Fundamento y utilidad de las técnicas serologicas

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Electroforesis de proteinas en el suero
ELISA
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  • Fundamento y utilidad de las técnicas serologicas

    1. 1. Fundamento y utilidad de la técnica de electroforesis de Proteínas del suero Jenny Maribel Dávila García Luisa Fernanda Díaz Díaz Daniel Alejandro Elizondo Alfaro Martin Guillermo Esquivel Tapia
    2. 2. ¿Qué es la Electroforesis de Proteínas? La electroforesis de proteínas es una prueba de laboratorio basada en la separación de proteínas aplicando un campo eléctrico, las diferentes proteínas de la mezcla se separarán en función de su peso molecular.
    3. 3. Los diferentes tipos de análisis pueden ser distinguidos por las propiedades físicas de la muestra que van a emplear para su separación o por el tipo de matriz usada Limite Móvil De zona Isotacoforesis Isoelectroenfoque
    4. 4. ARNE TISELIUS • Bioquímico sueco • Creo el primer aparato • sofisticado de electroforesis en 1937. • Su trabajo le valió el premio Nobel en 1948. • Fue quien desarrollo el concepto de frente móvil, que mas tarde se conoció como electroforesis de zona y se uso para separar proteínas en solución.
    5. 5. ¿Cual es su importancia? Los niveles obtenidos son útiles para diagnosticar gammapatias monoclonales (asociadas al cáncer)y diversas patologías entre algunas: cirrosis, hepatitis autoinmune, artritis reumática, osteomielitis, bronquitis, leishmaniosis, lepra, leucemia, SIDA, mieloma, carcinomas, embarazo, diabetes, daño celular, infecciones agudas, desordenes renales y desnutrición.
    6. 6. LAS PROTEINAS PLASMATICAS • El plasma, a menudo no permite determinar los cambios en los niveles de las beta y gamma globulinas. • El suero sanguíneo es el liquido amarillo que resulta después de formarse el coagulo sanguíneo, en el están contenidas una gran cantidad de proteínas, este carece de fibrinógeno, fibrina y varios factores de coagulación.
    7. 7. • Contiene dos principales grupos de proteínas: albumina y globulinas. • La albumina al igual que la α y β globulinas son sintetizadas en el hígado • Las γ globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.
    8. 8. 5 grupos o fracciones proteicas en la sangre, de tamaño, forma y carga similares. • 1. Albumina. Principal proteína del plasma humano y constituye aproximadamente el 60% de la proteína plasmática total. Trasporta atreves del torrente sanguíneo muchos metabolitos, como los ácidos grasos libres y la bilirrubina, también se unen a metales como el calcio, cobre, zinc,; y a fármacos poco solubles , transportándolos eficazmente. Ayuda a mantener la presión osmótica de la sangre α -1-Globulinas. En esta fracción se incluyen α-1antitripsina, glicoproteínas y lipoproteínas de alta densidad HDL, colesterol «bueno» .
    9. 9. α-2-Globulinas. Haptoglobulina, que es una proteína que se une a la hemoglobina libre para evitar su excreción por los riñones α-2 macroglobulina (inhibidor de proteasas), ceruplasmina (proteína transportadora de cobre y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), entre otras. β-Globulinas. Transferrina (proteína transportadora del hierro), el plasminogeno y el complemento, la hemoglobina libre y las lipoproteínas de baja densidad LDL.
    10. 10. γ-Globulinas. Inmunoglobulinas o anticuerpos, proteínas producidas por el sistema inmune en respuesta a infecciones, reacciones alérgicas y trasplantes de órganos,. Los anticuerpos se dividen en IgA, IgE, IgD, IgM e IgG.
    11. 11. Valores normales • • • • • • Proteína total: 6.4 a 8.3 g/dL Albúmina: 3.5 a 5.0 g/dL Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL Los resultados de la electroforesis Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL de proteínas séricas pueden verse Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL afectados por: Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL - El consumo de medicamentos como la clorpromazina, corticosteroides, isoniazida, neomicina, fenacemida, salicilatos, sulfonamidas y tolbutamida. - Uso de colorantes de contraste pueden alterar los resultados.
    12. 12. Procedimiento Dodecil sulfato de sodio Obtención de Suero Sanguíneo Agregamos SDS a la muestra Se calienta la muestra
    13. 13. Usando una fuente de energía los polipéptidos cargados negativamente migran hacia el polo positivo en el fondo del gel.
    14. 14. Patrón electroforético de las proteínas
    15. 15. Valores normales de las fracciones proteicas del suero Fracción Porcentaje con respecto a las Proteínas Séricas Totales (%) Concentración expresada en gramos por decilitro (g/dL) Albúmina 54.7 – 60.2 3.5 – 5.5 α – 1 globulina 1.6 – 3.6 0.2 -0.4 α – 2 globulina 9.4 – 12 0.5- 0.9 β globulina 10.9 – 14.5 0.6 – 1.1 γ globulinas 10.9 – 19.3 0.7 – 1.7
    16. 16. Patologías detectadas por electroforesis Mediante la electroforesis pueden separarse y cuantificarse un gran numero de proteínas presentes en el suero sin embargo los resultados pueden verse afectados por el consumo de medicamentos como clorpromazina, neomicina, corticoesteroides, fenacemida entre otros.
    17. 17. Albumina • Elevación por encima de niveles normales: deshidratación. • Disminución por debajo de los niveles normales: malnutrición, hepatopatías como cirrosis, nefropatías, hiperhidratacion, enfermedades inflamatorias.
    18. 18. A-1 globulinas • Elevación por encima de niveles normales: inflamaciones crónicas por ejemplo artritis reumatoide, lupus eritematoso y inflamaciones agudas. • Disminución por debajo de los niveles normales: enfisema pulmonar juvenil.
    19. 19. A-2 globulina • Elevación por encima de niveles normales: inflamaciones agudas y crónicas. • Disminución por debajo de los niveles normales: hemolisis, insuficiencia hepática y enfermedad de Wilson.
    20. 20. B globulinas • Elevación por encima de niveles normales: hiperlipoproteinemia. • Disminución por debajo de los niveles normales: trastorno de coagulación congénito, malnutrición, coagulopatia de consumo.
    21. 21. Y globulinas • Elevación por encima de niveles normales: mieloma múltiple, artritis reumatoide, hiperinmunizacion, macroglobulinemia de Waldenstrom. • Disminución por debajo de los niveles normales: inmunodeficiencias secundarias y trastornos inmunológicos congénitos.
    22. 22. Karla Judith Franco Andrade María José García Madrigal Mario José Garza López Fundamento y utilidad de la técnica de ELISA
    23. 23. ¿Qué es? Es una prueba para la detección de moléculas usando el reconocimiento de antígenoanticuerpo y la sensibilidad de pruebas enzimáticas Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA Prueba inmunoabsorbente ligado a enzimas Es un ensayo inmunoenzimatico para detectar moléculas que sufren cambio al presentarse infecciones por virus, bacterias, hongos o parásitos.
    24. 24. Directo (buscar antígeno) No competitivo ELISA Indirecto (buscar anticuerpo) Competitivo
    25. 25. DIRECTO INDIRECTO
    26. 26. ? Quien invento ELISA? Peter Perlmann y Eva Engvall en la universidad de Stockholm en 1971
    27. 27. La prueba sirve para detectar antígenos, anticuerpos, medicamentos drogas de abuso contaminantes químicos y bacterianos, etc.
    28. 28. • La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.
    29. 29. Un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
    30. 30. Hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
    31. 31. • La prueba es especifica, fácil para la automatización de robots para hacer muchas pruebas en corto tiempo, es barato.
    32. 32. Se emplea para la presencia de anticuerpos contra agentes virales. Se emplea para identificar la presencia de antígenos de superficie virales. Detecta anticuerpos contra bacterias
    33. 33. • Determinación de antígenos o marcadores tumorales para seguir su evolución o la respuesta a tratamiento • Cuantificación de medicamentos en sangre • Cuantificación de drogas en abuso
    34. 34. Primer paso Los antígenos se pegan a una placa de cloruro de polivinilo o poliestireno; también se pueden pegar anticuerpos.
    35. 35. Segundo paso Se agrega el suero o liquido problema diluido.
    36. 36. Tercer paso Después de la reacción antígeno-anticuerpo se utiliza un segundo anticuerpo, conjugado a una enzima, especifico para el isotipo del anticuerpo a cuantificar.
    37. 37. 4 Cuarto paso Se agrega el sustrato cromógeno que produce un cambio de coloración.
    38. 38. 5 Quinto paso En un espectrofotómetro se produce una lectura de absorbancia, directamente proporcional a la concentración del analito a determinar.
    39. 39. Método de ELISA
    40. 40. Mario Rene Gracia Cavazos Jonathan González Dávila Cynthia Jazmín Guevara Rojas Fundamento y utilidad de la técnica de WESTERN-BLOT
    41. 41. Western Blot • Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular) • El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.
    42. 42. Antecedentes • En 1975, Edwin Southern demostró que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permitía el análisis de una mezcla compleja de moléculas de ADN. • Existen diversas técnicas capaces de detectar un antígeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis. • La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas.
    43. 43. • Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad • Luego son transferidas a una membrana adsorbente para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. • Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros métodos.
    44. 44. Preparación de la muestra Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular. Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada. Después se procede a una licuadora (para muestras pequeñas).
    45. 45. Materiales • Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y bioquímicas.
    46. 46. Electroforesis en Gel • Las proteínas de la muestra serán separadas en gel en función de lo siguiente: – Punto isoeléctrico – Peso molecular – Carga eléctrica
    47. 47. • La electroforesis con gel mas frecuente es la de poliacrilamida con dodecil sulfato (SDS-PAGE). • Provoca la eliminación de las estructuras secundarias y terciaras de las proteínas y mantiene a los polipéptidos en estado desnaturalizado. Esto permitirá que las proteínas sean separadas en función del tamaño.
    48. 48. Transferencia • Para que las proteínas sean accesibles a la detección de anticuerpos, se les transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de polifluoruro de vinilideno (PVDF). • Las membranas utilizadas en la prueba Western Blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica.
    49. 49. Membrana de Nitrocelulosa • En esta membrana ocurren interacciones membrana-proteína de tipo no covalente, con naturaleza hidrófoba.
    50. 50. Membrana de PVDF • Son interacciones hidrofóbicas y de dipolos. • Deben ser humedecidas en metanol o etanol, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
    51. 51. Electrotransferencia • Este método se basa en una corriente eléctrica y un buffer de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hasta la membrana.
    52. 52. • Despues de la transferencia se suele proceder a la tinción de Coomassie Brilliant Blue para comprobar que se ha transferido suficiente material proteico a la membrana.
    53. 53. Bloqueo La membrana necesita unirse a proteínas inespecífica Bloquear lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia.
    54. 54. Se incuba la membrana solución de proteínas Albumina de suero bovino o ASB o caseína + fracción de detergente
    55. 55. Detección Se comprueba la presencia en la membrana de la proteína. Se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica. Proceso tradicionalmente realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detección en un único paso.
    56. 56. Método en 2 pasos
    57. 57. Método en paso Requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la proteína de interés y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.
    58. 58. Análisis Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la proteína de interés. Resultados Se pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.
    59. 59. Gracias.

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