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Jornada EPA - Mª Isabel Prieto

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Mª Isabel Prieto Santos – Jefe de Servicio de Biotecnología del Centro Nacional de Alimentación (CNA).

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Jornada EPA - Mª Isabel Prieto

  1. 1. HERRAMIENTAS PARA LA DETECCIÓN DE   ALÉRGENOS: ESTADO ACTUAL, RETOS Y NECESIDADES ACTUACIONES DEL CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN CENTRO NACIONAL  DE ALIMENTACIÓN Mª Isabel Prieto Santos Servicio de Biotecnología Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos   FIAB Madrid, 18 de octubre de 2016
  2. 2. Centro Nacional de Alimentación  Métodos de detección de alérgenos Características y limitaciones  Posibles soluciones  Retos  Conclusiones Índice: Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid  18 de octubre de 2016
  3. 3. Centro Nacional de Alimentación REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II): Sustancias que causan alergias o intolerancia: Cereales con gluten Crustáceos Huevos Pescado  Cacahuetes Soja Leche  Frutos de cáscara Apio Mostaza Sésamo Sulfitos Altramuces Moluscos Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid  18 de octubre de 2016
  4. 4. Centro Nacional de Alimentación Estado Actual Limitaciones en la aplicación de la legislación UE en el  etiquetado de alérgenos   • Falta de criterios normativos para la detección (Métodos de  detección) • Falta de umbrales de alérgenos (Límite de detección) Involuntaria - Contaminación cruzada Excesivo etiquetado de precaución, sin relación con el riesgo real: ´puede contener trazas de … ‘producido en una fabrica que utiliza….… Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB , Madrid  18 de octubre de 2016
  5. 5. Centro Nacional de Alimentación Detección de ADN del alimento alergénico  Métodos inmunológicos  Métodos Cromatográficos Métodos de Análisis de Alérgenos  Métodos Biología Molecular Detección proteína o proteínas alergénicas Detección proteína o fracciones de proteínas (péptidos) Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.  Madrid 18 de octubre de 2016
  6. 6. Centro Nacional de Alimentación Métodos Inmunológicos: La mayoría de los kits comerciales disponibles para el análisis en rutina de alérgenos de alimentos se basan en métodos inmunológicos. Los Ensayos inmunoenzimático (ELISA) son los más ampliamente utilizados debido a que son sensibles y específicos para la detección de proteínas alergénicas y fáciles de usar. Sin embargo, los kits comerciales para análisis cuantitativos utilizan diferentes tampones de extracción y diferentes calibrantes, se diferencian en la calidad de los anticuerpos utilizados y los resultados varían entre marcas comerciales y lotes. Las principales limitaciones incluyen efectos de la matriz, la extracción insuficiente de la proteína, la insuficiente especificidad debido a reacciones cruzadas y la insuficiente reproducibilidad de los resultados. Scientific Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,  EFSA Journal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf  Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  7. 7. Centro Nacional de Alimentación Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión específica antígeno-anticuerpo Métodos Inmunológicos Enzimoinmunoensayo ELISA TIRAS Inmunoreactivas (LFD) Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  8. 8. Centro Nacional de Alimentación Características de los sistemas Inmunológicos • Alta sensibilidad • Cuantitativos • Aplicación Materias Primas y Producto Procesado • Equipamiento: Lector de microplacas • Experiencia su realización • Muy sencillos • Cualitativos/semicuantitativos • Rápidos ( 5-10 minutos) • Útiles “Control de Riesgo” (APPCC) • Materias primas • Sensibilidad declarada (entre 1 mg/kg - 10 mg/kg ) • Requieren confirmación ELISA Tiras (FDL) • Detectan Proteínas Alergénicas • Especificidad • Sensibilidad • Fácil Realización • Gran disponibilidad en el mercado Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  9. 9. Centro Nacional de Alimentación Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-1 Extracción de proteínas alergénicas  Efecto de la matriz (grasas, taninos, acidez, etc...)  Efecto del procesado (tratamiento térmico, hidrólisis, fermentación etc…) Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016
  10. 10. Centro Nacional de Alimentación 1.‐ Solución Cocktail con Etanol al 80% ‐‐ 2.‐ Solución de Guanidina / ‐mercaptoetanol /  Isopropanol ‐‐3.‐ Solución 1 con Gelatina de pescado ‐‐ 4.‐ Solución 1 con leche desnatada Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB.. Madrid 18 de octubre de 2016 Estudio del efecto de los taninos de la fruta (CNA) Matriz ricas en taninos Matriz libre de taninos mg/kg de gluten
  11. 11. Centro Nacional de Alimentación ▄ Sin desengrasar ▄ Desengrasado Efecto del pH en la detección  de huevo en salsas ▄ pH ácido ▄ pH neutro Determinación de caseína  Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  12. 12. Centro Nacional de Alimentación Diferencias de los Resultados en los distintos sistemas ELISA  Detectan diferentes proteínas  Diferente anticuerpos  Diferentes calibrantes  Diferentes unidades de expresión de resultados  Diferencia en los límites de detección  Variación entre marcas comerciales y lotes Limitaciones analíticas de los Métodos Inmunológicos-2 Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  13. 13. Centro Nacional de Alimentación 0 5 10 15 20 25 30 35 Cacahuete(mg/kg) BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen Resultados diferentes ELISAS FAPAS Proficiency Test 2776C FAPAS 2776‐ C   Cacahuete en chocolate  •Biokits  11,8 mg/kg • Romer Labs  8,7 mg/kg • R‐Biopharm   24,2 mg/kg  • Neogen      15,0 mg/kg Valor asignado:  Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  14. 14. Centro Nacional de Alimentación TEPNEL BIOKITSAgraQuant® A B C D Huevo 0,4 mg/kg 0,25 mg/kg 0,5 mg/kg 1 mg/kg Caseína 0,2 mg/kg 0,25 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg Β-lactoglobulina 10 μg/kg 0,2 mg/kg 5 mg/kg 0,1 mg/kg Soja 40 μg/kg 0,3 mg/kg 2,5 mg/kg 2,5 mg/kg Cacahuete 1 mg/kg 1,5 mg/kg 2,5 mg/kg 1 mg/kg Diferente LD/LC Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  15. 15. Centro Nacional de Alimentación  β-lactoglobulina en un alimento : Sistema A : < 10 µg/kg Sistema C: < 5 mg/kg RESULTADO : NO DETECTADO  Cacahuete en un alimento (1,5 mg/kg) : Sistema A (LC 1 mg/kg): 1,5 mg/kg Sistema C (LC 2,5 mg/kg): < 2,5 mg/kg ? DETECTADO NO DETECTADO ETIQUETAR NO ETIQUETAR Ejemplos : Qué pasa entre  10 µg/kg y  5 mg/kg ??? Jornada sobre el Etiquetado Precautorio de Alérgenos, FIAB . Madrid 18 de octubre de 2016
  16. 16. Centro Nacional de Alimentación rente expresión de resultados función de la solución calibrante utilizada s sistemas proponen conversiones en la expresión de resultados HUEVO LECHE CACAHUETE  huevo entero en  mg/kg proteína de leche cacahuete proteína clara  de  mg/kg leche entera en  polvo Proteína de cacahuete ovomucoide mg/kg caseína mg/kg β lactoglobulina
  17. 17. Centro Nacional de Alimentación ción de muestras fortificadas con NIST SRM 8445 Comparativo kits ELISA Determinación de huevo RAS Valor Esperado  mg/kg 1 2 3 4 mg/kg (ppm)  proteína  clara de huevo mg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/kg (ppm) Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo Huevo entero en polvo do 1,5   0,53 3,4 1,72 1,6 a  1,5  0, 75 2,4 1,7 1,6 do 3 1,1 5,6 3,15 4 a  3 1,21 6,8 3,05 3 do 6 3,2 9,5 6,1 5,6
  18. 18. Centro Nacional de Alimentación o Comparativo kits ELISA Determinación de Avellana 1 2 3 4 LC  LC  LC  LC  z  ETIQUETADO 0,5 mg/kg  de  Proteína de  avellana 1 mg/kg  de  Avellana 2,5 mg/kg  de  Avellana 2,5 mg/kg  de  Avellana NO ETIQUETADO > 5 mg/kg 35 mg/kg 15,5 mg/kg > 20 mg/kg inas NO ETIQUETADO 0,7 mg/kg 2,9 mg/kg 4,9 mg/kg 8,3 mg/kg Avellana 2% NO DETECTADO NO DETECTADO 3,6 mg/kg NO DETECTADO Rastros de avellana NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Puede contener  trazas de nueces,  almendras y soja NO DETECTADO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO Trazas de frutos  secos NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO NO DETECTADO
  19. 19. Centro Nacional de Alimentación s Indirecto : Amplificación de un fragmento del gen del alérgeno o na secuencia genética específica presente en el Alimento o ente ación ados PCR tiempo final odos Biología Molecular
  20. 20. Centro Nacional de Alimentación R tiempo real
  21. 21. Centro Nacional de Alimentación os basados en la detección de ADN permiten la ón del alimento alergénico, en lugar de la proteína nica y son complementarios a ensayos inmunológicos. ADN eralmente más estables que las proteínas y por lo tanto do para el análisis de alimentos procesados. Los imientos de extracción y amplificación están bien cidos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tanto a final como en tiempo real permiten el análisis que varios nos a la vez. El análisis del ADN se convierte en el método de n siempre que no están disponibles kits de ELISA o no sean icos para el análisis de un alimento alergénico/ingrediente ico (por ejemplo el apio). PCR en tiempo real puede cionar resultados cuantitativos y permite el análisis de Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,  nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf 
  22. 22. Centro Nacional de Alimentación blemas en la extracción (presencia de inhibición en mentos procesados) ultados cualitativos / semicuantitativos • Cuantificación ng ADN (número de copias) unos alérgenos no pueden diferenciarse por PCR Carne vacuno /leche aves /huevo rente distribución entre ADN y proteína ADN en baja concentración, leche, proteína de clara de huevo, ciones analíticas de los métodos biológicos:
  23. 23. Centro Nacional de Alimentación AD DE MEDIDA/EXPRESIÓN DE RESULTADOS PROTEÍNAS ADN Cantidad de ADN (nº de  copias) detectado dad de ingrediente  énico o proteína  énica por kilo de  ento (mg/kg) No se puede establecer una correlación   entre cantidad de PROTEÍNA y cantidad 
  24. 24. Centro Nacional de Alimentación SULTADOS PCR stras fortificadas con 5 mg/kg de Soja Bollería Líquidos Salsas Postres
  25. 25. Centro Nacional de Alimentación ación ELISA/PCR  sobre muestras reales (Detección de Avellana) MUESTRAS ELISA (mg/kg) PCR  Bollo 8 DETECTADO Galleta de chocolate  > 20 DETECTADO Galletas < 2,5  NO DETECTADO Bombón > 20 DETECTADO Turrón de cacahuete < 2,5   DETECTADO Cereales de trigo y chocolate > 20 DETECTADO Barrita de cereales > 20 DETECTADO Muesli > 20 DETECTADO Barrita de trigo y chocolate > 20 DETECTADO Cereales Fruta y fibra > 20 DETECTADO Barquillo relleno de cacao > 20 DETECTADO Bizcocho cubierto de chocolate < 2,5 NO DETECTADO Copos de maíz < 2,5 NO DETECTADO Desayuno a la taza < 2,5 NO DETECTADO RAS DUDOSAS  ontener trazas  avellana) UESTRAS  VAS (No figura  RAS POSITIVAS  avellana como  rediente)
  26. 26. Centro Nacional de Alimentación LC MS/MS NA ica  Digestión Enzimática IONES: dificultad analítica AS : dianas en un único análisis Péptidos Cromatografía: HPLC LC MS/MS odos Cromatográficos
  27. 27. Centro Nacional de Alimentación Qué queremos detectar ? • Detección del ingrediente: Alimento • Detección del alérgeno: Proteína alergénica ción de un Método de análisis do analizar? cto final: Cumplir la Legislación - Suficiente para cumplir la legislación -Más información para el paciente
  28. 28. Centro Nacional de Alimentación o de matriz - Matriz grasa ADN X ELISA  - Productos hidrolizados ADN  ELISA X uraleza del alérgeno buscado Apio vamos a analizar? ADN 
  29. 29. Centro Nacional de Alimentación ETOS O DESAFIOS: Determinar umbrales tóxicos Materiales de Referencia Certificados EuroPrevall VITAL
  30. 30. Centro Nacional de Alimentación SPONIBILIDAD MATERIALES DE REFERENCIA : MR disponibles Alérgeno MATERIAL PROCEDENCIA CERTIFICACION Huevo RM 8445 ( Whole egg powder) NIST Contenido proteico (ELISA) mina/Gluten PWG standar Prolamin Group Alérgeno Leche BCR-638 IRMM Contenido proteico
  31. 31. Centro Nacional de Alimentación al de Referencia ncipal problema para la cuantificación de alérgenos por os inmunológicos, espectrometría de masas o los métodos s en ADN es la falta de disponibilidad de materiales de cia certificados (MRC). les de referencia (no certificados) desarrollados por diferentes tores están disponibles comercialmente para los alérgenos tarios más importantes, pero los resultados obtenidos pueden comparables. equiere la disponibilidad de MRC para la ificación de alérgenos alimentarios. Opinion on the evaluation of allergenic foods and food ingredients for labelling purposes,  nal 2014;12(11):3894, http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3894.pdf 
  32. 32. Centro Nacional de Alimentación les soluciones  Muestras Fortificadas: muestra preparada por adición de una  determinada cantidad de alérgeno obrantes de ensayos de intercomparación Valor de Referencia : Valor Asignado en el ensayo (Con cada Kit ???) tilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista reactivo, Proteína purificada ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…) tilización del alimento alergénico reparación de muestras control: Valor teórico  “Incurred”: muestra adicionada y sometida  
  33. 33. Centro Nacional de Alimentación QUETADO PRECAUTORIO aración voluntaria que usan los fabricantes en las etas de los alimentos que indica la presencia ncial y no intencionada de un alérgeno 77 %  ‐ Puede contener trazas de……. 6 % ‐ Puede contener indicios de…. 13 % ‐ Elaborado en fábrica que utiliza…… 3 % ‐ Aroma de ….. uestras analizadas con etiquetado precautorio:
  34. 34. Centro Nacional de Alimentación BGL  28% Caseína  39% Avellana 60% Cacahuete  Huevo10% Apio 13% Soja 30% Total   Muestras  analizadas  Muestras  Positivas % 18 5 28 a 18 7 39 a 10 6 60 ete 18 4 22 10 1 10 8 1 13 10 3 30
  35. 35. Centro Nacional de Alimentación IÓN INTERNA : firmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas,  de que  se  los requisitos particulares para un uso especifico previsto  (Norma UNE/IEC  005) o garantizar los resultados  ? Comprobar resultados por el son bles en el o • repetibilidad • Reproducibilidad PRECISIÓN DEL  MÉTODO • Comprobar en distintas matrices • Aceptable (Recuperación 80% ‐120%) EXACTITUD DEL  MÉTODO • LD Límites de detección • LC Límites de cuantificación LD/LC
  36. 36. Centro Nacional de Alimentación nización de los métodos de detección  UNE‐ EN 15633‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos  mediante métodos inmunológicos‐ Parte 1: Consideraciones generales” UNE‐ EN 15634‐1:2009. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos  mediante métodos de biología  molecular‐Parte 1: Consideraciones generales” UNE‐ EN 16388 IN‐:2012. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos alimenticios. Formato para  proporcionar información sobre métodos inmunológicos y métodos de biología molecular ” DACION DE MÉTODOS POR ORGANISMOS INTERNACIONALES UNE‐ EN 15842:2010. “Productos alimenticios: Detección de alérgenos Consideraciones generales y Validación  de métodos”
  37. 37. Centro Nacional de Alimentación clusiones /Necesidades eación de un Laboratorio Europeo de eferencia. Armonizar métodos tablecer Umbrales de toxicidad / Límites gales ateriales de referencia
  38. 38. Centro Nacional de Alimentación Muchas Gracias Servicio de Biotecnología ‐ CNA Mª Isabel Prieto Santos mprietos@msssi.es Mª del Camino Martín‐Forero Buendía  mmartinforero@msssi.es

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