando
  24. 24. Incertidumbre -Incertidumbre estándar: Incertidumbre de un resultado de medición expresada como desviación estándar. -Incertidumbre estándar combinada: Incertidumbre estándar como resultado de una estimación mediante la propagación de errores con base en las incertidumbres individuales. -Incertidumbre expandida Incertidumbre estándar que se expresa como un intervalo de confianza .
  25. 25. <ul><ul><ul><ul><ul><li>gl = n - 1 (grado libertad) </li></ul></ul></ul></ul></ul><ul><ul><ul><ul><ul><li>nivel  = 0,05 </li></ul></ul></ul></ul></ul>CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE EXPANDIDA U MRC IgG exp. = ± 7,9 mg/dL    
  26. 26. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD Capacidad del método analítico para medir en forma exacta un analito particular dentro de una mezcla compleja, sin interferencia de otras sustancias o analitos. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Magnitud influyente , magnitud que no es el mesurando pero afecta al resultado de la medición (interferencia).
  27. 27. Interferencia de la señal <ul><li>Algunos compuestos presentes en la muestra por un artefacto aumentan o disminuyen la magnitud del mecanismo de detección. </li></ul>Ejemplos: Fluoresceína, EDTA , Azida de Sodio, Lípidos, Complemento, Fibrinógeno, Albúmina
  28. 28. Detección y control de interferencias <ul><li>Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de ausencia de interferencia para valores definidos de las magnitudes. </li></ul><ul><li>Verificar resultados de pacientes con condiciones clínicas asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas, fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro clínico. </li></ul><ul><li>Inspeccionar las muestras visualmente buscando hemólisis, ictericia, lipemia o evaluarlas usando índicadores séricos. </li></ul>
  29. 29. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS <ul><li>Prueba de dilución lineal (las interferencias no se comportan linealmente con la dilución). </li></ul><ul><li>Analizar la muestra por otro método (comparación de métodos). </li></ul><ul><li>Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir sustancias potencialmente interferentes. </li></ul><ul><li>Análisis de muestras enriquecidas con el interferente. </li></ul>
  30. 30. <ul><li>SENSIBILIDAD </li></ul><ul><li>Es la capacidad de un método analítico de registrar ligeras variaciones de la concentración. </li></ul>ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN <ul><li> Sensibilidad </li></ul><ul><li>b = Pendiente obtenida desde la regresión lineal. </li></ul><ul><li>Sm = desviación estándar de la muestra. </li></ul>
  31. 31. LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) Menor concentración o cantidad de analito detectable con razonable certeza por un procedimiento analítico dado. Concentración que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de una muestra blanco. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Y bl = señal promedio del blanco. S bl = desviación estándar del blanco. b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.
  32. 32. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC) Es la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud razonables en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN Y bl = señal promedio del blanco. S bl = desviación estándar del blanco. b = pendiente obtenida desde la regresión lineal del analito.
  33. 33. ROBUSTEZ: Grado de concordancia de los resultados al efectuar cambios en las condiciones operativas y ambientales normalizadas del método. ANÁLISIS CUANTITATIVO VALIDACIÓN
  34. 34. <ul><li>Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina. </li></ul><ul><li>Parámetros estudiar: </li></ul><ul><li>-Efectos del congelado-descongelado </li></ul><ul><li>-Tiempos de incubación </li></ul><ul><li>- Cambio pH tampones </li></ul><ul><li>-Temperaturas de incubación </li></ul><ul><li>-Longevidad de los reactivos </li></ul><ul><li>-Preparación de la muestra </li></ul><ul><li>-Conservación de la muestra. </li></ul>ROBUSTEZ
  35. 35. NORMA NCh 2446.Of1999 – Guía para la validación de métodos de ensayo – Principios y conceptos generales 5 Procedimiento de validación 5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de acreditación deben contar con procedimientos y directrices para planificar y controlar el proceso de validación de métodos de ensayo. Sin embargo, la discusión anterior ha indicado claramente que no puede desarrollarse un procedimiento único . En consecuencia, tiene que desarrollarse una gama de diferentes alternativas de técnicas de validación. Cuán detallada deba ser la validación, depende de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades, riesgos, etc.).
  36. 36. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patologia Molecular SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS: El Laboratorio Clínico debería establecer requisitos y verificar, al menos las siguientes características metrológicas: 1.- Error sistemático (sesgo ). El fabricante del calibrador deberá proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado. Deberá proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados. Sin embargo, el Laboratorio debería obtener sus evidencias que el proceso proporciona resultados satisfactorios 2.- Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deberá proporcionar la información de las interferencias.
  37. 37. DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Española de Bioq. Clín. y Patologia Molecular SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIÓN DE EVIDENCIA OBJETIVA DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS: 3.- Imprecisión interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad Laboratorio. 4.- Límite de detección . El fabricante deberá propocionar especificaciones de imprecisión, sensibilidad y límite de detección. El Laboratorio debería estudiar el límite de detección cuando observa diferencia. 5.- Contaminación 6.- Verificar dilución
  38. 38. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos <ul><li>(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation) </li></ul>Recomendación de validación de métodos de acuerdo a la complejidad de la prueba o determinación: - Pruebas de mínima complejidad (waived tests). No hay recomendación para la validación de método. Seguir directrices del fabricante.
  39. 39. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos <ul><li>(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation) </li></ul>- Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el FDA los estudios de validación de métodos deberian seguir las siguientes recomendaciones: -Verificar los parámetros de calidad o especificaciones de desempeño (demostrar resultados comparables a los establecidos por el fabricante): -Exactitud -Precisión -Rango de los resultados analíticos reportado por el método -Verificar que los intervalos de referencia del fabricante son apropiados para la población de pacientes del laboratorio.
  40. 40. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos <ul><li>(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation) </li></ul>- Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados por el FDA Actividades a realizar por el laboratorio: -Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo. -Replicar muestra o control para estimar la imprecisión -Hacer estudio de linealidad para estimar el rango de la determinación reportado por el fabricante -Obtener valores de referencia para verificar intervalo de referencia indicado por el fabricante
  41. 41. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos <ul><li>(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation) </li></ul>- Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o desarrollados en el laboratorio , la validación de los métodos requiere: -Exactitud -Precisión -Sensibilidad analítica -Especificidad analítica, incluyendo el estudio de sustancias interferentes -Rango de los resultados analíticos reportado por el método -Intervalo de referencia (valores normales) -Cualquier otro parámetro requerido para el desempeño del método
  42. 42. Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) Regulación Validación de Métodos <ul><li>(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations; CAP, College of American Pathologists ; COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation) </li></ul>- Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o desarrollados en el laboratorio Actividades a realizar por el laboratorio: -Comparación de métodos para estimar la inexactitud o sesgo. -Replicar muestra o control para estimar la imprecisión -Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar -Límite de detección para estimar interferencias permanentes -Experimentos de recuperación para estimar proporción de interferencias -Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
  43. 43. Métodos Cualitativos y/o Semicuantitativos <ul><li>En los laboratorios de análisis se generan cada vez más mediciones que dan respuesta rápidas de tipo cualitativo. </li></ul><ul><li>Respuesta de tipo binario: Si / No . </li></ul><ul><ul><li>Presencia o ausencia de determinado analito. </li></ul></ul><ul><ul><li>Presencia o ausencia de un determinado nivel del analito. </li></ul></ul><ul><li>Se denominan sistemas de “ screening ”. </li></ul>
  44. 44. Sistemas de Screening <ul><li>Muchas veces se utilizan como una etapa previa para luego realizar un análisis cuantitativo. </li></ul><ul><li>Evita análisis cuantitativos a muestras que dan negativo. </li></ul><ul><li>A nivel microbiológico generalmente en identificación bacteriana son diagnósticos y no presuntivos. </li></ul>
  45. 45. Análisis cualitativo Sistema de tamizaje ( screening ) Análisis cuantitativo No se analiza > 2 ng/mL < 2 ng/mL NO SI <ul><li>Menor experimentación. </li></ul><ul><li>Decisión rápida. </li></ul><ul><li>De fácil manejo, portátiles, etc. </li></ul><ul><li>Sin necesidad de equipos. </li></ul><ul><li>Ahorro. </li></ul>Presencia del analito Ausencia del analito Método Confirmatorio
  46. 46. Sistemas de Medida Cualitativos <ul><li>Análisis cualitativo clásico o sensorial: </li></ul><ul><ul><li>Color: cambio, aparición. </li></ul></ul><ul><ul><li>Olor. </li></ul></ul><ul><ul><li>Turbidez. </li></ul></ul><ul><ul><li>ELISA. </li></ul></ul><ul><ul><li>Crecimiento bacteriano. </li></ul></ul><ul><li>Detección instrumental: </li></ul><ul><ul><li>UV: fluorescencia, potenciometría. </li></ul></ul><ul><ul><li>Sensores: químicos, bioquímicos, etc. </li></ul></ul><ul><ul><li>ELISA. </li></ul></ul>
  47. 47. Análisis cualitativo clásico o sensorial <ul><li>La respuesta binaria SI / NO se obtiene directamente. </li></ul><ul><li>En general la presencia del analito se determina por comparación con un blanco. </li></ul><ul><ul><li>Pruebas baterías bioquímicas </li></ul></ul><ul><li>Se encuentran también las pruebas de Kits. </li></ul><ul><ul><li>Son dispositivos comerciales para pruebas concretas. </li></ul></ul><ul><ul><li>Contienen todos los reactivos necesarios. </li></ul></ul><ul><ul><li>Pueden contener algún instrumento sencillo. </li></ul></ul>
  48. 48. <ul><li>Pruebas de kits: </li></ul><ul><ul><li>Látex para serotipificar Streptococcus . </li></ul></ul><ul><ul><li>Tiras de orina. </li></ul></ul><ul><ul><li>Pruebas rápidas para meningitis bacterianas. </li></ul></ul><ul><ul><li>API. </li></ul></ul><ul><ul><li>Método de CIM por microdilución en microplacas </li></ul></ul><ul><ul><li>Coaglutinación. </li></ul></ul><ul><ul><li>Método ELISA rápido para detección C. difficile </li></ul></ul>Análisis cualitativo clásico o sensorial
  49. 49. <ul><li>La determinación se hace mediante una medida instrumental: </li></ul><ul><ul><li>Colorimetría. </li></ul></ul><ul><ul><li>Fluoresencia. </li></ul></ul><ul><li>La presencia o no de un determinado analito puede ser el nivel límite de detección o a un nivel superior. </li></ul>Análisis Cualitativo Sensorial
  50. 50. <ul><li>La respuesta instrumental que se obtiene se transforma en respuesta binaria SI/NO e implica un tratamiento de datos. </li></ul><ul><li>Primero hay que establecer la respuesta instrumental: </li></ul><ul><ul><ul><li>Valor de absorbancia para la concentración correspondiente . </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Si el valor es superior la respuesta es Si. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Ej. Métodos automatizados para Hemocultivos. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Ej. Métodos automatizados para CIM. </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Ej. Estandarización automatizada a 0,5 MF. </li></ul></ul></ul>Análisis Cualitativo Sensorial
  51. 51. Método de ELISA <ul><li>Método Semicuantitativo. </li></ul><ul><li>Se basan en una reacción inmunológica . </li></ul><ul><li>La detección puede ser sensorial o instrumental. </li></ul><ul><li>Ej. Bacterias: C. difficile , E. coli . </li></ul><ul><li>Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampión, etc. </li></ul><ul><li>Ej. Parásitos: Chagas </li></ul><ul><li>Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc. </li></ul>
  52. 52. <ul><li>Métodos cualitativos también deben validarse. </li></ul><ul><li>Validar consiste en verificar y documentar su validez a requisitos específicos. </li></ul><ul><li>La validación implica como etapa previa la definición de los requisitos analíticos o de calidad. </li></ul><ul><li>Luego entonces la determinación de estos requisitos. </li></ul><ul><li>Los resultados se expresan diferente a los métodos cuantitativos. </li></ul>Validación Métodos Cualitativos
  53. 53. <ul><li>Métodos Cualitativos </li></ul><ul><li>Análisis Cualitativo / screening </li></ul><ul><li>SI / NO </li></ul><ul><li>Con probabilidad de error </li></ul><ul><li>También tiene dos valores el primero binario y el segundo es la probabilidad de error asociada a la decisión tomada. </li></ul><ul><li>Se expresan en términos probabilísticos. </li></ul>Expresión de Resultados
  54. 54. Requisitos de Calidad Método Cuantitativo Método Cualitativo <ul><li>Linealidad. </li></ul><ul><li>- Homogeneidad. </li></ul><ul><li>Precisión: </li></ul><ul><li>- Repetibilidad. </li></ul><ul><li>- Reproducibilidad. </li></ul><ul><li>- Robustez. </li></ul><ul><li>Veracidad (exactitud). </li></ul><ul><li>Incertidumbre. </li></ul><ul><li>Limite de detección. </li></ul><ul><li>Límite de cuantificación. </li></ul><ul><li>Rango de cuantificación </li></ul><ul><li>Selectividad e Interferentes. </li></ul><ul><li>Especificidad. </li></ul><ul><li>Sensibilidad. </li></ul><ul><li>Valor predictivo positivo (VPP). </li></ul><ul><li>Valor predictivo negativo (VPN). </li></ul><ul><li>Exactitud diagnóstica. </li></ul><ul><li>Límite de corte ( cut-off ). </li></ul><ul><li>Incertidumbre o región de error. </li></ul><ul><li>Límite de detección. </li></ul><ul><li>Robustez. </li></ul>
  55. 55. Especificidad <ul><li>Se define como la capacidad o habilidad del sistema de detectar en forma exacta un analito en una matriz. </li></ul><ul><li>Grado en que un método se ve afectado por otros componentes de la muestra (interferencias) en su capacidad para detectar en forma única un analito en particular en una matriz. </li></ul><ul><li>Se expresa como probabilidad. </li></ul>
  56. 56. Proporción de muestras sin el analito, cuyo método es negativo: E = VN / (VN + FP) Especificidad (E) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos (FP ) Método negativo Falsos negativos (FN) Verdaderos negativos (VN)
  57. 57. <ul><li>Capacidad del método para detectar la menor cantidad del analito particular en una matriz sin interferencia de otros analitos. </li></ul><ul><li>Es la capacidad o habilidad del sistema de detectar muestras positivas cuando realmente son positivas. </li></ul><ul><li>Se expresa como probabilidad. </li></ul><ul><li>Concentración de un analito necesaria para producir una unidad de cambio de lectura instrumental. </li></ul>Sensibilidad
  58. 58. Proporción de muestras que contiene el analito cuyo método es positivo: S = VP / (VP+FN). Sensibilidad (S) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos (FP) Método negativo Falsos negativos (FN) Verdaderos negativos (VN)
  59. 59. Falsos Negativos (FN) <ul><li>Desviación negativa. </li></ul><ul><li>El método a validar da un resultado negativo y el método de referencia da positivo. </li></ul><ul><li>Corresponden a muestras que contienen uno o más analitos por encima del valor límite permitido y que en prueba de screening dan respuesta negativa. </li></ul><ul><li>Se concluye con este resultado previo que la muestra no contiene el analito en los niveles fijados cuando si lo contiene. </li></ul>
  60. 60. <ul><li>Desviación positiva </li></ul><ul><li>Corresponden a aquellas muestras que realmente no contienen el analito en el nivel definido y que por Ej. la prueba de screening lo detecta. </li></ul><ul><li>Se produce cuando el método a validar proporciona un resultado positivo sin confirmación y el método de referencia da un resultado negativo. </li></ul>Falsos Positivos (FP)
  61. 61. Exactitud Diagnóstica <ul><li>Proporción de resultados correctos (verdaderos positivos + verdaderos negativos). </li></ul><ul><li>Es el grado de concordancia entre el resultado obtenido en un ensayo y el valor de referencia que debiera obtenerse. </li></ul>
  62. 62. Proporción de resultados correctos : ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN) Exactitud Diagnóstica (ED) Analito presente Analito ausente Método positivo Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos(FP) Método negativo Falsos negativos(FN) Verdaderos negativos (VN)
  63. 63. Límite de Corte o Cut-off <ul><li>Limite de cuantificación?? </li></ul><ul><li>Número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que pueden determinarse bajo las condiciones experimentales del método evaluado. </li></ul><ul><li>Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos. </li></ul>
  64. 64. Resultados métodos Límite de Corte ( cut-off ) Pacientes “negativos ” Pacientes “positivos ”
  65. 65. Definiciones de Requisitos de Calidad <ul><li>Valor del Límite de Corte ( cut-off ). Valor de corte del método, dado principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y bajo cut-off , resultados negativos. Se basa en una dicotomía (presencia/ausencia, si/no, etc.). </li></ul>C= 2ng/mL
  66. 66. Definiciones de Requisitos de Calidad <ul><li>Región de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisión del método, es un rango donde encontramos error Tipo I o α (Falsos positivos) y Tipo II o β (falsos negativos) del método. </li></ul>C= 2ng/mL α β
  67. 67. Definiciones de Requisitos de Calidad <ul><li>Región de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2): </li></ul><ul><ul><li>C 50 : Concentración del analito donde se produce un 50% de resultados positivos y un 50% de resultados negativos. </li></ul></ul><ul><ul><li>Intervalo C 5 – C 95 : Rango de concentraciones requeridas del analito donde a concentraciones < de C 5 , son resultados concretamente negativos y > C 95 son concretos positivos. </li></ul></ul>Verdaderamente Negativas. Verdaderamente Positivas. C 50
  68. 68. Límite de Detección <ul><li>Cantidad mínima de analito que puede ser detectado en una muestra pero que no puede ser estimado con precisión o sea que no necesariamente es cuantificado en las condiciones del ensayo . </li></ul><ul><li>Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos . </li></ul><ul><li>Los resultados se expresan como detectado / no detectado. </li></ul>
  69. 69. Robustez <ul><li>Efecto Matriz: </li></ul><ul><li>Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee información de su comportamiento en la rutina. </li></ul><ul><li>Identificar variables que pueden tener efectos significativos en la respuesta del método. </li></ul><ul><li>Analizar cada set en condiciones experimentadas dadas y determinar el efecto de cada cambio. </li></ul><ul><li>Efectos congelado/descongelado, tiempos y temperaturas de incubación, cambios pH, preparación y conservación de la muestra y reactivos. </li></ul>
  70. 70. Resumen Definiciones Requisitos de Calidad <ul><li>Especificidad. Proporción de muestras negativas (no reactivas) que son correctamente identificadas. </li></ul><ul><li>Sensibilidad. Proporción de muestras positivas o reactivas correctamente identificadas por la prueba. </li></ul><ul><li>Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como negativa, dé positiva por el método. </li></ul><ul><li>Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como positiva, dé negativa por el método. </li></ul><ul><li>Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra de ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba resulta reactivo. </li></ul><ul><li>Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra de ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo. </li></ul><ul><li>Exactitud diagnóstica analítica. Capacidad del método para detectar correctamente los positivos y los negativos. </li></ul>
  71. 71. Observaciones <ul><li>Hay pruebas en las que tiene un impacto a nivel de Salud pública además de individual dar un resultado Falsos + o Falso -. </li></ul><ul><ul><li>Ej. VIH </li></ul></ul><ul><li>En resistencia antibiótica es de mayor impacto los falsos negativos, o sea informar como sensible cuando es resistente. </li></ul><ul><li>De mayor trascendencia también en Falsos -: </li></ul><ul><ul><li>Hemocultivos, meningitis, resistencia antibiótica, VIH, etc . </li></ul></ul>
  72. 72. Método ideal ‘ Normal’ Enfermo Valores método No falsos positivos o negativos Nr de individuos
  73. 73. Realidad métodos Normal, sin el analito Enfermo, con el analito Valores Método +2SD Falsos Negativos Falsos Positivos Nr de individuos
  74. 74. Resultados métodos Sin enfermedad Con enfermedad Verdaderos Positivos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
  75. 75. Resultados método Sin enfermedad Con enfermedad Falsos Positivos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Patientes “positivos”
  76. 76. Resultados métodos Sin enfermedad Con enfermedad Verdaderos negativos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos ”
  77. 77. Resultados método Sin enfermedad Con enfermedad Falsos negativos Definiciones del ejemplo Pacientes “negativos” Pacientes “positivos”
  78. 78. Evaluador de los requisitos de Calidad <ul><li>Tablas de Contingencia . Diferencian las muestras en dos categorías, (+)/(-) según el método, y establecen una tabla de comparación respecto del resultado obtenido mediante el criterio de exactitud diagnóstica analítica. </li></ul>*CLSI: EP12-A2 Criterio de exactitud diagnóstica Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total POSITIVOS VP FP VP + FP NEGATIVOS FN VN FN + VN Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN
  79. 79. Tablas de Contingencia <ul><li>Las mas simples son las que diferencian las muestras en dos categorías : positivo o negativo. </li></ul><ul><li>Luego se establece una tabla de comparación respecto al resultado obtenido con resultado de método de referencia . </li></ul><ul><li>A partir de la tabla se calculan los cuatro parámetros básicos : falsos+, falsos-, sensibilidad y especificidad. </li></ul>
  80. 80. <ul><li>Ventajas: </li></ul><ul><li>Son de fácil aplicación en la mayoría de los bioensayos. </li></ul><ul><li>Desventajas: </li></ul><ul><li>Dan una medida global de la capacidad del método. </li></ul><ul><li>Se estima que la muestra se comportará estadísticamente de forma similar a las ya analizadas. </li></ul><ul><li>No se calcula una probabilidad de error en cada muestra en particular. </li></ul><ul><li>La capacidad de la tabla depende del número de muestras analizadas. </li></ul>Tablas de Contingencia
  81. 81. <ul><li>Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero (positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B. </li></ul>Evaluador de los requisitos de Calidad P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b) P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b) P(a): prob. de obtener un resultado positivo P(b): prob. de obtener un resultado negativo P(p/a): prob. de obtener un resultado (+) cuando esta presente la enfermedad. P(p/b): prob. de obtener un resultado (+) cuando no esta presente la enfermedad.
  82. 82. <ul><li>Curvas ROC ( Receiver Operating Characteristic o Curvas de Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en la sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificación que se haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de decisión clínica para un analito determinado. </li></ul>Evaluador de los requisitos de Calidad * A. Pulido, I. Ruisánchez, R. Boqué , F.X. Rius
  83. 83. Sensibilidad vs. Especificidad. Sensibilidad vs. 1- Especificidad.
  84. 84. Lectura de las Curvas ROC * http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/
  85. 85. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO - Identificación -Titulo -Protocolo redactado por -Protocolo aprobado por -Objetivo -Alcance -Factores críticos -Selección y tratamiento muestra y MRC -Identificación equipo: certificado calibración -Método analítico: PON -Variables a determinar : análisis estadístico -Personal que desarrollará la validación - Criterio de aceptación para cada parámetro de desempeño -Conclusiones -Registros -Referencias
  86. 86. INFORME DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO -Identificación -Titulo -Informe redactado por -Informe aprobado por -Objetivo -alcance -Responsabilidad -Equipo, materiales, documentos -Procedimiento -Cálculos y análisis estadísticos -Criterio de aceptación vs Resultados -Informe de desviaciones -Informe resultados y conclusiones de validación del método
  87. 87. Gracias por su atención !!!

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