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08 genomica

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Outline of methods for genomic analysis - Human genome diversity

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08 genomica

  1. 1. Capitolo 8 La genomica: la mappatura e il sequenziamento dei genomi Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A http://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4
  2. 2. Domande 8 • In che modo possiamo isolare un tratto di DNA? • In che modo possiamo clonarlo, e perché occorre farlo? • Come si determina la sequenza di un tratto di DNA, o di un cromosoma, o di un intero genoma? • Come si identificano e come si descrivono i geni e le altre regioni importanti del genoma? • Cosa sappiamo del genoma umano e della sua variabilità?
  3. 3. No money? Become a geneticist! Date Time taken N authors Cost (US dollars) 2003 (HGP) 13 years 2,800 2.7 billion 2007 (Venter) 4 years 31 100 million 2008 (Watson) 4.5 months 27 1.5 million Oct. 2008 342,502 Oct. 2009 little 70,333 Oct. 2010 29,092 Oct. 2012 6,618 Oct. 2013 2.5 days (exome) 5,096 Oct. 2017 1 day <1,000
  4. 4. Al 20 aprile 2014, era stato completato il sequenziamento di 18798 genomi e si lavorava su oltre 21626 altri progetti
  5. 5. Al 19 marzo 2015, era stato completato il sequenziamento di 58151 genomi (44430 di procarioti, 1031 di Archea, 7777 di Eucarioti)
  6. 6. Al 27 marzo 2017, è stato completato il sequenziamento di 269968 organismi (245764 di procarioti, 2151 di Archea, 15412 di Eucarioti)
  7. 7. Confronti fra genomi a diverse distanze filogenetiche permettono di rispondere a diverse domande
  8. 8. Studiare proteine e DNA comporta problemi tecnici differenti Si possono separare alleli proteici che differiscono perché più basici o più acidi, grazie alla loro diversa capacità di migrare in campo elettrico Ma tutto il DNA ha la stessa carica elettrica Con l’elettroforesi si possono solo separare frammenti di DNA di diversa grandezza (i più piccoli sono più mobili) È possibile trattare il DNA in modo da ottenere da tutte le cellule un frammento della stessa regione, e riconoscerlo?  Enzimi di restrizione
  9. 9. Figura 8.1 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Gli enzimi di restrizione riconoscono sequenze palindrome e operano un taglio del DNA
  10. 10. Figura 8.2 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Diversi enzimi di restrizione riconoscono diverse sequenze palindrome e operano tagli diversi (estremità adesive, estremità piatte)
  11. 11. Sequenze palindrome riconosciute da diversi enzimi di restrizione
  12. 12. Le sonde o probe sono sequenze marcate che riconoscono sequenze complementari e vi si legano
  13. 13. Digestione con diversi enzimi di restrizione, e isolamento con sonde, di regioni mitocondriali in due specie di ape Melipona
  14. 14. Figura 8.3 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Un taglio che produce estremità adesive permette di generare molecole di DNA ricombinante ligasi
  15. 15. Figura 8.4 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Si possono incorporare tratti di DNA Eucariote in plasmidi batterici, o vettori di clonaggio. I vettori contengono: 1.Una sequenza ori; 2.Un marcatore (qui: ampR ) che consenta di selezionare le cellule batteriche contenenti il vettore; 3.Uno o più siti unici di taglio per enzimi di restrizione, dove verrà incorporato il DNA Eucariote Clonaggio del DNA in vettori plasmidici
  16. 16. Due strategie per isolare una specifica sequenza di DNA Via mRNA e trascrittasi inversa Via enzimi di restrizione e Southern blotting Separazione in colonna Trascrizione inversa cDNA Digestione con enzimi di restrizione Ibridazione con una sonda Lavaggio DNA
  17. 17. Figura 8.5 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A La β galattosidasi, se integra e funzionante, scinde un analogo del galattosio presente sul terreno e provoca la colorazione in blu della colonia batterica Vettore di clonaggio pBluescript II Dimensioni < 15 kb
  18. 18. Figura 8.6 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Per clonare frammenti di dimensioni maggiori si usano vettori BAC (fino a 300 kb) e YAC (fino a 2 Mb) Cromosomi artificiali
  19. 19. Banche genomiche Una banca genomica o library è un insieme di cloni che contiene, o si spera contenga, tutto il DNA di un cromosoma o di un genoma
  20. 20. Figura 8.7 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Creazione di banche genomiche
  21. 21. Polymerase Chain Reaction (PCR): come ottenere tante copie dello stesso DNA Kary Mullis
  22. 22. La PCR produce, attraverso n cicli di denaturazione, annealing ed estensione, 2n copie della molecola di DNA
  23. 23. Figura 8.9 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Sequenziamento Sanger Il DNA stampo viene denaturato, il primer si appaia alla sequenza complementare, presente in una sola delle eliche DNA stampo + primer + desossinucleotidi trifosfati + didesossinucleotidi trifosfati Frederick Sanger Premio Nobel 1958, 1980
  24. 24. Figura 8.10 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Quando sono incorporati nella nuova sequenza, i didesossinucleotidi impediscono che venga aggiunto un nuovo desossinucleotide, e interrompono la reazione Ciascun tipo di didesossinucleotide viene marcato con un fluorocromo che, se stimolato, emette luce a diversa λ
  25. 25. Figura 8.11 (b) (c) Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A Il sequenziatore automatico riconosce le λ delle fluorescenze associate ad ogni didesossinucleotide, e produce un grafico in cui il colore di ciascun picco indica la base nella sequenza
  26. 26. Riassumendo 1. Taglio con enzimi di restrizione. Il genoma, o un singolo cromosoma, o parte di un cromosoma, viene ridotto in piccoli frammenti 2. Clonaggio. I frammenti vengono trasferiti su vettori plasmidici o cromosomi artificiali, così creando una banca genomica 3. PCR. Vengono prodotte molte copie dei cloni di DNA da sequenziare 4. Sequenziamento (Sanger). La sequenza dei nucleotidi di un’elica, o di tutte e due, viene determinata sintetizzando l’elica complementare e utilizzando didesossinucleotidi 5. Assemblaggio. Sequenze di cloni diversi si sovrappongono, e allineandole con metodi bioinformatici si ottengono sequenze più lunghe
  27. 27. Con il sequenziamento a shotgun, si sequenziano i cloni di una library di BAC e li si allinea sfruttando le regioni di sovrapposizione Craig Venter
  28. 28. Next-Generation Sequencing (NGS)
  29. 29. Next-Generation Sequencing (NGS)
  30. 30. Next-Generation Sequencing: allineamento dei reads
  31. 31. Confronto fra Sanger e Next-Generation sequencing
  32. 32. Allineando e confrontando più genomi si individuano polimorfismi di singolo nucleotide, o SNPs (Single-Nucleotide Polymorphisms)
  33. 33. Topic                         Statistic Total size of the genome: approximately 3,200,000,000 bp* Percentage of adenine (A) in the genome: 54% Percentage of cytosine (C) in the genome: 38% Percentage of bases not yet determined: 9% Highest gene-dense chromosome: chromosome 19 with 23 genes per 1,000,000 bp* Least gene-dense chromosomes: chromosome 13 and Y with 5 genes per 1,000,000 bp* Percentage of DNA spanned by genes: between 25% and 38% Percentage of exons: 1.1 to 1.4% Percentage of introns: 24% to 37% Percentage of intergenic DNA: 74% to 64% The average size of a gene: 27,000 bp* The longest gene: dystrophin (a muscle protein) with 2,400,000 bp* Average length of an intron: 3,300 bp* Most common length of an intron: 87 bp* Occurrence rate of SNPs: roughly 1 per 1,500 bp* Occurrence rate of genes: about 12 per 1,000,000 bp* Table of Human Genome Statistics
  34. 34. Ma quanto siamo diversi? Quante basi del DNA lo sono? Due cellule dello stesso individuo 0/1000 Due gemelli identici 0/1000 Due di noi a caso 1/1000 Uno di noi e uno scimpanzè 10-30/1000 Uno di noi e una banana 750/1000
  35. 35. Albero evolutivo del cromosoma X: Kaessmann et al. (2001). Le differenze genetiche nella nostra specie sono le più basse di tutti i primati
  36. 36. Le differenze genetiche fra popolazioni umane sono le più basse fra tutti i primati 0.38 0.15 0.32 Entro popolazioni Tra popolazioni
  37. 37. 100% 100%100% 88%88% 88%
  38. 38. Same diagnosis and treatment Little or no response Side effects or toxicity Genetic polymorphisms affect drug response Good response Why does it matter? Pharmacogenomics
  39. 39. Target genes DME genes (Drug-Metabolising Enzymes) Transporter genes Classes of genes causing variation in drug response
  40. 40. Metabolic rate – CYP2D6 Slow Normal Rapid Amount of metabolite in urine N of individuals Chinese Swedes Populations differ as for allele frequencies, but the whole spectrum of phenotypes is generally present in each of them
  41. 41. Sintesi 8 • Gli enzimi di restrizione permettono di tagliare il DNA ottenendo da diverse cellule gli stessi frammenti • Le tecnologie del DNA ricombinante permettono di integrare tratti di DNA in vettori o cromosomi artificiali, da cui possono essere escissi e identificati da sonde o probe • Si ottengono molte copie di un tratto di DNA attraverso la PCR • Esistono diverse tecniche per ottenere la sequenza di un frammento di DNA; le principali sono l’estensione del primer con l’uso di didesossinucleotidi (metodo Sanger) e il Next-Generation sequencing • Se si fa in modo di ottenere cloni sovrapposti, il loro allineamento consente di ottenere sequenze via via più lunghe • Una volta ottenuta una sequenza più o meno completa, si può scegliere di caratterizzare solo alcuni siti noti per essere polimorfici, o SNP
  42. 42. Sintesi 8 • Nel genoma umano ci sono milioni di siti polimorfici, ma in media la differenza fra due individui è dello 0,1%, la più bassa fra i primati • Gran parte degli alleli umani è presente, a frequenze diverse, in popolazioni diverse e in continenti diversi • Membri della stessa popolazione sono mediamente più simili di membri di popolazioni diverse, ma la varianza intorno a queste medie è altissima • Data la struttura della diversità genomica umana, tentativi di medicina o farmacologia razziale sono irrazionali
  43. 43. C’è una struttura geografica della diversità genomica umana Modified from Lopez-Herràez et al. 2009

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