Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH
CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
T...
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH
CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
T...
i
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn thầy GS. TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tình
hướng dẫn khoa học, hướng dẫn cách tiếp cậ...
ii
TÓM TẮT
Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, với nền sản xuất chủ yếu là
nông nghiệp trong đó lúa là cây lương thực c...
iii
nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh
Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khu...
iv
ABSTRACT
Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria
cultivated on soils of Phu Yen province”
Phu...
v
rice cultivation. The effect of Azospirillum amazonense SHL70 and Bacillus
subtilis TAL4 in rice cultivated on soils of ...
vi
Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phâ...
vii
MỤC LỤC
TÓM TẮT..........................................................................................................
viii
2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh ............................................................... 24
2.4.4.1. Khả ...
ix
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 64
4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của v...
x
4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2
dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng...
xi
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành
phố năm 2014 ...................
xii
Bảng 4.5. Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với
các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI)...
xiii
Bảng 4.23. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm
hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và pro...
xiv
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Các huyện ở tỉnh Phú Yên ............................................................... 5
Hì...
xv
Hình 4.11.B. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với
các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobact...
xvi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene
ARA Acetylene Reduction Assay
ATP Adenosine triphosphate
B...
1
CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Nhu cầu lương thực ngày càng tăng là do áp lực của sự gia tăng dân số
và lúa gạo là ...
2
đạm cho cây trồng, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất
dinh dưỡng, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởn...
3
1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa
* Phạm vi nghiên cứu: cá...
4
- Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, hòa
tan lân khó tan, tổng hợp IAA và định danh, xây dựn...
5
CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên
2.1.1. Điều kiện tự nhiê...
6
- Mùa mưa: kéo dài từ tháng 9 đến tháng 12 dương lịch, chịu ảnh hưởng
của gió Đông Bắc và mưa nhiều.
Nhiệt độ trung bình...
7
Ngoài 2 vụ chính, một số vùng trong tỉnh còn trồng lúa nương (lúa mùa).
Vụ lúa mùa vào tháng 10 hàng năm.
+ Cơ cấu giống...
8
Nam, 2008) trong đó năm 2012 cả nước cần khoảng 9,88 triệu tấn phân bón
các loại:
Bảng 2.2. Nhu cầu và khả năng cung ứng...
9
Khối lượng, tỷ lệ phân bón đã sử dụng trên 1 ha đất canh tác là 560
kg/ha. Tổng diện tích đất tự nhiên của Phú Yên 504.5...
10
năng hấp thụ của bộ rễ không phải là không giới hạn, phần dinh dưỡng chưa
được hấp thụ ngay tồn tại trong dung dịch rất...
11
Như vậy, quá trình khử nitrate cũng là một nguyên nhân gây nên hiện
tượng tổn thất đạm và làm giảm hiệu suất sử dụng ph...
12
Theo Bùi Huy Hiền (2013), phân hữu cơ được chia thành 2 nhóm là phân
hữu cơ truyền thống và phân hữu cơ công nghiệp
Phâ...
13
nhiều vào việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật dùng trong sản xuất phân vi
sinh.
Phân bón vi sinh được chia làm nhiề...
14
- Vi sinh vật ức chế vi sinh vật gây bệnh: các chủng trong thương mại
như Bacillus licheniformis, Bacillus polyfermenti...
15
2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa
2.3.1. Vai trò của đạm đối với cây lúa
Đạm là chất dinh dưỡng rất quan trọng ...
16
bông. Lân có vai trò quan trọng nên khi thiếu lân cây có những biểu hiện về
hình thái bên ngoài, năng suất và chất lượn...
17
đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak,
1997).
Hình 2.2. Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩ...
18
phát triển tốt hơn, tương quan với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp
thu.
* Vi khuẩn Azotobacter
Döbereiner (1...
19
* Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ - Proteobacteria (Gram âm), có dạng
hình que, không hay ít chuyể...
20
thuộc chi Pseudomonas như: P. putida, P. fluorescens, P. syringae có khả
năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực v...
21
Betaproteobacteria
Thân Herbaspirillum seropedicae
Thân Herbaspirillum rubrisubalbicans
Rễ Azoarcus sp.
Rễ Azoarcus ind...
22
2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa
* Qúa trình xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi kh...
23
Tuy nhiên, con đường quan trọng nhất vi khuẩn xâm nhập vào bên trong
mô thực vật là vết thương và vết nhỏ hiện diện khi...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh phú yên

913 views

Published on

Liên hệ page để tải tài liệu
https://www.facebook.com/garmentspace
My Blog: http://congnghemayblog.blogspot.com/
http://congnghemay123.blogspot.com/
Từ khóa tìm kiếm tài liệu : Wash jeans garment washing and dyeing, tài liệu ngành may, purpose of washing, definition of garment washing, tài liệu cắt may, sơ mi nam nữ, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế quần âu, thiết kế veston nam nữ, thiết kế áo dài, chân váy đầm liền thân, zipper, dây kéo trong ngành may, tài liệu ngành may, khóa kéo răng cưa, triển khai sản xuất, jacket nam, phân loại khóa kéo, tin học ngành may, bài giảng Accumark, Gerber Accumarkt, cad/cam ngành may, tài liệu ngành may, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, vật liệu may, tài liệu ngành may, tài liệu về sợi, nguyên liệu dệt, kiểu dệt vải dệt thoi, kiểu dệt vải dệt kim, chỉ may, vật liệu dựng, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, tiêu chuẩn kỹ thuật áo sơ mi nam, tài liệu kỹ thuật ngành may, tài liệu ngành may, nguồn gốc vải denim, lịch sử ra đời và phát triển quần jean, Levi's, Jeans, Levi Straus, Jacob Davis và Levis Strauss, CHẤT LIỆU DENIM, cắt may quần tây nam, quy trình may áo sơ mi căn bản, quần nam không ply, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế áo sơ mi nam theo tài liệu kỹ thuật, tài liệu cắt may,lịch sử ra đời và phát triển quần jean, vải denim, Levis strauss cha đẻ của quần jeans. Jeans skinny, street style áo sơ mi nam, tính vải may áo quần, sơ mi nam nữ, cắt may căn bản, thiết kế quần áo, tài liệu ngành may,máy 2 kim, máy may công nghiệp, two needle sewing machine, tài liệu ngành may, thiết bị ngành may, máy móc ngành may,Tiếng anh ngành may, english for gamrment technology, anh văn chuyên ngành may, may mặc thời trang, english, picture, Nhận biết và phân biệt các loại vải, cotton, chiffon, silk, woolCÁCH MAY – QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY

Published in: Education
  • Be the first to comment

Luận án tiến sĩ chuyên ngành sinh vật học phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh phú yên

  1. 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015
  2. 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa hoc Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP Cần Thơ, 2015
  3. 3. i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy GS. TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, hướng dẫn cách tiếp cận với các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên và chia sẻ để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn
  4. 4. ii TÓM TẮT Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, với nền sản xuất chủ yếu là nông nghiệp trong đó lúa là cây lương thực chính. Nhu cầu phân bón đối với cây lúa là rất lớn, nhưng trong đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên chất dinh dưỡng không cao, song do ý thức và trình độ canh tác của người dân còn thấp. Do vậy để cải thiện năng suất lúa người dân đã lạm dụng phân bón hóa học đã hưởng đến hiệu quả kinh tế và tác động bất lợi đối với môi trường. Vì vậy đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao và đặc biệt là những dòng vi khuẩn này có thể thích nghi tốt với điều kiều thổ nhưỡng và thời tiết ở khu vực tỉnh Phú Yên. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. Trong 3 loại môi trường phân lập chuyên biệt đã chọn được 593 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là vi khuẩn nội sinh cây lúa. Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu. Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Trong số đó 90 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được phân tích vùng tự gen 16S rDNA. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn được định danh có mức tương đồng 97% trở lên so với các dòng vi khuẩn nội sinh trên ngân hàng gen. 90 dòng vi khuẩn thuộc trong 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%). Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 8/22 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% - 75% N (tương đương với 30 kg N - 90 kg N/ha) và 4/8 dòng vi khuẩn có khả năng làm giảm lượng lân vô cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5/ha) cho cây lúa. Trong thí
  5. 5. iii nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (tương đương 60 kg N/ha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô cơ (tương đương 40 kg P2O5/ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo. Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa. Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60 kg N/ha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5/ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt. Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh.
  6. 6. iv ABSTRACT Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” Phu Yen province is located in coastal of Central Vietnam and rice is main crop. Due to low soil fertility, big amount of chemical fertilizers are used for rice production but low ecomomical effect and this may cause environmental pollution and negatively influence human health. Besides that, endophytic bacteria are microorganisms that live in plant tissues and they may be responsible for the supply of biologically fixed nitrogen to their host plant and plant promoting growth such as phosphate solubilization and IAA biosynthesis. Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” was conducted to isolate and select rice endophytes with good characteristics such as high nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA production to produce biofertilizer for rice cultivation in soils of Phu Yen province in the future. Five hundreds and ninety-three of bacterial isolates were isolated from stems and roots of rice samples which were collected from seven districts and Tuy Hoa city in three kinds of medium (LGI, NFb, RMR). Their colonies had round-shape, climy, smooth, colourless or milk-color, yellow and some colonies appeared in much larger size. Using 16S rRNA gene fragments amplified with DNA using eubacterial universal primers (p515FPL and p13B), 556 isolates were identified as endophytic bacteria. A total of 533 endophytic isolates had the ability of nitrogen fixation, in which 457/533 isolates have ability of phosphate solubilization together with IAA biosynthesis. The sequences of selected endophytic bacteria (90 isolates) showed high degrees of similarity to those of the GenBank references strains (between 97% and 99%). From 90 isolates, 27,78% isolates belonged to Bacilli, 1,11% isolates was Alphaproteobacteria, 11,11% isolates were identified as Betaproteobacteria and 53,33% isolates were Gammaproteobacteria, while 6,67% isolates were Bacteroides. Total 22/90 endophytes having high ability of nitrogen fixation and phosphate solubilization were selected from the in-vitro experiments and 8/22 endophytes which could provides from 25% to 75% N and 4/8 endophytes solubilized 50% P2O5 for rice plants in pot experiments. From field experiments, two strains (Azospirillum amazonense SHL70 and Burkholderia vietnamiensis PHL87) fixed and provided 50% of biological nitrogen for rice plants and two strains (Pseudomonas putida TAL1 and Bacillus subtilis TAL4) solubilized and provided 50% P2O5 requirement of
  7. 7. v rice cultivation. The effect of Azospirillum amazonense SHL70 and Bacillus subtilis TAL4 in rice cultivated on soils of two sites (Dong Hoa and Tuy An districts, Phu Yen province) showed that either SHL70, TAL4 or mixture of SHL70 and TAL4 saved 50% N and 50% P2O5 in rice cultivation but grain yield of inoculated rice seeds as same as control treatment 100% N and 100% P2O5 without inoculation. Keywords: endophytic bacteria, high-yielding rice, IAA biosynthesis, nitrogen fixation, phosphate solubilization, Phu Yen.
  8. 8. vi Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” là của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Văn Thị Phương Như
  9. 9. vii MỤC LỤC TÓM TẮT......................................................................................................... ii ABSTRACT..................................................................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG...................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH..................................................................................... xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xvi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ........................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu .................................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 3 1.5. Những đóng góp mới của luận án ............................................................. 3 1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án .................................. 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 5 2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên ............... 5 2.1.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên ..................................................... 5 2.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở tỉnh Phú Yên .................................................. 6 2.2. Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên ............................ 7 2.2.1. Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học ....................................................................... 7 2.2.1.1. Ở Việt Nam ......................................................................................... 7 2.2.1.2. Ở Phú Yên ........................................................................................... 8 2.2.1.3. Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón ............................................................................ 9 2.2.2. Phân bón hữu cơ .................................................................................. 11 2.2.3. Phân hữu cơ - vi sinh ........................................................................... 12 2.2.4. Phân vi sinh .......................................................................................... 12 2.2.4.1. Khái niệm phân vi sinh ..................................................................... 12 2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam ........................ 12 2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa ...................................................... 15 2.3.1. Vai trò của phân đạm đối với cây lúa .................................................. 15 2.3.2. Vai trò của phân lân đối với cây lúa .................................................... 15 2.3.3. Vai trò của phân kali đối với cây lúa ................................................... 16 2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh .............................................................. 16 2.4.1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật .................................................. 17 2.4.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa .................................................... 20 2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa ........................... 22
  10. 10. viii 2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh ............................................................... 24 2.4.4.1. Khả năng cố định đạm ...................................................................... 24 2.4.4.2. Khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................... 26 2.4.4.3. Khả năng tổng hợp IAA .................................................................... 28 2.4.4.4. Đối kháng sinh học ........................................................................... 29 2.4.5. Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong sản xuất phân vi sinh ............................................................................................ 31 2.4.5.1. Phân vi sinh cố định đạm .................................................................. 31 2.4.5.2. Phân vi sinh hòa tan lân khó tan ....................................................... 33 2.4.5.3. Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật ..................... 35 2.4.5.4. Phân vi sinh đa chức năng ................................................................ 35 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 37 3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................... 37 3.1.1. Vật liệu ................................................................................................. 37 3.1.2. Dụng cụ ................................................................................................ 37 3.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 37 3.1.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ........................... 38 3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 41 3.2.1. Thu mẫu lúa ......................................................................................... 42 3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa ...................................................... 43 3.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn. ................. 44 3.2.4. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ................................. 45 3.2.5. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa ............................... 46 3.2.6. Tuyển chọn vi khuẩn nội sinh .............................................................. 50 3.2.6.1. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh ................................................................................................ 50 3.2.6.2. Đo lượng Acethylen bị khử ............................................................. 51 3.2.6.3. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa trồng trong ống nghiệm ......................... 53 3.2.6.4. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn .............. 55 3.2.6.5. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong nhà lưới .............................. 55 3.2.6.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ................ 59 3.2.6.7. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp 2 dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa ............................................................. 61 3.3. Xử lý số liệu ............................................................................................ 63
  11. 11. ix CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 64 4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên .................................................................................. 64 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................... 64 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập ........... 66 4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ........................................ 69 4.3. Kết quả khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa .................. 69 4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4 + của các dòng vi khuẩn ......... 70 4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .. 72 4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn .......... 74 4.4. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp NH4 + cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA ....... 76 4.5. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử và nhận diện gen nifH của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .............................................................. 90 4.5.1. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn ........ 90 4.5.2. Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn ............... 92 4.6. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm ................................................ 93 4.6.1. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn ..................................... 93 4.6.2. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .......................... 95 4.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................................................ 98 4.8. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới .................................................. 102 4.8.1. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ......... 102 4.8.2. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ........ 114 4.9. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 121 4.9.1. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng .................................................................................................... 121 4.9.2. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ......................................................... 128 4.10. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng..................................................................................................... 135
  12. 12. x 4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới..... 135 4.10.2. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ............ 139 4.10.2.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Đông Hòa 139 4.10.2.2. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Tuy An……………………………………………………………….145 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................. 153 5.1. Kết luận ................................................................................................. 153 5.2. Đề xuất .................................................................................................. 153 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...............................................................................155 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 156 PHỤ LỤC...................................................................................................... 173
  13. 13. xi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành phố năm 2014 ................................................................................................... 7 Bảng 2.2. Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 ...................... 8 Bảng 2.3. Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú Yên ................................................................................................................... 8 Bảng 2.4. Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam ........................................................................................................ 14 Bảng 2.5. Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa ........................................... 20 Bảng 3.1. Công thức môi trường LGI ............................................................ 38 Bảng 3.2. Công thức môi trường Nfb ............................................................ 38 Bảng 3.3. Công thức môi trường Burk không đạm ........................................ 40 Bảng 3.4. Công thức môi trường NBRIP lỏng ............................................... 40 Bảng 3.5. Công thức của môi trường dinh dưỡng Yoshida ........................... 41 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ............................... 45 Bảng 3.7. Các giai đoạn của phản ứng PCR .................................................. 46 Bảng 3.8. Thành phần của dãy đường chuẩn NH4 + ........................................ 47 Bảng 3.9. Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5......................................... 48 Bảng 3.10. Thành phần của dãy đường chuẩn IAA........................................ 50 Bảng 3.11. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm....... 54 Bảng 3.12. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan ................................................................................................................... 54 Bảng 3.13. Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu của tỉnh Phú Yên ................. 56 Bảng 3.14. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm......................... 56 Bảng 3.15. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát lân........................... 58 Bảng 3.16. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát đạm trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh.......................................................................................... 59 Bảng 3.17. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát lân trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh.......................................................................................... 61 Bảng 3.18. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn......... 62 Bảng 3.19. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Đông Hòa.............. 62 Bảng 3.20. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Tuy An.................. 62 Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập từ trong cây lúa .................. 65 Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn .................................. 66 Bảng 4.3. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn ........................................ 68 Bảng 4.4. Hàm lượng NH4 + , P2O5 và IAA của 90 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI, Nfb và RMR .............................................................. 77
  14. 14. xii Bảng 4.5. Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA ............................................................................................................. 79 Bảng 4.6. Sự đa dạng của trình tự Nucleotide được phân tích trong phần mềm DNASP 5.10 ......................................................................................... 89 Bảng 4.7. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 40 dòng vi khuẩn ..... 90 Bảng 4.8. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 22 dòng vi khuẩn bổ sung lên cây lúa .............................................................................................. 92 Bảng 4.9. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát đạm................................................................. 94 Bảng 4.10. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát lân................................................................... 96 Bảng 4.11. Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng nội sinh cây lúa .................................................................................................... 99 Bảng 4.12. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Bacillus ..................... 100 Bảng 4.13. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Azospirillum .............. 101 Bảng 4.14. Đặc điểm của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn ...... 102 Bảng 4.15. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa ở giai đoạn 48 NSKG trồng trong chậu .................................................................................................... 104 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu .................................................................................................... 108 Bảng 4.17. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu............................................................................................................... 110 Bảng 4.18. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu ở giai đoạn 48 NSKG............................................................................................................ 116 Bảng 4.19. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch .. 117 Bảng 4.20. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch (110 NSKG) ... 119 Bảng 4.21. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa..................................................................................... 122 Bảng 4.22. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa........................................................................ 124
  15. 15. xiii Bảng 4.23. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo………126 Bảng 4.24. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ............................................................................................................... 129 Bảng 4.25. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ........................................................................................................ 130 Bảng 4.26. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo và protein trong gạo................................... 132 Bảng 4.27. Ảnh hưởng của vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân lên hàm lượng P trong rơm và trong gạo.................................................................... 133 Bảng 4.28. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ở nhà lưới ......... 136 Bảng 4.29. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng ở nhà lưới ............. 137 Bảng 4.30. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng tại huyện Đông Hòa …………………………………………………………...140 Bảng 4.31. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Đông Hòa ............................................................................................................... 141 Bảng 4.32. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo................................................................................................................. 143 Bảng 4.33. Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm …………………..144 Bảng 4.34. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của lúa trồng ở huyện Tuy An…………………………………………………………………………...146 Bảng 4.35. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Tuy An………………………………………………………………………147 Bảng 4.36. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo……………………………………………………………………149 Bảng 4.37. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm…………………..150
  16. 16. xiv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Các huyện ở tỉnh Phú Yên ............................................................... 5 Hình 2.2. Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật .............................. 17 Hình 2.3. Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa ........................... 23 Hình 2.4. Cấu trúc enzyme Nitrogenase ........................................................ 25 Hình 2.5. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 .................................................. 25 Hình 2.6. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học ............................... 26 Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt các nội dung thí nghiệm .......................................... 42 Hình 3.2. Sơ đồ các bước khử mẫu ................................................................ 43 Hình 3.3. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo NH4 + với thuốc thử ............................................................................................. 47 Hình 3.4. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo P2O5 ................................................................................................................ 49 Hình 3.5. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo IAA ................................................................................................................ 50 Hình 4.1. Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy ................... 66 Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường LGI, Nfb và RMR ........................................................................................... 67 Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần ........................................................................................... 68 Hình 4.4. Nhuộm gram tế bào vi khuẩn độ phóng đại 400 lần ...................... 68 Hình 4.5. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn phân lập với 2 mồi p515FPL và p13B ............................................. 69 Hình 4.6. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn TAL4 sau 2 ngày cấy trên môi trường Burk không đạm ............................................................................................. 70 Hình 4.7. Sự biến thiên hàm lượng NH4 + của 533 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 71 Hình 4.8. Sự biến thiên hàm lượng P2O5 của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 74 Hình 4.9. Sự biến thiên hàm lượng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 75 Hình 4.10. Đa dạng về loài của 90 dòng vi khuẩn nội sinh............................. 81 Hình 4.11.A. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacilli có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA……………………………………………………….83
  17. 17. xv Hình 4.11.B. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobacteria có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA………………………………………….84 Hình 4.11.C. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA…………………………………………………..85 Hình 4.11.D. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Pantoea và Pseudomonas có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA................................................ 86 Hình 4.11.E. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter, Stenotrophomonas, Aeromonas, Erwinia và Klebsiella có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA.................................................................................... 87 Hình 4.11.F. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA ............................................................... 88 Hình 4.12. Mối tương quan giữa hàm lượng NH4 + (mg/l) và hoạt tính Nitrogenase trong dung dịch Burk (µmol)………………………...................91 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn nội sinh trên gel agarose…………………………………………………………………....93 Hình 4.14. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của cây lúa 28 NSKG………………………………………………...95 Hình 4.15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên sự cây lúa 28 NSKG………………………………………………………………………...97 Hình 4.16. Hình vi khuẩn TAL1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM)…………..99 Hình 4.17. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM)......................... 100 Hình 4.18. Hình vi khuẩn dòng SHL70 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ... 101 Hình 4.19. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM)......................... 102 Hình 4.20. Chiều cao của cây lúa ở các nghiệm thức 0N trong giai đoạn 48 NSKG ........................................................................................................... 106 Hình 4.21. Bông lúa khi thu hoạch............................................................... 113 Hình 4.22. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 2 dòng vi khuẩn................ 135
  18. 18. xvi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene ARA Acetylene Reduction Assay ATP Adenosine triphosphate Blast N Basic local alignment search tool Nucleotid ĐC Đối chứng FAME Fatty acid methyl ester FAO Food and Agriculture of Organisation GC Gas Chromatography Gen Nif Nitrogen fixing gene IAA Indole acetic acid IFA International Fertilizer industry Association ML Ma lâm MT Môi trường NCBI National centre for biotechnology information NSKC Ngày sau khi cấy NSKG Ngày sau khi gieo PGPR Plant growth promoting Rhizobacteria PCR Polymerase chain reaction PSB Phosphate solubilizing bacteria RFLP Restriction fragment length polymorphism SEM Scanning electron microscope TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TL Trọng lượng TLHC Tỷ lệ hạt chắc Trp Tryptophan VK Vi khuẩn VTCC Vietnam Type Culture Collection
  19. 19. 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nhu cầu lương thực ngày càng tăng là do áp lực của sự gia tăng dân số và lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới. Trong năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt 741 triệu tấn (FAO, 2015). Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng. Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali để tăng trưởng, phát triển tốt và cho năng suất cao. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Ở Việt Nam, tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước trong năm 2014 khoảng 7,8 triệu ha trong đó diện tích trồng lúa tỉnh Phú Yên đạt được 57.021 ha và cần khoảng 10 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014), tuy nhiên hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi. Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần bị rửa trôi theo nước mặt rồi chảy vào các ao, hồ, sông suối gây ô nhiễm nguồn nước mặt và gây ảnh hưởng xấu như gây phì hóa nước và tăng nồng độ nitrate trong nước, một phần phân bón trực di xuống sâu, gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002). Nếu lạm dụng việc sử dụng phân hóa học như hiện nay thì không những gây ra lãng phí mà còn tác động và ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái. Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa. Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững. Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa. Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân bón. Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong sản xuất phân vi sinh, chúng có những đặc tính tốt như có khả năng cố định
  20. 20. 2 đạm cho cây trồng, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Siciliano et al., 2001) trong đó các vi khuẩn nội sinh tiêu biểu như Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Gluconacetobacter, ... Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp nhằm hạn chế phân bón hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng một nền nông nghiệp phát triển bền vững. Điều này rất có ý nghĩa, rất cần thiết trong sản xuất nông nghiệp và trong việc bảo vệ môi trường. Đặc biệt cây lúa cao sản là đối tượng cần được nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh vì đây là loại cây lương thực chính được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên. Hơn nữa, hiện tại ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thưc hiện. 1.2. Mục tiêu Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa thuộc tỉnh Phú Yên. - Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử. - Khảo sát các đặc tính cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được và tuyển chọn những dòng có hoạt tính cao. - Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao và xây dựng mối tương quan di truyền bằng phương pháp sinh hóa, sinh lý, hình thái và di truyền. - Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh bằng các thí nghiệm in vitro, trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
  21. 21. 3 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa * Phạm vi nghiên cứu: các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa được phân lập từ 119 mẫu lúa thu ở 7 huyện và thành phố bao gồm: Huyện Tuy An, Sơn Hòa, Đồng Xuân, Phú Hòa, Tây Hòa, Sông Hinh, Đông Hòa và thành phố Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên. 1.5. Những đóng góp mới của luận án - Phân lập được 593 dòng vi khuẩn trong cây lúa trên 3 loại môi trường LGI, Nfb và RMR và xác định được 556 dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR. Dùng phương pháp so màu xác định được 533 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, trong số đó có 457 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. - Định danh 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm cao và xây dựng mối quan hệ di truyền. - Có 22 dòng vi khuẩn được khảo sát vừa có khả năng cung cấp đạm và đồng thời cung cấp lân cho cây lúa cao sản trong giai đoạn mạ. Trong số đó, có 8 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và 4 dòng vi khuẩn cung cấp lân được khảo sát trong điều kiện nhà lưới và 2 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm, 2 dòng vi khuẩn cung cấp lân hữu hiệu nhất được khảo sát ở điều kiện ngoài đồng. - Kết quả nghiên cứu có 8 dòng vi khuẩn được tuyển chọn và ứng dụng trồng lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng được định danh và mô tả đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Dòng TAL1 tương đồng với chủng Pseudomonas putida (99%), TALa14 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%), TAL4 tương đồng với chủng Bacillus subtilis (99%), TANa5 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%), SHL70 tương đồng với chủng Azospirillum amazonense (98%), PHL87 tương đồng với chủng Burkholderia kururiensis (99%), PHL103 tương đồng với chủng Burkholderia vietnamiensis (99%) và PHL105 tương đồng với chủng Bacillus megaterium (99%). 1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án * Ý nghĩa khoa học - Phân lập và nhận diện được các dòng vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp sinh học phân tử.
  22. 22. 4 - Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao, hòa tan lân khó tan, tổng hợp IAA và định danh, xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh. - Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy. * Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp nguồn giống vi khuẩn tốt (2 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và 2 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan phân lân khó tan thành lân dễ tan cung cấp cho cây lúa) để ứng dụng cho việc nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh dùng trong sản xuất lúa tại Phú Yên. - Kết quả đề tài cũng góp phần làm giảm lượng phân bón hóa học trong sản xuất lúa và sự ô nhiễm môi trường.
  23. 23. 5 CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên 2.1.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên * Vị trí địa lý Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, nằm ở vĩ độ 12°42'36" đến 13°41'28" bắc và kinh độ 108°40'40" đến 109°27'47" đông. Phía bắc giáp tỉnh Bình Định, phía nam giáp tỉnh Khánh Hòa, phía tây giáp tỉnh Đăk Lăk, phía đông giáp biển Đông. Phú Yên có 9 đơn vị hành chính gồm 7 huyện: Đồng Xuân, Đông Hòa, Sông Hinh, Sơn Hòa, Phú Hòa, Tây hòa, Tuy An, 1 thị xã: Sông Cầu và 1 thành phố: Tuy Hòa. Hình 2.1. Các huyện ở tỉnh Phú Yên (Nguồn: Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường, 2010). * Khí hậu Khí hậu của Phú Yên chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương. Lượng mưa trung bình hằng năm khoảng 1.500 - 1.600 mm. Khí hậu được chia làm 2 mùa rõ rệt: - Mùa khô: từ tháng 1 đến tháng 8 dương lịch với khí hậu nóng, chịu ảnh hưởng của gió Tây khô nóng, lượng mưa ít.
  24. 24. 6 - Mùa mưa: kéo dài từ tháng 9 đến tháng 12 dương lịch, chịu ảnh hưởng của gió Đông Bắc và mưa nhiều. Nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,3o C, độ ẩm tương đối trung bình 80 - 85%, được phân bố theo độ cao của địa hình: vùng đồng bằng ven biển có độ ẩm tương đối là 79 - 80%, vùng núi thấp là 81 - 83% (Trung tâm khí tượng thủy văn tỉnh Phú Yên, 2013). * Tài nguyên đất Đất của Phú Yên được hình thành và phát triển trong sự tác động qua lại của sinh quyển nhiệt đới và sự phong phú, phức tạp của cấu trúc địa chất. Tổng diện tích đất tự nhiên của Phú Yên 504.531 ha, đất dành cho sản xuất nông nghiệp 124.815 ha. Diện tích gieo trồng cây hàng năm 94.132 ha, trong đó diện tích trồng lúa 57.021 ha. Đất Phú Yên chia làm 8 nhóm (Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Phú Yên, 2010): - Đất phù sa: chiếm 9,8%, phân bố chủ yếu vùng hạ lưu sông, tập trung chủ yếu hạ lưu sông Ba. Đất thích hợp để trồng cây lương thực, nhất là lúa. - Đất cát ven biển: chiếm 2,6% diện tích, phân bố dọc theo bờ biển. Đất này có thể khai thác để trồng dừa, điều, … - Đất phèn mặn: chiếm 1,4% diện tích, phân bố ở khu vực đồng bằng thấp ven biển. - Đất xám (6,9%), đất đen (3,5%), đất nâu vàng, nâu đỏ trên đá Bazan (65%). Ba loại đất này thích hợp cho việc trồng cây ăn quả, cây công nghiệp, … - Đất mùn vàng đỏ: 2,2% - Đất vàng đỏ trên đá Granite 2.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở Phú Yên + Diện tích đất trồng lúa Năm 2014, toàn tỉnh có 57.021 ha lúa, trên các vùng đất thuộc các huyện: Tây Hòa, Đông Hòa, Phú Hòa, Sơn Hòa, Sông Hinh, Tuy An, Đồng Xuân, Sông Cầu và thành phố Tuy Hòa. Các huyện có diện tích lúa cao như Tây Hòa (6.647 ha), Phú Hòa (5.518 ha), Đông Hòa (4.811 ha). Tổng diện tích lúa vụ đông xuân năm 2013 - 2014 là 26.854 ha, vụ hè thu năm 2014 là 24.387 ha và diện tích lúa mùa 5.780 ha (Sở Nông nghiệp Phú Yên, 2014). + Lịch thời vụ Lúa được trồng 2 vụ chính: đông xuân và hè thu - Vụ đông xuân: gieo tháng 12 và thu hoạch khoảng cuối tháng 3. - Vụ hè thu: gieo tháng 6 và thu hoạch vào khoảng tháng 9
  25. 25. 7 Ngoài 2 vụ chính, một số vùng trong tỉnh còn trồng lúa nương (lúa mùa). Vụ lúa mùa vào tháng 10 hàng năm. + Cơ cấu giống: Sử dụng phổ biến các giống lúa: ML213, ML68, ML216, ML4-2, ML48, PY2… + Năng suất lúa Năng suất bình quân đạt khoảng 6,5 tấn/ha, sản lượng đạt 365.325 tấn/năm, trong đó vụ đông xuân năng suất đạt được 7,0 tấn/ha, sản lượng đạt 188.641 tấn, vụ hè thu năng suất 6,5 tấn/ha, sản lượng đạt 157.748 tấn và vụ mùa (trồng lúa nương) năng suất ước tính 3,3 tấn/ha, sản lượng đạt 18.936 tấn/ha. Như vậy, với sản lượng lương thực ổn định gần 370.000 tấn/năm, đảm bảo lương thực cho hơn 860.000 người. Một số địa phương có năng suất lúa khá cao như: Thành phố Tuy Hòa (8,2 tấn/ha), huyện Phú Hòa (7,6 tấn/ha), Đông Hòa (7,4 tấn/ha), huyện Tây Hòa đạt (7,2 tấn/ha) trong vụ Đông Xuân 2013 - 2014 (Sở Nông nghiệp Phú Yên, 2014). Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành phố năm 2014 TT Địa Phương Vụ Đông Xuân 2013 -2014 Vụ Hè Thu 2014 Diện tích Năng suất Sản lượng Diện tích Năng suất Sản lượng (ha) (tấn) (tấn) (ha) (tấn) (tấn) 1 TP Tuy Hòa 2.042 8,20 16.749 2.02 7,13 14 2 TX. Sông Cầu 903.000 4,60 4.154 267 2,05 547 3 H. Tuy An 2.850 6,39 18.224 1.084 6,04 6.549 4 H. Sơn Hòa 925.000 5,80 5.365 2.204 6,07 13.377 5 H. Đồng Xuân 1.587 6,10 9.689 805 6,01 4.837 6 H. Phú Hòa 5.518 7,62 42.069 5.518 6,86 37.87 7 H. Tây Hòa 6.647 7,27 48.319 6.492 6,81 44.213 8 H. Sông Hinh 1.571 5,40 8.481 1.44 5,40 7.776 9 H. Đông Hòa 4.811 7,40 35.591 4.706 6,20 29.168 Tổng cộng 26.854 7,02 188.641 24.387 6,47 157.748 Nguồn: Sở nông nghiệp và PTNT Phú Yên (2014) 2.2. Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên 2.2.1. Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học 2.2.1.1. Ở Việt Nam Nhu cầu phân bón hàng năm của Việt Nam khoảng 7,5 - 8 triệu tấn phân bón các loại trong đó loại phân NPK có nhu cầu cao nhất khoảng 2,5 triệu tấn/năm, kế đến là phân urea (2 triệu tấn/năm), phân lân (1,3 triệu tấn/năm). Nhu cầu từng loại phân bón: phân urea chiếm 25%, phân SA 7%, phân kali 9%, phân DAP 9%, phân lân 17%, phân NPK 33% (Báo cáo nông sản Việt
  26. 26. 8 Nam, 2008) trong đó năm 2012 cả nước cần khoảng 9,88 triệu tấn phân bón các loại: Bảng 2.2. Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 (Đơn vị: Triệu tấn) Loại phân bón Nhu cầu Sản xuất Nhập khẩu Urea 2,000 1,750 0,250 SA 0,710 - 0,710 DAP 0,950 0,300 0,650 Kali 0,920 - 0,920 NPK 3,500 3,400 0,100 Phân lân 1,620 1,800 - Tổng số 9,880 7,250 2,630 (Nguồn: Cục trồng trọt, 2012) Nhu cầu phân bón hóa học cho sản xuất nông nghiệp nước ta năm 2013 khoảng 10,3 triệu tấn phân bón các loại. Trong đó có 2,2 triệu tấn phân urea, 850 ngàn tấn SA, 950 ngàn tấn kali, 900 ngàn tấn DAP, 3,8 triệu tấn NPK và 1,8 triệu tấn lân. Tuy nhiên, hiện nay sản xuất công nghiệp phân bón trong nước mới đáp ứng 77,6%, vẫn phải nhập khẩu 2,47 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014). 2.2.1.2. Ở Phú Yên Kết quả thống kê của Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Phú Yên năm 2012, hàng năm tỉnh đã sử dụng 45.000 - 50.000 tấn phân bón hóa học các loại: - Phân đạm urea: 17.000 tấn - Phân lân: 23.000 tấn - Phân kali: 6.000 tấn Bảng 2.3. Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú Yên Năm Tổng lượng phân bón (ĐVT: tấn) 2004 48.845 2005 47.969 2006 49.286 2007 48.417 2008 47.486 2009 47.943 2010 48.214 2011 48.523 (Nguồn: Sở Nông nghiệp và PTNT Phú Yên, 2012)
  27. 27. 9 Khối lượng, tỷ lệ phân bón đã sử dụng trên 1 ha đất canh tác là 560 kg/ha. Tổng diện tích đất tự nhiên của Phú Yên 504.531 ha, diện tích đất dành cho sản xuất nông nghiệp là 124.815 ha. Diện tích gieo trồng cây hàng năm 94.132 ha trong đó diện tích trồng lúa 57.021 ha. Đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên có độ phì không cao, vì vậy trong quá trình trồng lúa nông dân đã sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học các loại như phân đạm dạng urea, phân lân và kali. Lượng phân bón cho lúa tính cho 1 ha trong 1 vụ gồm 120 kg N, 80 kg P2O5 và 60 kg K2O. Trong năm 2011 đã sử dụng 45.710 tấn, bao gồm 17.000 tấn phân đạm, 22.168 tấn phân lân và 6.542 tấn phân kali (Sở Nông nghiệp và PTNT Phú Yên, 2012). 2.2.1.3. Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón * Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học Tốc độ sản xuất và tiêu thụ phân bón của thế giới và Việt Nam không ngừng tăng lên. Bất cứ một loại phân bón nào cũng không thể được thực vật hấp thụ toàn bộ, hệ số sử dụng phân bón của cây trồng ở mức thấp. Hiệu suất hấp thụ phân bón tùy theo loại đất, giống cây trồng, thời vụ, phương pháp bón, loại phân bón, ... Theo Nguyễn Đức Khiển (2002), cây trồng chỉ sử dụng 35 - 40% lượng phân đạm bón vào đất, lượng đạm còn lại bị mất đi do nhiều nguyên nhân khác nhau. Ở Việt Nam hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi. Nhu cầu sử dụng phân bón Việt Nam năm 2010 là 8,9 triệu tấn, như vậy lượng mất đi khoảng 5,3 - 5,7 triệu tấn (Hoàng Văn Tại, 2011). Chỉ có 30 - 45% lượng phân đạm, 40 - 50% phân kali và không quá 30% lượng phân lân được cây trồng hấp thụ, phần còn lại bị tổn thất do nhiều nguyên nhân. Ở Việt Nam, chỉ tính riêng phân đạm, khi nhu cầu sử dụng là 3,3 triệu tấn urea/năm thì tổn thất hàng năm đã lên tới khoảng 1,5 triệu tấn. Lượng phân bón dư thừa sẽ gây ô nhiễm môi trường (Nguyễn Đức Khiển, 2002). * Các quá trình và nguyên nhân gây tổn thất lượng phân bón hóa học + Quá trình hòa tan Tất cả các dạng phân hóa học sau khi bón vào đất đều phải trải qua các quá trình phân giải phức tạp, đầu tiên là quá trình hòa tan và khuếch tán. Tốc độ hòa tan phụ thuộc vào độ tan của phân bón, độ pH, nhiệt độ môi trường và một số yếu tố quan trọng khác, trong đó độ tan là yếu tố ảnh hưởng nhất. Quá trình hòa tan của phân bón là quá trình cần thiết để cây trồng có thể hấp thụ được chất dinh dưỡng thông qua hoạt động của bộ rễ. Tuy nhiên, khả
  28. 28. 10 năng hấp thụ của bộ rễ không phải là không giới hạn, phần dinh dưỡng chưa được hấp thụ ngay tồn tại trong dung dịch rất dễ bị rửa trôi theo nước tưới, nước mưa và các hình thức thẩm lậu khác nhau. Đây là nguyên nhân cơ bản gây tổn thất phân bón trong quá trình sử dụng (De Datta, 1987). + Quá trình thủy phân Trong quá trình thủy phân, do tác động của hệ vi sinh vật đất, đặc biệt là các vi khuẩn sản sinh enzyme urease, urea được chuyển hóa dần sang dạng muối ammoni. (NH2)2CO + 2 H2O (NH4)2CO3 (NH4)2CO3 là hợp chất không bền, dễ bị phân giải, giải phóng ra NH3 và CO2. (NH4)2CO3 2NH3 + CO2 + H2O Phản ứng phân giải (NH4)2CO3 xảy ra rất mạnh khi nhiệt độ môi trường tăng, ở nhiệt độ > 30o C, (NH4)2CO3 bị phân hủy hoàn toàn. Đây là quá trình tổn thất dinh dưỡng lớn làm ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng của phân đạm (De Datta, 1987). + Quá trình nitrate hóa Quá trình nitrate hóa (nitrification) xảy ra thông qua hai giai đoạn liên tục. Đầu tiên, vi khuẩn Nitrosomonas chuyển đạm ở dạng amoni sang dạng nitrite. Sau đó vi khuẩn Nitrobacter chuyển nitrite sang dạng nitrate. Quá trình nitrate hóa xảy ra dưới tác động của hệ vi sinh vật nên chịu ảnh hưởng rõ rệt của yếu tố nhiệt độ. Khi nhiệt độ đất > 10°C, độ pH của đất > 5 thì quá trình nitrate hoá xảy ra rất nhanh, ở nhiệt độ 30°C thì sau 15 ngày có trên 90% lượng đạm ở dạng ammoni bị chuyển hoá sang dạng nitrite. Anion NO3 - mang điện tích cùng dấu với điện tích của hạt keo đất nên chúng đẩy nhau, vì vậy nitrate rất dễ bị rửa trôi. Đây là nguyên nhân chính gây tổn thất đạm thông qua quá trình nitrate hóa. + Quá trình khử nitrate Quá trình khử nitrate (denitrification) là quá trình không thuận nghịch, xảy ra dưới tác dụng của các vi khuẩn khử nitơ theo xu hướng chuyển hóa, phân giải nitrate thành các hợp chất của nitrogen ở dạng khí, thoát vào khí quyển NO3 - NO2 - NH2OH NH3 N2O N2 urease
  29. 29. 11 Như vậy, quá trình khử nitrate cũng là một nguyên nhân gây nên hiện tượng tổn thất đạm và làm giảm hiệu suất sử dụng phân đạm trong nông nghiệp (De Datta, 1987). * Quá trình cố định lân liên quan đến thành phần cơ lý của đất Tính chất và thành phần cơ lý của đất có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất sử dụng phân bón và năng suất cây trồng. Khi nhiệt độ môi trường hoặc điều kiện canh tác thay đổi, hàm lượng các ion H+ , Al3+ và Fe2+ thay đổi theo làm tăng nhanh hàm lượng sắt, nhôm di động trong đất, hiện tượng này gọi là đất bị chua hóa hoặc đất bị nhiễm phèn. Khi đó các ion Al3+ và Fe2+ sẽ khuếch tán và kết tủa lên bề mặt bộ rễ của cây trồng, làm cho rễ mất khả năng hô hấp và hấp thụ chất dinh dưỡng. Đất giàu sắt và nhôm di động sẽ làm giảm hiệu quả sử dụng của phân lân do hiện tượng cố định lân trong đất. Lân dễ tan bị chuyển hóa thành lân khó tan, được giữ lại trong hệ keo đất dưới dạng không hữu hiệu nên cây trồng không thể hấp thụ được. Quá trình cố định lân gây ra bởi các tác nhân hydroxid sắt, nhôm ngậm nước. Các khoáng sét trong đất với cấu trúc kaolinit có năng lực cố định lân cao hơn nhiều so với các khoáng sét có cấu trúc kiểu hydromicat, vetmiculic, thông qua các hydroxid trên bề mặt. X-OH + H3PO4 XH2PO4 + OH- (X là Al3+ và Fe2+ ) Khi pH giảm, kaolinit trở nên trội điện tích dương và sự hấp phụ lân tăng đột ngột, nhất là ở giai đoạn khi pH từ 5 chuyển xuống 4 và thấp hơn, vì độ hoà tan của Al tăng nhanh. Lân bị hấp phụ trên bề mặt các oxid hydrat hoá của Fe và Al tinh thể hoặc vô định hình, về bản chất là những keo dương trao đổi OH- với anion PO4 3- . Năng lực cố định lân phụ thuộc bản chất của đất, khó có thể cải tạo căn bản mà chỉ có thể điều khiển cục bộ trong phạm vi hệ rễ và cải thiện môi trường đất (Sanyal và De Datta, 1991). Khác với lân, kali là nguyên tố có năng lực trao đổi ion mạnh nên khả năng chuyển hoá K2O ở dạng tổng số sang dạng trao đổi khá dễ dàng. Việc thất thoát phân kali trong đất xảy ra do rửa trôi và làm hàm lượng kali trong đất giảm nhanh. 2.2.2. Phân bón hữu cơ Theo Vũ Ngọc Nông (1999), phân hữu cơ là các loại chất hữu cơ đã phân hủy và có khả năng cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Phân hữu cơ là tên gọi chung của các loại phân được sản xuất từ các vật liệu hữu cơ như xác bã thực vật, phân chuồng, phân xanh, các chế phẩm nông nghiệp và công nghiệp.
  30. 30. 12 Theo Bùi Huy Hiền (2013), phân hữu cơ được chia thành 2 nhóm là phân hữu cơ truyền thống và phân hữu cơ công nghiệp Phân hữu cơ truyền thống là loại phân có nguồn gốc từ các chất thải của người, động vật hoặc từ các phế phẩm trong trồng trọt, chăn nuôi, chế biến nông lâm, thủy sản, rác thải hữu cơ, các loại than bùn được chế biến theo phương pháp ủ truyền thống. Phân hữu cơ truyền thống có thể chia làm 4 loại: phân chuồng, phân xanh, phân than bùn và phân rác. Phân hữu cơ công nghiệp được chế biến từ các nguồn hữu cơ khác nhau để tạo thành phân bón tốt hơn so với nguyên liệu thô ban đầu. Có thể chia làm 5 loại: phân hữu cơ, phân hữu cơ khoáng, phân hữu cơ sinh học, phân vi sinh và phân hữu cơ vi sinh. Hiện nay, phân hữu cơ công nghiệp là dạng phân bón ít ảnh hưởng đến môi trường. Tuy nhiên, do sự phát triển của phân bón hóa học với tiện dụng của nó mà việc sử phân hữu cơ này ngày càng ít đi, đặc biệt trong canh tác lúa (Bùi Huy Hiền, 2013). 2.2.3. Phân hữu cơ - vi sinh Phân hữu cơ - vi sinh là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn như vi sinh vật cố định đạm, vi sinh vật phân giải lân, vi sinh vật kích thích sự sinh trưởng cây trồng, vi sinh vật đối kháng, .... với mật số lớn hơn 106 tế bào/g. Phân vi sinh góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản và không ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (TCVN 6169: 1996). 2.2.4. Phân vi sinh 2.2.4.1. Khái niệm phân vi sinh Theo TCVN 6169:1996, phân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều dòng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật số đạt 106 tế bào/g. Thông qua quá trình hoạt động của chúng, sau khi bón vào đất tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (N, P, K) góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản. Phân vi sinh đảm bảo không gây ảnh hưởng xấu đến người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. 2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam Ở Việt Nam, phân vi sinh cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh phân giải lân đã được nghiên cứu từ 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin trên chất mang than bùn được hoàn thiện. Ngày nay các nhà khoa học đã tập trung
  31. 31. 13 nhiều vào việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật dùng trong sản xuất phân vi sinh. Phân bón vi sinh được chia làm nhiều dạng khác nhau tùy công nghệ sản xuất, tính năng, trạng thái vật lý và tác dụng của vi sinh vật có trong phân bón. + Tuỳ công nghệ sản xuất, người ta có thể chia phân vi sinh thành hai loại: - Phân vi sinh trên nền chất mang khử trùng. - Phân vi sinh trên nền chất mang không khử trùng. + Dựa vào đặc tính tác dụng của vi sinh vật sử dụng bao gồm các loại: - Phân vi sinh cố định đạm. - Phân vi sinh hòa tan lân khó tan sản xuất từ các vi sinh vật có khả năng chuyển hoá lân khó tan thành lân dễ tan cho cây trồng sử dụng. - Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật chứa các vi sinh vật có khả năng sản sinh các hoạt chất sinh học có tác dụng điều hoà, kích thích quá trình trao đổi chất của cây. - Phân vi sinh chức năng: là sản phẩm không chỉ có chứa các vi sinh vật làm phân bón như cố định đạm, hòa tan lân khó tan, kích thích sinh trưởng thực vật mà còn có các loại vi sinh vật có khả năng ức chế, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cây trồng (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2001). + Dựa theo trạng thái vật lý của phân bón: Căn cứ vào trạng thái vật lý của phân bón, có thể chia phân bón vi sinh thành các loại sau: - Phân vi sinh dạng bột. - Phân vi sinh dạng lỏng. - Phân vi sinh dạng viên được tạo thành khi sinh khối vi sinh vật được phối trộn và xử lý cùng chất mang tạo thành các hạt phân bón có chứa các vi sinh vật sống đã được tuyển chọn (Nguyễn Minh Hưng, 2007). Hiện nay ở Việt Nam có hơn 10.000 chủng vi sinh vật được bảo tồn và lưu trữ ở các nơi như: Bảo tàng giống vi sinh vật VTCC, Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, ... Các chủng vi sinh vật và hoạt tính sinh học chính được sử dụng trong sản xuất phân bón nông nghiệp: - Vi sinh vật cố định đạm: Rhizobium (R. leguminosarum), Bradyrhizobium (B. japonicum), Frankia (F. alni), Azotobacter (A. chroococcum, A. vinelendii), Azospirillum (A. lipoferum). - Vi sinh vật hòa tan lân khó tan: các chủng được dùng trong thương mại như Bacillus megaterium, B. circulans, B. Subtilis, …
  32. 32. 14 - Vi sinh vật ức chế vi sinh vật gây bệnh: các chủng trong thương mại như Bacillus licheniformis, Bacillus polyfermenticus, … - Vi sinh vật sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật: các chủng được dùng trong thương mại như Pseudomonas fluorescens, Azotobacter chroococcum, …. Bảng 2.4. Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam (Nguyễn Minh Hưng, 2007) TT Giống vi sinh vật Hoạt tính sinh học chính Số loài sử dụng trong sản xuất 1 Acetobacter Cố định nitơ tự do 2 2 Achromobacter Hòa tan lân khó tan 2 3 Aerobacter Cố định nitơ tự do 2 4 Agrobacterium Cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng 2 5 Anthobacter Kích thích sinh trưởng 2 6 Aspergillus Hòa tan lân khó tan 2 7 Azospirillum Cố định nitơ tự do 2 8 Azotobacter Cố định nitơ tự do 4 9 Azotomonas Cố định nitơ tự do 2 10 Bacillus Cố định nitơ tự do 2 11 Bacillus Hòa tan lân khó tan 4 12 Clostridium Cố định nitơ tự do 3 13 Chlorobium Cố định nitơ tự do 2 14 Frankia Cố định nitơ tự do 2 15 Flavobacterium Kích thích sinh trưởng 2 16 Klebsilla Cố định nitơ tự do 2 17 Methanobacterium Cố định nitơ tự do 2 18 Pseudomonas Cố định nitơ tự do 2 19 Pseudomonas Hòa tan lân khó tan 4 20 Penicillium Hòa tan lân khó tan 2 21 Rhizobium Cố định nitơ tự do 300 22 Rhodospirillum Cố định nitơ tự do 4 23 Pisolithus Cố định nitơ tự do 6 24 Serratia Hòa tan lân khó tan 2 Các vi sinh vật sử dụng trong phân sinh học có khả năng cố định đạm, hòa tan kali và lân khó tan hoặc kích thích sự phát triển thực vật. Hầu hết các vi sinh vật sử dụng để sản xuất phân vi sinh có liên quan chặt chẽ với rễ cây, vùng đất xung quanh rễ hoặc ở trong thân và lá của cây trồng. Phân bón vi sinh ở Việt Nam, mặc dù được nghiên cứu từ lâu. Song do tác động của nhiều yếu tố nên mức độ ứng dụng hiện nay còn hạn chế.
  33. 33. 15 2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa 2.3.1. Vai trò của đạm đối với cây lúa Đạm là chất dinh dưỡng rất quan trọng đối với cây lúa, theo thống kê trên thế giới có khoảng 67% tổng lượng phân bón dùng cho cây lúa (Vlek và Byrnes, 1986). Khả năng hấp thu đạm của cây lúa dựa vào giai đoạn phát triển, tùy lượng đạm trong đất và phân bón. Phân đạm được cây hấp thụ chủ yếu ở giai đoạn bắt đầu sự phát triển, đất sau khi bón đạm bị mất đi hoặc tồn lưu (Bufogle et al., 1997). Mối liên quan giữa đạm hấp thu và tổng lượng đạm cần thiết cho giai đoạn phát triển tùy vào lượng đạm cung cấp (Guindo et al., 1994) và tổng lượng phân bón đạm có sẵn (Bufogle et al., 1997). Cây lúa cần nhiều đạm vào giai đoạn đầu của chu kỳ sinh trưởng, nhất là trong thời kỳ đâm chồi (De Datta, 1970). Đạm là chất tạo dạng cây lúa, là thành phần chủ yếu của protein và chất diệp lục làm lá xanh tốt, tăng chiều cao cây, số chồi và kích thước lá. Do đó, dựa vào màu sắc và kích thước lá, chiều cao và khả năng nở bụi của cây lúa, người ta có thể chẩn đoán tình trạng dinh dưỡng đạm trong cây. Đạm quyết định năng suất lúa và tăng kích thước hạt. Đạm giúp hô hấp của rễ do tác dụng ngăn cản ảnh hưởng độc của H2S có nhiều trong đất ngập nước (Gomez, 1971). Ở giai đoạn sinh trưởng ban đầu, đạm tích lũy chủ yếu trong thân lá, khi lúa trổ, khoảng 48 - 71% đạm được đưa lên bông. Trong cây, đạm dễ dàng được chuyển vị từ lá già sang lá non, từ mô trưởng thành sang mô non nên triệu chứng thiếu đạm thường xảy ra trước tiên ở lá già rồi lan dần đến các lá bên trên. Thiếu đạm, cây lúa lùn hẳn lại, nở bụi ít, chồi nhỏ, lá ngắn hẹp, trở nên vàng và rụi sớm, cây lúa còi cọc không phát triển. Ở giai đoạn sinh sản, đạm có vai trò trong việc tạo mầm hoa, giúp tăng số hạt trên gié, số gié trên bông và số chồi hữu hiệu. Nếu thiếu đạm, cây lúa sẽ cho bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ và nhiều hạt bị lép (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). 2.3.2. Vai trò của lân đối với cây lúa Lân là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Lân là chất tạo năng lượng, là thành phần của ATP, NADP và các nucleotide. Các nucleotide này đóng vai trò quan trọng trong các quá trình cố định, dự trữ và vận chuyển năng lượng, đồng thời chúng tham gia trong các quá trình sinh tổng hợp polysaccaride, lipid, protein và acid nucleic. Thúc đẩy việc sử dụng và tổng hợp chất đạm trong cây, kích thích rễ phát triển. Lân giúp cây lúa nhanh phục hồi sau khi cấy, nở bụi mạnh, kết nhiều hạt chắc, tăng phẩm chất gạo, giúp lúa chín sớm. Lân thường tập trung nhiều trong hạt. Cây lúa cần lân nhất là trong giai đoạn đầu, nên cần bón lót trước khi sạ, cấy. Khi lúa trổ, khoảng 37 - 83% chất lân được chuyển lên
  34. 34. 16 bông. Lân có vai trò quan trọng nên khi thiếu lân cây có những biểu hiện về hình thái bên ngoài, năng suất và chất lượng thu hoạch. Thiếu lân, cây lúa lùn hẳn, nở bụi kém, lá rất thẳng hẹp và màu sậm hơn bình thường hoặc ngả sang màu tím bầm, lúa sẽ trổ và chín muộn, hạt không no đầy và phẩm chất giảm (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Theo De Datta (1970), tác dụng của lân ngoài việc tăng năng suất lúa, còn kích thích sự phát triển của hệ thống rễ, giúp cây kháng hạn, trổ và chín sớm, đồng thời kích thích sự đâm chồi và tăng phẩm chất hạt gạo, tăng lượng lân chứa trong hạt. 2.3.3. Vai trò của kali đối với cây lúa Kali là nguyên tố đa lượng cần thiết cho thực vật. Kali tham gia nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa quan trọng của cây. Kali hoạt hóa ít nhất 60 loại enzyme khác nhau cần thiết cho sự sinh trưởng của cây, giúp cho quá trình vận chuyển và tổng hợp các chất trong cây, duy trì sức trương của tế bào, tăng cường quá trình quang hợp ở cây, giúp cây cứng cáp, tăng khả năng chống sâu bệnh, chống ngã đổ, chịu hạn và lạnh khỏe hơn, ... Vì vậy kali rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất và phẩm chất của cây trồng. Kali tăng số hạt chắc trên bông và làm hạt no đầy hơn. Kali tập trung chủ yếu trong rơm rạ, chỉ khoảng 6 - 20% ở trên bông (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008), (De Datta, 1970). 2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời sống bên trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật. Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, nơi lắng đọng các chất hữu cơ và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm, oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Harari et al., 1988). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay di chuyển khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến động, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai
  35. 35. 17 đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997). Hình 2.2. Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn nội sinh thực vật (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X08001923) Vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí. Hơn nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể giúp cây chủ kháng lại mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích cây trồng chống chịu với nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997). 2.4.1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật * Vi khuẩn Azospirillum Vi khuẩn Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn, kích thước biến động trong khoảng 0,8 - 1,7 μm chiều rộng và 1,4 - 3,7 μm chiều dài. Các loài Azospirillum phân bố rộng và gắn liền với sự đa dạng của cây trồng (Seshadri et al., 2000). Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của chi Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản xuất chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Vande et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al., 2003). Okon và Labandera-Gonzalez (1994) thử nghiệm ngoài đồng các cây trồng được bổ sung với Azospirillum đã nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 - 30%, cao hơn so với khi sử dụng phân hóa học. Sản lượng tăng là do hệ thống rễ Mô gỗ Mô libe Nội bì Rễ chính Lông hút Chóp rễ Lông hút Rễ thứ cấp Nội bì Nội bì Chu luân Vùng vỏ Trung trụ Biểu bì Vi khuẩn nội sinh Vùng tăng trưởng Mô gỗ Mô libe Nội bì Vi khuẩn nội sinh
  36. 36. 18 phát triển tốt hơn, tương quan với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp thu. * Vi khuẩn Azotobacter Döbereiner (1974) phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà. Sự khám phá ra vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho cỏ Paspalum notatum và khoai lang. * Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus Vào năm 1988, Cavalcante và Döbereiner đã phân lập được G. diazotrophicus từ rễ, thân và lá mía trồng ở Brazil, chúng hiện diện trong các khoảng trống gian bào của tế bào nhu mô và được xem là vi khuẩn nội sinh bắt buộc. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus thuộc họ Acetobacteraceae là những vi khuẩn Gram âm, vi hiếu khí bắt buộc, tế bào hình que và không có nội bào tử (Muthukumarasamy et al., 2002). Vi khuẩn này có ở nhiều loại cây hòa bản khác nhau như bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với các đặc tính ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp cả IAA, gibberellin và hòa tan lân khó tan (Muthukumarasamy et al., 2002; Madhaiyan et al., 2004). * Vi khuẩn Herbaspirillum Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm β - Proteobacteria là vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ hòa bản có giá trị kinh tế. Hai loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986). Vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cỏ chăn nuôi và các cây trồng nhiệt đới như khóm, chuối (Cruz et al., 2001). Trong vùng rễ, chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986), ngoài ra chúng còn di chuyển đến cả những vùng ở thân và lá (Barraquio et al., 1997). Các nhà khoa học Nhật Bản (Elbeltagy et al., 2001) nghiên cứu quần lạc ở rễ lúa trồng của Herbaspirillum sp. B501 được phân lập từ lúa hoang bằng cách đưa gen gfp (mã hóa protein GFP tạo chất huỳnh quang xanh) với gen nhảy pUTgftx2 vào vi khuẩn và vi khuẩn này được bổ sung vào các hạt lúa hoang. Kết quả nhận thấy Herbaspirillum sp. dòng B501gfp1 tập trung một phần trong các bao lá mầm, lá, hạt và rễ lúa, chúng cư trú trong các khoảng trống gian bào ở các lá non thứ 3 trước khi lá nở rộng của các cây lúa hoang có hạt được bổ sung vi khuẩn. Đáng chú ý vi khuẩn này còn xâm nhập cả vào các mô non của lá thứ 4.
  37. 37. 19 * Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ - Proteobacteria (Gram âm), có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và K. oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí (Iniguez et al., 2004). Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K. oxytoca dòng GR-3 bổ sung cho giống lúa Malviyadhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả, đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây. * Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ - Proteobacteria (vi khuẩn Gram âm), có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật. Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Nam Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các dạng lân khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2- ketogluconic acid. * Vi khuẩn Azoarcus Bilal et al., (1987) đã phân lập được một số loại vi khuẩn Azoarcus sống trong cỏ Kallar khi người ta phát hiện lúa mì sống trong vùng trước đây có cỏ thì có năng suất cao mà không cần bón nhiều phân hóa học. Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, kích thích sự sinh trưởng của lúa. Ở những nơi trong vùng rễ có hàm lượng oxy thấp, vi khuẩn này có khả năng cố định đạm tốt (Malik et al., 1997). * Vi khuẩn Pseudomonas Vi khuẩn Pseudomonas spp. phân bố rộng rãi và có nhiều loài, là vi khuẩn sống tự do, chúng được tìm thấy khắp nơi trong đất, nước, thực vật, động vật. Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, không có khả năng tạo nội bào tử. Chi Pseudomonas spp. có nhiều loài có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta, P. fluorescens, P. paucimobilis, P. pseudoflava, P. putida, P. stutzeri và P. vesicularis (Chan et al., 1994). Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng hòa tan lân như P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis (Canttenlla et al., 1999). Một số loài
  38. 38. 20 thuộc chi Pseudomonas như: P. putida, P. fluorescens, P. syringae có khả năng tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: IAA, cytokinin kích thích sự sinh trưởng của bộ rễ cây và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng trong đất (Glickmann et al., 1998), một số có khả năng kháng lại một số vi sinh vật gây hại cây trồng. Nhiều loài Pseudomonas được tìm thấy nội sinh trong nhiều loài thực vật như bông vải, đậu nành, cà phê, lúa hoang, lúa trồng (Koomnok et al., 2007) và khoai lang (Khan và Doty, 2009). * Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, chúng có thể di chuyển nhờ chiên mao ở đầu. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển mạnh. Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu vùng nhiệt đới (Mounlin et al., 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự sinh trưởng của cây trồng, hiện diện vùng rễ và rễ của nhiều loài cây như: bắp, mía, cà phê (Scarpella et al., 2003). Trong số 40 loài thuộc chi Burkholderia, có nhiều loài có khả năng cố định đạm như: Burkholderia vietnamiensis, B. brasilensis, B. kururiensis, B. tuberum, B. phymatum, B. unamae, B. tropicalis và B. terrae (Goris et al., 2004). Vi khuẩn B. tropicalis được tìm thấy trong cây khóm (Trần Thanh Phong và Cao Ngọc Điệp, 2012). Loài B. vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam. Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài B. vietnamiensis sau 14 ngày bổ sung giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30% và năng suất lúa tăng 13 - 22% (Van et al., 1994). 2.4.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa Vi khuẩn nội sinh trong thân, rễ, hạt và lá ở cây lúa rất đa dạng bao gồm nhiều loài khác nhau và được ghi nhận ở Bảng 2.5. Bảng 2.5. Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa Vị trí phân lập Nhóm vi khuẩn Loài vi khuẩn Alphaproteobacteria Thân Methylobacterium sp. Thân Azospirillum amazonense Thân Azospirillum lipoferum Thân Azospirillum brasilense Rễ Azospirillum irakense Rễ Rhizobium leguminosarum
  39. 39. 21 Betaproteobacteria Thân Herbaspirillum seropedicae Thân Herbaspirillum rubrisubalbicans Rễ Azoarcus sp. Rễ Azoarcus indigens Rễ Burkholderia sp. Rễ Burkholderia kururiensis Gamaproteobacteria Rễ Acinetobacter baumannii Hạt Pantoea Hạt Pantoea agglomerans Hạt Pseudomonas boreopolis Thân Pseudomonas cepacia Thân Pseudomonas stutzeri Hạt Klebsiella oxytoca Rễ Klebsiella pneumoniae Thân Enterobacter cancerogenus Rễ Enterobacter cloacae Rễ Enterobacter ludwigii Firmicutes Hạt Bacillus subtilis Hạt Bacillus cereus Lá Bacillus pumilus Thân Bacillus megaterium Rễ Staphylococcus sp. Rễ Clostridium sp. Actinobacteria Lá Streptomyces Bacteroidetes Hạt Sphingomonas melonis Hạt Sphingomonas yabuuchiae Hạt Sphingomonas echinoides Lá Sphingomonas adheasiva Rễ Sphingomonas paucimobilis Hạt Sphingomonas echinoides (Nguồn: Mano và Morisaki, 2008)
  40. 40. 22 2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa * Qúa trình xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh + Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh Qua các kết quả nghiên cứu thu được từ thân, lá, hạt và rễ, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh phải là đất vùng rễ. McIncroy và Klopper (1995) đã xác định hạt giống như là nguồn của vi khuẩn nội sinh trên bắp ngọt và bông vải. Vi khuẩn nội sinh từ môi trường bên ngoài, ở vùng rễ và rễ hạt đang nảy mầm tấn công vào khí khổng, vết thương. Hầu hết vi khuẩn nội sinh đều có ở vùng rễ. Nhiều vi khuẩn nội sinh không chỉ tấn công vào rễ mà chúng còn tấn công vào hạt và lá. + Sự di chuyển của vi khuẩn nội sinh Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng các cơ chế hóa hướng động, ngẫu nhiên hoặc cả hai. Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất hóa học giúp vi khuẩn nội sinh tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ. Vi khuẩn có lợi Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ tổng hợp và phóng thích hợp chất kích thích (Bashan, 1986). Sự tiếp xúc do rễ phát triển để tìm nguồn nước hay chất dinh dưỡng cũng là cơ hội ngẫu nhiên quan trọng để vi khuẩn có thể tiếp xúc với lông hút của rễ non. + Tiếp xúc Lectin là một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ. Duiff và Lemanceau (1997) đã chứng minh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r hiện diện trên bề mặt rễ do hợp chất lipo- polysaccharides. + Xâm nhập Theo Hallmann (2001), có nhiều con đường để vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật: + Các khoảng trống tự nhiên như thủy khổng, khí khổng, khoảng trống ở rễ. + Các vết thương từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang. + Vết thương do tác động vật lý. + Các vết nhỏ: khi rễ non mọc ra, lúc này vỏ rễ nứt ra sẽ tạo ra các vết thương và các vi sinh vật xâm nhập vào.
  41. 41. 23 Tuy nhiên, con đường quan trọng nhất vi khuẩn xâm nhập vào bên trong mô thực vật là vết thương và vết nhỏ hiện diện khi hình thành lông hút, đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập. Vết bệnh cũng là nơi để cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong như vết thương từ tuyến trùng, vết nấm do Rhizotonia solani (Mahaffee và Kloepper, 1997). Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập và chui thẳng bên trong nhu mô rễ non và chúng vào thẳng những tế bào rễ. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các khoảng trống trong rễ ngang, chúng tập trung ở bên ngoài, bên trong vùng nhu mô rễ và các bó mạch rồi từ đó chúng di chuyển vào thân lúa, vào nhu mô lá. Mật số vi khuẩn Herbaspirillum duy trì một lượng lớn ở thân từ 2 - 21 ngày sau khi bổ sung. Hình 2.3. Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa (Ando, 2008) Mattos và Romerio (2008) phát hiện nhóm vi khuẩn nội sinh Burkholderia kukuriensis tập trung bên ngoài lông hút rễ non. + Sinh sản Vi khuẩn nội sinh tiếp cận với nơi xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp từ 103 - 105 tế bào/g trọng lượng tươi. Mật số vi khuẩn trong mô thực vật tùy thuộc vào loài thực vật, tùy thuộc vào từng bộ phận của cây, ... trong mô rễ mật số 105 tế bào/g trọng lượng tươi, trong mô thân 104 tế bào/g trọng lượng tươi và trong mô lá khoảng 103 tế bào/g trọng lượng tươi (Hallmann, 2001) và chúng phải sinh sản một số lượng lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Hurek et al., (1994) cho rằng sự phân cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tìm thấy bên ngoài và cả bên trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar. Sau khi xâm nhập vào trong mô thực vật, vi khuẩn di chuyển đến các mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác

×