RELATÓRIO EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA

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O DNA é a biomolécula que possui toda a informação genética, permitindo saber qual o grau de afinidade entre indivíduos.

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RELATÓRIO EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA

  1. 1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro GENÉTICA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA RELATÓRIO EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA Docente: Paula Lopes Discentes: CRISTIANA VALENTE Nº 33708; DAVID RODRIGUES Nº 33714; FRANCISCO PINTO Nº 33707; LUÍS SAMPAIO Nº 33706; PEDRO VEIGA Nº 33698
  2. 2. Índice Introdução ..................................................................................................................................... 3 Objectivos .................................................................................................................................... 4 Resultados ..................................................................................................................................... 4 Discussão ....................................................................................................................................... 5 Conclusão ...................................................................................................................................... 6 Bibliografia .................................................................................................................................... 6 2
  3. 3. Introdução O DNA é a biomolécula que possui toda a informação genética, permitindo saber qual o grau de afinidade entre indivíduos. O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma de plantas. É necessário extrair o DNA intacto para não quebrar as ligações, já que são estas as responsáveis pela informação genética. Qualquer que seja a técnica a utilizar esta exige a extracção de DNA de boa qualidade, a sua quantificação e conservação. Para estudar DNA é necessário remove-lo do núcleo da célula. Neste trabalho estudamos o material genético de células vegetais, apesar da constituição da sua parede celular, rica em celulose, quitina, outros polissacáridos e fenóis que dificultam a extracção. O DNA extraído proveio de folhas de plantas de várias espécies: cevada dos ratos, cebola, cebolinho e alface. O método de extracção de DNA utilizado (DNeasyTM Plant Mini Kit-QIAGEN) consiste em: 1- Macerar 100 mg de tecido, em azoto líquido, até ficar reduzido a um pó muito fino. Colocar num tubo de 2 mL. 2- Adicionar 400 μL de tampão AP1 e 4 μL de RNAse. Agitar vigorosamente no vortex. 3- Incubar a mistura 10 min a 65º C. Misturar por inversão 2 a 3 vezes durante o tempo de incubação. 4- Adicionar 130 μL de tampão AP2, misturar, e incubar 5 minutos em gelo. 5- Centrifugar 5 minutos na velocidade máxima. 6- Aplicar a fase líquida à coluna QIAshredder (Lilás) colocada num tubo de 2 mL e centrifugar 2 minutos na velocidade máxima. 7- Transferir a fase líquida, obtida no passo anterior, para um novo tubo (não fornecido) sem tocar no “pellet”. 8- Adicionar 0,5 do volume (obtido em 7) de AP3 e 1 volume de etanol (96– 100%) ao lisado e misturar com a pipeta. 9- Colocar 650 μL da mistura obtida em 8, incluindo algum precipitado formado; à coluna Dneasy colocada num tubo de 2 mL. Centrifugar 1 minuto a 8000 rpm e eliminar a fase líquida obtida. 10- Repetir o passo 9, utilizando a amostra restante, e eliminar a fase líquida conjuntamente com o tubo. 11- Colocar a coluna num novo tubo (fornecido), adicionar 500 μL de tampão AW à coluna e centrifugar 1 min a 8000 rpm. Eliminar a fase líquida e reutilizar o tubo. 12- Repete-se o passo 11 mas com uma centrifugação de 2 min na velocidade máxima para secar a membrana. 13- Transfere-se a coluna para um tubo de 2 mL e coloca-se 100 μL de tampão AE previamente aquecido a 65ºC directamente na membrana. Incubar 5 min à temperatura ambiente e centrifugar 1 min a 8000 rpm para diluir. 14- Repete-se a diluição (passo 13) utilizando o mesmo tubo. Para quantificar DNA recorremos a dois métodos: 3
  4. 4.  - Quantificação de DNA por espectrofotometria – as medições efectuadas para a absorvância foram feitas a 260 nm e a 280 nm, sendo que a razão entre as absorvâncias 260/280 nm determinam a pureza das amostras de ácidos nucleicos.  - Quantificação de DNA em géis de agarose – o gel de agarose obtém-se por solidificação da agarose fundida em tampão TBE 1x ao qual se adiciona, depois de arrefecido, brometo de etídio. Previamente à aplicação no gel, adicionou-se às amostras tampão de amostra (50% de glicerol, 0,25% de azul de bromofenol e 1mM EDTA) que facilita a aplicação e visualização destas. Após a corrida, o gel foi visualizado com radiação UV e fotografado. Para além dos problemas referidos anteriormente, existem outros problemas durante o isolamento do DNA:  Contaminação por fenóis – isto pode se expressar pela coloração marron ou muito escura do DNA;  Contaminação por polossacáridos – a amostra de DNA surge com um aspecto gelatinoso e excesivamente viscoso;  DNA degradado – isto pode ocorrer pela contaminação das DNAses, por quebra mecânica durante a extracção com clorofórmico ou por contaminação com RNA. É visível pelo DNA apresentar um arraste vertical no gel. Objectivos   Extracção e quantificação de DNA de diversas espécies vegetais; Testar métodos de forma a compreender quais os mais correctos para cada espécie; Resultados Tabela 1 – Quantificação de DNA por espectofotometria. Amostra A (260 nm) A(280 nm) R (260/280) [ ] ng/ ml Cevada rato (2ª dil.) 0.039 0,03 1,311 39 Cebola (2ª dil.) Cebolinho (2ª dil.) 0,046 0,058 0,029 0,036 1,577 1,610 46 58 Alface (2ª dil.) Cevada rato (1ª dil.) 0,089 0,123 0,063 0,073 1,422 1,692 89 123 Cebola (1ª dil.) Cebolinho (1ª dil.) 0,104 0,060 0,069 0,044 1,509 1,368 104 60 Alface (1ª dil.) 0,306 0,215 1,421 306 4
  5. 5. Fórmula para calcular a concentração de DNA: [DNA] g/ml = Razão de diluição x A260 x 50 Fig. 1 – Visualização do gel com as amostras utilizadas. Discussão No que refere a razão das absorvâncias, podemos inferir que para as amostras de razão superior a 2.0 ocorreu contaminação com RNA; por sua vez para valores de razão inferiores a 1.8 ocorreu contaminação com proteínas. Da análise dos dados obtidos por espectofotometria conseguimos ordenar as amostras por ordem crescente de grau de pureza (dado pela razãoA260/A280) da seguinte forma: • Cevada dos ratos 2ª diluição <Cebolinho 1ª diluição <Alface 1ª diluição <Alface 2ª diluição <Cebola 1ª diluição <Cebola 2ª diluição <Cebolinho 2ª diluição <Cevada dos ratos 1ª diluição As amostras mais puras são aquelas que apresentam um grau de pureza perto de 1,8, segundo a Tabela 1. Todas as amostras apresentam valores abaixo de 1,8 o que nos indica por esse método que as nossas amostras estão contaminadas por proteínas. 5
  6. 6. Pela observação da figura 1, verificamos que não está presente nenhuma banda sobre as amostras, logo não há contaminação por RNA. Podemos observar que as bandas 1, 2, 5, 6, 9 e 10 apresentam arrastamento, indicando que o DNA se encontra fragmentado. Por outro lado, as bandas que não apresentam arrastamento indicam que o DNA está intacto. Podemos observar que a sequência de amostras do gel de agarose não corresponde à sequência utilizada na espectrofotometria, uma vez que as as bandas que supostamente deviam sofrer arrastamento não sofrem. Conclusão Podemos concluir que os nossos objectivos não foram atingidos, uma vez que nenhuma das amostras apresentou o grau de pureza (1,8), sendo o valor mais próximo 1,692 para a cevada dos ratos 1ª diluição. Concluímos também que todas as amostras estão contaminadas com proteínas. Os resultados que obtivemos , nos dois métodos, não coincidem. Pelo que podemos concluir que, houve erros humanos durante a realização do trabalho. Provavelmente durante o carregamento das amostras, pequenas quantidades destas podem ter ficado em suspensão ou retidas na micropipeta. Uma outra hipotese é ter sido trocada a ordem das amostras. Podemos concluir que é necessário cruzar os resultados dos dois métodos para retirar ilações. Uma vez que só possuímos dados viáveis do primeiro método, não podemos retirar conclusões válidas. Bibliografia   http://www.uefs.br/disciplinas/bot859/extra.pdf http://www.fc.up.pt/pessoas/aseneca/Teresa%20Azevedo%20Tese.pdf 6

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