Guia tp enfermeria 2011

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Guia tp enfermeria 2011

  1. 1. Andrés Bello UniversidadFacultad Ciencias BiológicasDepartamento de Ciencias BiológicasLaboratorio de Microbiología GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS MICROBIOLOGÍA BIO 050 CARRERA: ENFERMERÍA
  2. 2. 2 TRABAJO PRÁCTICO N°1 PROCEDIMIENTOS BÁSICOSNORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DEMICROBIOLOGÍADurante el desarrollo de las actividades prácticas se debe mantener una serie de normas,cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familias y lacomunidad.1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminación de susropas.2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado.4. Está estrictamente prohibido comer, beber, comer, fumar, masticar chicle, o llevarsecualquier objeto a la boca, por el riesgo de contagio.5. No ingresar bolsos o chaquetas a la sala de trabajos prácticos.6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y después de su uso. Al enfriarla, evitesalpicar, los aerosoles son muy contagiosos.7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de materialcortopunzante.8. Las placas de Petri sólo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menora los 30cm del mechero Bunsen encendido.9. Los tubos deben flamearse antes y después de ser utilizados.10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, estotambién se recomienda frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contactocon material contaminado.
  3. 3. 311. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Éste sólo debe encenderse almomento de la observación de la preparación. La que debe retirarse terminada laobservación, para limpiar el lente de inmersión con Xilol y papel tissue.12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de realizado eltrabajo prácticoEl estudio de bacterias, virus, parásitos y hongos potencialmente patógenos para el hombre,animales u otros seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y losprocedimientos empleados. Las normas de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptableel riesgo asociado a su manipulación. Deben considerarse para lograr que el personal quemanipula estos agentes infecciosos en el ámbito hospitalario esten mínimamente expuestas aadquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a protegerla salud de las personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biológicos,físicos o químicos en el laboratorio, como también indirectamente al ambiente.AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genéticamente modificados,presentes en forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originarcualquier infección, alergia o toxicidad.CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN EN EL LABORATORIOEl laboratorio tiene importancia central en el diagnóstico etiológico, de modo que resultafundamental evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desdelas otras muestras (contaminación cruzada).Con este fin, se debe trabajar con TÉCNICA ASÉPTICA y utilizando material ESTÉRIL.Algunos conceptos que debemos conocer y manejar son:DESINFECCIÓN: proceso que busca eliminar la mayoría de los microorganismospatógenos, excepto esporas y algunos virus, en objetos inanimados.
  4. 4. 4ASEPSIA: proceso que utiliza agentes químicos para impedir infección de piel, mucosas uotros tejidos en seres vivos. Los antisépticos actúan provocando muerte de losmicroorganismos patógenos o impidiendo su multiplicación.SANITIZACIÓN O HIGIENIZACIÓN: Proceso que utiliza lavado mecánico o agentesquímicos para REDUCIR el número de patógenos presentes en un objeto hasta nivelesaceptables para la salud pública.ESTERILIZACIÓN: proceso físico o químico destinado a destruir TODA vida microbiana,incluyendo esporas, en materiales u objetos inanimados.TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN1.- Métodos Físicosa) CalorEs el método más usado, económico y fácil de controlar. Proceso rápido al cual la totalidadde los microorganismos resulta sensible.Pasteurización: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lácteos (Tuberculosis,Brucelosis, Salmonelosis) y retrasar descomposición de la leche.Autoclave (vapor saturado a presión): Entre los métodos de esterilización, es el más efectivoy de menor costo; es el método de elección para instrumental médico de uso repetido.Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A través delflameado se evita la contaminación de tubos y matraces., al someterlos directamente a lallama.b) RadiacionesRayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicacióndel DNA durante la replicación celular.
  5. 5. 5Se usa principalmente en ambientes de quirófanos, sala de prematuros, esterilización desuperficies.Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilizaciónen frío de materiales desechables como: jeringas, bisturís, catéteres, prótesis, guantes decirugía y equipos de transfusión.2.- Métodos MecánicosOndas sónicas y ultrasónicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendodesnaturalización de proteínas y muerte celular.Filtración: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias líquidas o gases,mediante su paso a través de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal esla esterilización de sueros o líquidos que contengan proteínas o metabolitos termolábiles.3.- Métodos Químicos (antisépticos y desinfectantes)La penetración de estos agentes es más rápida en bacterias Gram positivas, debidoprincipalmente a la presencia protectora de la membrana externa en las bacterias Gramnegativas.Los agentes químicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales alencontrarse contaminados con bacterias, siendo el género Pseudomonas el más habitual.Esto es de suma importancia y para evitarlo es imprescindible que el personal de saludcuente con un acabado conocimiento del tema.
  6. 6. 6 El siguiente cuadro resume los principales agentes químicos y su utilidadAGENTE ACCIÓN APLICACIÓNAlcoholes 70% Sobre formas vegetetivas Piel y superficies inertes (no esporas). Desnaturaliza proteínasCloro Bactericida. Actúa oxidando Útiles de cocina, chatas, grupos sulfhidrilos libres patos, baños, unidades de diálisisYodo/povidona yodada Bactericida. Actúa sobre formas Piel heridas, material vegetativas y esporas, hongos y quirúrgico algunos virus. Interfiere procesos de oxido – reducción y fosforilación bacterianos.TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍAEl objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo querespecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto deesterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc) ysiembra en condiciones anaeróbicas.El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tresactividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se iniciacon el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condicionesdefinidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismoaislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad aantibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra laidentificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con elfin de hacer el control de la infección o análisis de población.Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivopuro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario eindispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1).Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimientoimportante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta consiste en
  7. 7. 7colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen ymultipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivocorrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica.Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo dedistintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes delproceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado depureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas ybioquímicas y lograr así su identificación correcta.Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamientode UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se deberealizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido paraobtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtenercultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfologíay microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacterianamediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICOUna etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es laobservación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no esposible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblacionesbacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a lasbacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores decrecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en suorigen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivosólido, hasta formar una población que se represente como una colonia visible. Por lo tantouna colonia esta formada por millones de bacterias.
  8. 8. 8El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias.El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características.Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico)permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseencaracterísticas propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen,superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre). Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que haceimposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hacenecesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias. Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para laidentificación definitiva de las colonias. En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de coloniasbacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo. Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.
  9. 9. 9de uso común en el Laboratorio de Tabla Nº 1 : Material Microbiología EsterilizaciónMaterial Tipo esterilización Tipo de material Antes de ser utilizada Después de ser utilizadaAsa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizablePipetas aforadas de vidrio* Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizablePipetas aforadas de plástico Química No No DesechablePipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable AutoclaveTubos estériles** Si Si Re-utilizable Llama MecheroPlacas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizablePuntas de Papel Absorbente Autoclave No No DesechablePlacas Petri de plástico Química No Si Desechable* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparloy sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitarla entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.
  10. 10. ACTIVIDADES PRÁCTICAS1. De medios Sólidos a medios Sólidos. 1.1. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido: a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha). b. Flamear el asa para su esterilización. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo. g. Flamear y tapar la boca del tubo. h. Flamear el asa para su esterilización. i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada. A B C D Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar tendido.
  11. 11. 112. De medios Sólidos a medios Líquidos. 2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido: a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo, Grupo, Fecha). b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar). e. Flamear la boca del tubo con medio líquido. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización. h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada. A B C D 18 – 24 Hrs. Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.
  12. 12. 123. De medios Líquidos a medios Sólidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri: a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes. b. Flamear el asa para su esterilización (hasta que se ponga rojo). c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero. g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa. Flamear el asa. ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa. iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa. iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa. h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización. i. Incubar la placa a la temperatura adecuada. A B C D 18 – 24 Hrs. Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.
  13. 13. 134. Técnicas de esterilización 4.1. Flameado a. Dividir una placa por la mitad. b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa. c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra mitad del agar. d. Cerrar la placa. e. Incubar la placa a 37ºC.5. Desinfección y Asepsia 5.1. Cloro a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos. b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico. c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del mechero (más de 30 cm). d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag). e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos. f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag). g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr. 5.2.Yodo a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar. b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos segundos. c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. d. Incubar la placa a 37ºC. 5.3.Alcohol a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro. b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición. c. Incubar la placa a 37ºC.
  14. 14. 14ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Continuación)OBJETIVOS1. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido (Placas de Agar).2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.3. Practicar preparación de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.En la siguiente sesión de trabajo práctico Ud. debe:1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando lossiguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura,color y brillo).2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo líquidos y sólidossembrados en la primera sesión. Describa lo observado.3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilización, desinfección yasepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar.4. Realizar análisis de morfología microscópica4.1 Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (del tamaño de unaarveja).b. Flamear el asa para su esterilización.c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto,suavemente, formando una capa delgada.f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.4.2 Tinción simplea. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusión del colorante
  15. 15. 15c. Lavar suavemente con agua.d. Secar con papel absorbentee. Observar al microscopio con aumento de 100X oilf. Describa lo que observa: forma, agrupación, color.MICROSCOPIO OPTICO: • Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. • Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.
  16. 16. 16USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DEINMERSIÓN1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo deinmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo lazona de interés.4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x(línea negra) EVITE CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE INMERSIÓN.5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberáestar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeñoespacio7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTEEL OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES(PAPEL SUAVE) IMPREGNADO EN XILOL.9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado,con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)
  17. 17. 17TRABAJO PRÁCTICO N°2MORFOLOGÍA BACTERIANAMEDIOS DE CULTIVOUn medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente para elcrecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios líquidos pueden serusados en tubos de ensayo o en botellas de vidrio. Los medios sólidos se obtienen de unasolución de nutrientes solidificada con agar (polisacárido obtenido de ciertas algasmarinas que actúa como agente gelificante) o gelatina y se usan en placas de Petri. Elagar es el agente gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoríade las bacterias y no se funde a 37ºC (Tº usada para la incubación de las bacterias).Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad demicroorganismos que se desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (proteínas,aminoácidos y/o sales inorgánicas que contengan nitrógeno) y fuentes de energía(carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clínica:- Agar nutriente (corriente): Es un medio básico usado con propósitos generales para elcultivo de muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por laadición de sustancias adecuadas.- Agar sangre: Es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-10% de sangre.Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetellapertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentarel agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivodenominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el creciminetode ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae.- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares ycristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguiraquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las
  18. 18. 18bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E. coli) forman colonias rojas debido aque los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de pHdel medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (porejemplo muchas cepas de Salmonella) forman colonias incoloras.Clasificación de los medios de cultivo1.- Según estado físico:a. Sólidos (solidificados por adición de agar al medio líquido o de alguna proteínacoagulada).b. Líquidosc. Semisólidos2.- Según contenido nutricional:a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).b. Mejorados (o enriquecidos): por adición al medio corriente de: sangre, proteínas,hidratos de carbono, extracto de órganos o levadura.c. Sintéticos y mínimos: Los primeros son medios de fórmula perfectamente conocida,en la cual se emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen apropósitos bien definidos. Los segundos son también sintéticos, pero a su fórmula que nopermite el crecimiento bacteriano se le adiciona uno o dos sustratos o elementos, sobrelos cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio, sin interferencia deotro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecerá sólo si esa sustancia esutilizada.3.- Según su empleo con propósitos de diagnóstico o taxonómicos.a. Selectivos: Son aquéllos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento deotros microorganismos. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientesdel medio. ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias Grampositivas, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio para examinar
  19. 19. 19patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram negativos. ej.: Agar sangrecon azida de sodio, agar Petragnani.b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pHque permiten apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con unconjunto de pruebas de este tipo clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonomíasobre base de pruebas bioquímicas".Muchos de estos medios sólidos diferenciales contienen uno o más hidratos de carbonofermentables y un indicador adecuado para la determinación de la producción de ácidos ocompuestos alcalinos. ej.: citrato (Simmons), agar triple azúcar hierro (TSI). Los cambiosproducidos en el medio por un organismo o grupo de organismos son característicos,diferenciándolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios diferencialespermiten identificar reacciones de fermentación de los cultivos puros de bacterias o sucapacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola fórmula los elementos de los mediosselectivos y diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar yclasificar.Ej.: Medio Nº 110 para Staphylococcus, éste contiene 7.5% de NaCl, en circunstanciasque la concentración salina de la mayoría de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Esteingrediente evita el desarrollo de casi todas las demás bacterias.Además, las pruebas de la gelatina y la fermentación del manitol permiten diferenciar lasdiversas cepas de Staphylococcus.Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey. En la figura Nº 1 se observa algunas características macroscópicas de coloniasbacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de microorganismos. MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie decaracterísticas complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,flagelos), movilidad, etc.
  20. 20. 20Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos.En el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utilizael microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacerposible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeñadiferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda.Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que laque se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivoespecial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar elcontraste se insertan filtros verdes o azules.a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivoy evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas decoloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de losmicroorganismos.b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para laobservación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, ode ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminososdirectamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Seemplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente seobservan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido ydepositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre unportaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.2. Observación de bacterias muertas:a. Tinción simple: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia demicroorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo deeste tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular comonucleoide, flagelo, esporas, etc.
  21. 21. 21d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructurafísica como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferentefrente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos debacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada enbacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción de Ziehl Neelsen. Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por métodos detinción son esporas y cápsula:a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de tinción especial. Algunosgéneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una formade resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta denutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor,a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructuraproteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las haceresistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.b. Observación de cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china quepermite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.El estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener unaorientación preliminar de su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioquímicasespecíficas que permitirán una identificación más certera y precisa.La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram(Figura Nº 2), pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gramnegativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana(pares, cadenas, racimos).La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luegotratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias setiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el coloranteal tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo; las que sedecoloran son Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con un colorante decontraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color violeta y lasGram negativo de color rojo o rosado.
  22. 22. 22 La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia enla composición química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Grampositivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gramnegativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa(además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego dela acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces deretener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo, pierdenparte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un solventeorgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad depeptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en latinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla enforma adecuada.También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden observarse comoGram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de 24 ó 48 horas), apH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen)es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M.tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con latinción de Ziehl Neelsen.Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero una vez teñidas, el colorante no se libera,aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de alcohol y ácidoclorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que tiene su cubierta,incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y 40% delpeso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lípidos le confiere a estegrupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en mediolíquido), resistencia a la acción de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debidoa la dificultad de absorción de nutrientes a través de esta pared celular lipídica.
  23. 23. 23Figura Nº 2: Técnica Tinción Gram.1 Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos2 Agregue solución de lugol por 1min.3 Decolore con alcohol-acetona y lave con agua4 Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel
  24. 24. 24TABLA Nº 1: Cuadro Resumen Tipo de TincionesTINCIÓN REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD Cristal Violeta, Lugol, Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Clasificación bacteriana clásica:Gram Alcohol – Acetona, Safranina Gram negativo se tiñen con contraste (rojo) Gram Positivo y Negativo Esporas de bacilosTinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Gram Positivo Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul Unión ácido resistente de fucsina a escasosKinyoun Nocardia (BAA lábiles) de Metileno ácidos micólicos de la pared (fucsia) Naranja de Acridina Tiñe el DNA bacterianoAnaranjado de acridina Bacterias Gram lábiles (fluorescencia) (fluorescencia naranja) Bartonella spp,Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia) corpúsculo elemental de Chlamydia Fucsina, Alcohol – Acido, Azul Unión ácido-alcohol resistente de fucsina aZiehl-Neelsen Micobacterias (BAAR*) de Metileno ácidos micólicos de pared (fucsia) Micobacterias Auramina – Rodamina Unión de auramina-rodamina al ácidoAuramina / rodamina (mayor sensibilidad que Permanganato de Potasio micólico de la pared (fluorescencia amarilla) Ziehl Neelsen)
  25. 25. 25Utilidad clínica de la tinción de Gram:Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de una infección, que muchasveces sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de100.000 bacterias /ml de muestra.La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un testpositivo) varía según tipo de muestra:Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%Líquido articular (artritis séptica) : 50%Se debe solicitar en toda muestra clínicaDe gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues sibien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.ACTIVIDADES PRÁCTICASOBJETIVOS1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo sólido (Placasde Agar) de acuerdo a criterios macroscópicos.2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula ytinción de esporas.3. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.4. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.5. Observar diferentes preparaciones fijadas y describirlasOBSERVACIONES MACROSCÓPICAS1.- Siembre mediante técnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en ellaboratorio tanto en agar sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37ºC por 24hrs.
  26. 26. 262.- En la siguiente sesión de trabajo práctico observe y describa las colonias desarrolladas enlos distintos medios, según sus características macroscópicas (figura 1).OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS1. Observación de muestras fijas.Observar en el microscopio óptico con un aumento de 100X (usando aceite de inmersión), laserie de preparaciones teñidas fijas (colección en caja) e identificar la forma, agrupación yafinidad tintorial.2. Tinción de Esporas.Procedimiento :a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamaño de una arveja) sobre el portaobjeto.b. Esterilizar el asa y obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus sp.c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se sequecompletamente (sin hervir).d. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregar solución colorante Verdede malaquita. El colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto conel frotis bacteriano.f. Esta tinción se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestraencima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 3 min. Nosobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.g. Si la emisión de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde demalaquita y el papel.i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.j. Lavar con agua.k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.
  27. 27. 27 A B C D Papel Absorbente E F G Verde Malaquita Safranina Figura Nº 3: Procedimiento Tinción de Esporas. Localización y morfología de las esporas en BacillusNOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño quelas bacterias) son pequeñas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporasintracelulares. En estas últimas se determina si se encuentran al centro o hacia un extremo dela célula y, si la espora deforma o no al bacilo.
  28. 28. 283. Tinción de Cápsula.Procedimiento:a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamaño de una arveja.b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregarla bacteria). La Tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lomismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegúrese deesterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.e. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Estose realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto quecontiene la mezcla Tinta china-bacteria. Ver figura.f. Fijar suavemente en el mechero.g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.
  29. 29. 29A BC DE F Fucsina Bacterias Cápsula Figura Nº 4: Procedimiento Tinción de Cápsula.
  30. 30. 304. Análisis Microscópico mediante tinción de Gram1. Realice tinción de Gram a las muestras que Ud. sembró y observe al microscopio.Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.a. Flamear el asa para su esterilización.b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámetro).c. Flamear el asa para su esterilización.d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.e. Obtener una pequeña muestra desde la placa.f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.Tinción frotis mediante Grama. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejarcon Lugol por 1 min.d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente,hasta que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y luego con agua)e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.2. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión.Caracterizar según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) losmicroorganismos.
  31. 31. 31TRABAJO PRÁCTICO N°3FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLÍNICAS DEBACTERIAS GRAM POSITIVO Como en la mayoría de los animales, el organismo humano posee lugares quenormalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, unagran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aún en las personas mássanas. La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a losmecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos,piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normaldel ser humano. La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primerosmicroorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y delárea perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotascaracterísticas de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y probablemente sederivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de substancias alimenticias, que favorecenel crecimiento de saprófitos.Zona boca, región orofaríngea y vulva: Con substancias provenientes del exterior oacumulación de restos celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existenciade anaerobios.Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenidolipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente.Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en número a las formas facultativas yaerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una interacción permanente entre loscomponentes de la flora y el hospedero, que provoca fluctuaciones en la biota, tantocualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones incluyen los beneficiosos,inaparentes, hasta los perjudiciales.
  32. 32. 32Algunos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de lasdiferentes regiones del cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son:Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcussalivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae,Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus mirabilis,Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios comoClostridium tetani.La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Grampositivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fúngica comoCandida albicans.Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través dela nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos sonatrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos nasales, la tráquea, losbronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La nasofaringe es el hábitat natural debacterias y virus patógenos que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios ypulmones.Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococosdescargando estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sinembargo este equilibrio puede romperse por:- Aumento de la masa crítica- Traslado desde el sitio original- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a unainfección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que seproduzcan estas enfermedades, como son:- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.- Cirugías.- Uso de antibióticos.Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:
  33. 33. 33- Infección urinaria por Enterobacterias.- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado deantibióticios.ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICOPara llegar a la identificación de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. Elprimero implica la toma de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados según lasospecha clínica.El segundo paso corresponde al examen microscópico directo, con o sin tinción.El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios decultivo adecuados donde la muestra y las bacterias, que ésta pudiese o no contener, puedanencontrar los nutrientes y factores adecuados para propiciar su crecimiento y desarrollo.El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrirá a determinar sumorfología bacteriana como su posible agrupación, y se aplicará distintas pruebasbioquímicas y fisiológicas destinadas a conocer sus características metabólicas.Por último se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. TOMA DE MUESTRAEXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO (Gram o Ziehl-Neelsen)AISLAMIENTO DEL AGENTEIDENTIFICACIÓN FISIOTAXONÓMICA DEL AGENTETinción: Morfología y agrupación; Pruebas BioquímicasSUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA INFORME
  34. 34. 34SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARAESTUDIOS MICROBIOLOGICOS.En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más importantees la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico.Esta recolección comprende cuatros pasos importantes: 1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra. 2. Usar la técnica más apropiada. 3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el personal que posteriormente la manipula. 4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados.Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismoetiológico real, y la recuperación de contaminantes puede llevar a indicar unaantibioticoterapia incorrecta y a veces incluso perjudicial. Debe recordarse entonces, que “lacalidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior a la calidad de lamuestra recibida”.Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte activa,es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar, para lograrasí su colaboración y participación, lo que lleva a la obtención de la muestra en óptimascondiciones.Recolección y transporte de la muestras:Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o poraspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%,seguido por povidona yodada, la que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Siel paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol.Volumen. Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no debieranusarse tórulas. El volumen de muestra que se envía al laboratorio es generalmente menor delo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos para cada tipo de muestra.
  35. 35. 35Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes métodos de recolección, desde la tórulahasta aparatos recolectores de muestra.Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato decalcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estéril conun medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar envases plásticosestériles, o tubos con tapa rosca.Técnicas de recolección. Con el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación delagente etiológico es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante.Medio de transporte. No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para ciertastécnicas específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la pérdida de laviabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se usan tórulas, en elcaso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio,el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el mediode transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante suenvío al laboratorio.PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRASMICROBIOLOGICAS DE DISTINTAS ZONAS ANATOMICASINFECCION TRACTO URINARIO (ITU)(Orina, secreción uretral y prostática)UROCULTIVOSMuestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer yretrayendo el prepucio en el varón durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro deorina, a fin de arrastrar mecánicamente la flora externa del tracto genitourinario.Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptáculo estéril y sin interrumpir la micción.Tener presente de poner un tapón vaginal en la mujer a fin de evitar contaminación con laflora vaginal.Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de lasprimeras dos horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4º C y trasladarla manteniendola cadena de frío.
  36. 36. 36Muestra por punción de catéter urinario: Desinfectar el sitio de punción del segmentoproximal del catéter con alcohol 70%, aspirar con jeringa estéril entre 2 a 5 ml de orina,vaciar en tubo estéril y transportarla al laboratorio de la misma forma que la muestramiccional.Muestras por punción suprapúbica: Antisepsia de la piel en el sitio de punción, aspirarcon técnica aséptica entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igualforma que los casos anteriores.Secreción uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secreción en tórulaestéril, colocar en medio de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primerahora de la mañana o después de una hora de orinar.Secreción prostática:La técnica de recolección es exprimir la próstata a través de un masaje prostático por víarectal e impregnar una tórula estéril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)(Neumonía, TBC)TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVASPrevio a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recogerla muestra en receptáculos estériles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si noes posible mantenerla refrigerada transitoriamente a 4º C por no más de dos horas. Esrecomendable facilitar la expectoración con kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. Enpacientes intubados realizar la aspiración endotraqueal con sonda estéril y técnica aséptica,introducirla evitando su contaminación con gérmenes exógenos y aspirar depositando elcontenido en tubo estéril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este últimotiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar eldiagnóstico etiológico en pacientes conectados a ventilación mecánica.TOMA DE MUESTRAS INVASIVASCuando se trata de identificar el agente etiológico de neumonía nosocomial, las muestras quetienen mejor rendimiento; pero también mayores riesgos para el paciente, son aquellastomadas por broncoscopías (lavado broncoalveolar, aspirado telescopado protegido),Toracocentesis y Biopsia.
  37. 37. 37Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a través de broncoscopía y contécnica aséptica aspirar entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tuboestéril al laboratorio para su estudio.Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopía introducir cepillo a través del catéterprotegido frotar la zona alterada y enviar en tubo estéril de inmediato al laboratorio paraestudio semicuantitativo. *Toracocentesis: Realizar el procedimiento con técnica aséptica, aspirar 10 ml si es posible.Transportar de inmediato al laboratorio para su estudio.Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con técnica aséptica, enviar un trocito de tejidoen tubo estéril o en medio de transporte con caldo específico. Trasladar la muestra deinmediato para su estudio.*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumoníaes:Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traquealCon recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegidoCon recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolarINFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)Secreción faríngea: Deprimir la lengua y frotar con tórula estéril amígdalas, pilaresanteriores y pared posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar deinmediato al laboratorio, si no es posible la muestra se mantiene transitoriamente atemperatura ambiente.Secreción nasal: Introducir tórula estéril más o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar ycolocar en medio de transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestratransitoriamente a temperatura ambienteINFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)(Superficial, profunda abscesos cerrados)Infección superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celularsubcutáneo.Infección profunda: son aquellas que incluyen fascia y músculo, pudiendo comprometer ono cavidades u órganos.
  38. 38. 38Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiológico o Ringer, frotar contórula estéril el centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio detransporte y enviar al laboratorio para su siembra y estudioToma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiológico o Ringer,tomar la muestra con tórula de la parte más profunda de la herida, colocar en medio detransporte y enviarla al laboratorio.Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antisépticos la superficie y los bordes de laherida, aspirar de la zona profunda de la herida 0,5 ml de secreción y enviar en la mismajeringa sellada al laboratorio, teniendo la precaución de eliminar toda burbuja de aire de suinterior.Si no es posible aspirar material, introducir tórula en lo más profundo de la herida ycolocarla en tioglicolato. De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido(6 mm) con pinza estéril y dejarlo caer en el tioglicolato o en suero fisiológico e incluso entubo estéril sin ningún preservante.Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de punción con antiséptico, aspirar material en loposible 10 ml y vaciar a tubo estéril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobiosenviar en la misma jeringa sellada, eliminando todo el aire remanente.COMENTARIOLas muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH ácido de este materialdestruye rápidamente los microorganismos, siendo difícil su aislamiento posterior a lasiembra.INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSASSecreción conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estéril, frotar contórula humedecida el borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transportepara su envío al laboratorio.Secreción ótica: Limpiar el canal auditivo con jabón antiséptico, tomar la muestra contórula estéril y colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio.
  39. 39. 39Secreción umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza,colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.COMENTARIO.Las muestras tomadas por punción ocular u ótica deben ser enviadas en la misma jeringa oen caldo de cultivo tioglicolato.INFECCIONES GINECO – OBSTETRICASEndocervix: Previo aseo genital, introducir tórula hacia el canal cervical y rotar, colocar latórula en medio de transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseriagonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de Thayer Martin en Z la que debe ser solicitadapreviamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al laboratorio en receptáculocon una fuente que consuma oxigeno.Endometritis: A través de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa concatéter protegido. Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado entioglicolato. NO REFRIGERAR.Douglas: Aspirar por punción del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en lamisma jeringa tapada como para estudio de anaerobios.Secreciones vaginales: Para estudio bacteriológico y de hongos. A través de un especulofrotar con tórula estéril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco,colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.Para Trichomonas, introducir suero fisiológico tibio, recoger y vaciar en tubo estéril de 3 a 5ml. Enviar de inmediato al laboratorio.Líquido Amniótico: Obtener por punción, previa desinfección con antiséptico y enviar allaboratorio en la misma jeringa o en tubo estéril entre 5 a 10 ml de muestra.Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirúrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar entubo estéril o caldo tioglicolato como para estudio de anaerobios.Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la cirugía y enviar tejido o aspirado de lamisma forma que para estudio de anaerobios.COMENTARIO
  40. 40. 40En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiológicos no son necesarios para sunotificación ya que es suficiente el criterio clínico, por otra parte la etiología espolimicrobiana y predecible.En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectarStreptococcus beta hemolitico grupo A u otro agente no habitual.MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES YCATETERESLíquido cefalorraquídeoPrevia desinfección de la zona con antiséptico y con técnica aséptica, obtener entre 2 a 3 mlde muestra y en tubo estéril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla almomento, transitoriamente debe mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.Líquido ascíticoAspirar idealmente 10 ml de muestra a través de punción abdominal con técnica aséptica,vaciar a frasco de hemocultivo y simultáneamente 1 ml en tubo estéril seco para tinción enlaboratorio.Lecha MaternaLimpiar el pezón previo a extracción de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre2 a 5 ml en tubo estéril. Enviar de inmediato al laboratorio.CateterLa cateterización venosa se define como la inserción de un catéter biocompatible en elespacio intravascular, central o periférico, con el fin de administrar soluciones,medicamentos, nutrición parenteral, medios de contraste y realizar pruebas diagnósticas,entre otros.Para cultivar catéteres vasculares, existen 2 técnicas.1.- Cortar de forma aséptica la punta del catéter e introducirla en un tubo con caldo corriente.Esta técnica tiene la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por locual, no se puede asegurar que en un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda auna contaminación con flora de piel.
  41. 41. 412.- Cortar de forma aséptica la punta y el segmento intracutáneo del catéter. Introducir en unfrasco o tubo estéril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando unapinza estéril, hacer rodar el catéter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces haciaadelante y hacia atrás (técnica de Maki). Es una técnica semicuantitativa que permite realizarel recuento de colonias y, basándose en este recuento, determinar con mayor exactitud si uncultivo positivo corresponde a contaminación con flora de piel o a infección relacionada conel catéter.Catéter venoso central tunelizado. Catéter venoso central implantable.INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)CoprocultivosIntroducir tórula limpia en la zona más alterada de las deposiciones recién emitidas (mucus osangre) y colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarsedirectamente del recto, del pañal o receptáculo limpio.Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio detransporte. Las muestras tomadas por rectoscopía o colonoscopías tienen mayor rendimiento,por cuanto de ser posible es recomendable obtener las muestras de esta forma.Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recién emitidas en tubo ofrasco limpio y seco.Aspirado gástrico en RNAspirar por sonda nasogástrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estéril. Sólo sejustifica esta muestra en las primeras 24 horas de vida.
  42. 42. 42FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través delas alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitidoestablecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentesgéneros y especies.Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especiesbacterianos en base a la detección de:a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol,Citrato.b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol,CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol.c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa.d. Sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina, Optoquina,Novobiocina.Para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos métodos, encambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo másimportantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae (figura 1).La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus yPlanococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Soncatalasa positivo, reacción que diferencia la Familia Micrococcaceae de otros cocos Grampositivo como Streptococcus.
  43. 43. 43 Agrupación de algunas cocáceas Gram +Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en la pielde mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferenciade las especies del género Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otracaracterística que diferencia ambos géneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentarglucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus que no tienen esta propiedad (Tabla 1).Las principales especies del género Staphylococcus son: Staphylococcus aureus yStaphylococcus epidermidis.Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas yenzimas responsables de su patogenicidad. Algunas enzimas son:a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por lasbacterias.b. Fibrinolisina: Disgrega coágulos de fibrina.c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana,coagulando el plasma.d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.Las toxinas producidas por S. aureus causan los síntomas asociados a las enfermedadesestafilocócicas. Estas toxinas son:a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteínaantigénica de peso molecular 30.000.
  44. 44. 44b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulación de los leucocitos ymacrófagos.c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el síndrome de piel quemada.d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.Aislamiento y Caracterización:El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es unalimento o una muestra clínica.Para muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada decordero o conejo. Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus yademás visualizar la producción de hemolisinas, por lisis de los glóbulos rojos alrededor delas colonias (figura 2).S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por laalfa toxina.S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.Micrococcus: no produce hemólisis. Tipos de hemólisis en agar sangre
  45. 45. 45 TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO Cocaceas Bacilos Catalasa Catalasa positivo Positivo Negativo Aspecto Tinción Gram Test de Bacitracina Streptococcus R S Observar Hemólisis Test de Coagulasa Micrococcus Bacilos Grandes (+) (-) Esporulados Hemólisis Hemólisis Hemólisis Bordes netos Alfa Beta GammaStaphylococcus aureus Staphylococcus Coagulasa negativo Bacillus sp Test de Latex Bilis Esculina Optoquina Optoquina NaCl 6,5 % Test de Novobiocina Bacilos finos resistente sensible S R Streptococcus Enterococcus Grupo A, B, C, Listeria S. Coagulasa negativo Staphylococcus D, F, G No saprophyticus saprophyticus Streptococcus Streptococcus Bacilo en empalizada grupo viridans pneumoniae Corynebacterium sp Bilis positivo NaCl positivo Enterococcus
  46. 46. 46b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencialque contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus yStaphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración deNaCl. Además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje delindicador a amarillo.S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de lafermentación)S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitolMicrococcus: no fermenta el manitol.En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción deGram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden darcolonias semejantes.Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en mediosselectivos se realiza las pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico. Si se sospecha quela colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de Staphylococcusaureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de puentes entre bacteria ybacteria, formándose un coágulo.Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.Ésta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, según eltipo de enzima:a) Técnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo congotas de cultivo líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la apariciónde un coágulo a las 4 horas.b) Técnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo deStaphylococcus en medio sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua.Esta suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas deplasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de lasbacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de aglutinación, que será empleadoen el laboratorio.Test comercial de aglutinación: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otrosStaphylococcus. La metodología consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre uncírculo de la tarjeta; a continuación se emulsiona sobre ésta la colonia sospechosa, se agita
  47. 47. 47durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera positiva. Siempre sedebe realizar un control negativo incluído en el kit (figura 3).Partículas de latex Bacterias Aglutinación de las partículascon anticuerpoAnticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.(proteína A)A su vez el Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativosque se disponen en pares o cadenas y son catalasa negativo reacción que los diferencia de laFamilia Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides oalargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animalescomo cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en laindustria lechera para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcuslactis).Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadasen placas de agar sangre de conejo o de cordero.a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (S. viridans)alrededor de las colonias.c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis
  48. 48. 482.-SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: clasificaciónde Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbonopresente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos quevan desde la A hasta la U.Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos betahemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno.Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc.Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agentecausante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tieneforma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por unacápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas debenincubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfahemólisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcusfaecium). Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre yanimales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizanporque generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad(NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos nopueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.Aislamiento y Caracterización:El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa deagar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias,las cuales son muy pequeñas.Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena,ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vezconfirmada su presencia se realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico.a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar aun antibiograma. Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo no son betahemolíticos.
  49. 49. 49b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediantereacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y puedenhidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus deotros cocos gram (+) catalasa-negativo. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio setorna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, losdescubridores del fenómenoLa mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible (factorCAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas deStaphylococcus aureus causando la hemólisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangrese inocula los Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a una estría central deStaphylococcus aureus. Tras la incubación se observa la presencia de una zona hemolítica enforma de punta de flecha en el área de intersección, donde el factor CAMP y la beta-hemolisinahan difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus delgrupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:Método de Difusión en Agar o Kirby-BauerSe utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintosantimicrobianos. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre
  50. 50. 50una placa de agar donde se coloca discos de papel filtro estériles impregnados con unaconcentración conocida de antibiótico.Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunascondiciones de laboratorio:a) Concentración de bacterias que se siembra. Requiere uso de estándares de turbidez: MacFarland 0.5b) Medio de cultivo utilizado: Agar Müller-Hinton o agar Müller-Hinton Sangre paraStreptococcusc) Concentración del antimicrobiano en el disco: característica para cada antimicrobiano.d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara unasuspensión bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de lasuspensión debe ser homogénea sobre el agar (figura 4).El antibiótico en los discos difunde radialmente durante la incubación de tal manera que amedida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, laconcentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,produciéndose entonces una zona circular de inhibición (halo de inhibición) alrededor deldisco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.Figura 4: Antibiograma mediante la técnica dedifusión con discosBacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogéneamente. Se coloca un disco debacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.
  51. 51. 51Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥10 mm de diámetro y resistentecuando el halo de inhibición es < 10 mm de diámetro.Micrococcus es sensible a bacitracina.Staphylococcus es resistentes a bacitracina.Optoquina: compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celularbacteriana. A bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae(sensible) de otros Streptococcus hemolíticos. El disco de Optoquina se deposita en una placade agar sangre, sembrada homogéneamente con la colonia sospechosa. Se incuba a 37°C por24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae.Novobiocina: antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones porS. aureus e infecciones urinarias resistentes a otros fármacos. Es bacteriostática e interfiere conla síntesis de la pared bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso estáasociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepasresistentes. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥16 mm de diámetro yresistente cuando el halo de inhibición es < 16 mm de diámetro.Amoxicilina / Ácido Clavulánico: esta asociación se indica para el tratamiento a corto plazode infecciones bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que estáncausadas por cepas resistentes a Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otrassituaciones, debería considerarse la Amoxicilina sola.Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitisrecurrente. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas debronquitis crónicas, bronconeumonia. Éstas son a menudo producidas por Streptococcuspneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis(especialmente cuando sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto séptico,sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal. Son a menudo producidas por
  52. 52. 52Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. yEnterococcus spp.)Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales yabscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcusaureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas de estos gérmenes producenbeta-lactamasas, de modo que no responden a Amoxicilina sola.NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajarACTIVIDADES PRÁCTICASObjetivos1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas apartir de muestras clínicas así como de flora normal3. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas.5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.I. MUESTRAS CLÍNICAS1. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las coloniasbacterianas. Observe si se trata de cultivos puros.2. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe almicroscopio con aumento 100X oil.Recuerde que en el caso de cocáceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupaciónbacteriana y el tipo de hemólisis para el diagnóstico.
  53. 53. 533. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación debacterias Gram positivo.a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2.La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepciónes Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciarStaphylococcus, Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa +, de Streptococcus, catalasa -.Procedimiento Prueba de la catalasaa) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto.La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya queestas sustancias dan falsos positivos.c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivosb. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcusaureus.Procedimiento Prueba de la Coagulasa:a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.b) Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar.c) Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).
  54. 54. 54d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.e) Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva. Sise ve siempre homogéneo, la reacción es negativa.f) Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.c. Test de CAMP para StreptococcusPermite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona dehemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que sedenomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)Procedimiento Test de CAMP:a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de uncultivo de Staphylococcus aureus.b) Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica.c) Incubar a 37ºC por 24 horas.d. Identificación de Streptococcus β hemolítico por aglutinación con látex:Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus β hemolítico grupo A, B,C, D, F y G.Procedimiento prueba de aglutinación con látex:a) Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta deaglutinación.b) Tome dos a tres colonias β hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que debenpertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas gram (+) en cadenas.
  55. 55. 55c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante 1MINUTO4. Realice el Test de difusión por disco. Sensidiscos.a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo desuero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.b) Tome la tórula estéril y (sin flamearla!!!!) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee laboca del tubo y cierre.c) Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton (Staphylococcus) o agarMüller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente apropiado.d) Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos(5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no quedendemasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí.e) Incubar a 37ºC por 24 horas.RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificadoen su muestre clínica.Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa dela placa antes de sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelossuavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!).Lectura e interpretación del Test de Sensidiscosa) Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria es“susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar.Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.b) Anote sus observaciones.5. Procesamiento de una muestra clínica de catéter venoso con técnica de Makia) En una placa de Agar Sangre, siembre con técnica de Maki la muestra de catéter venosoentregada.Utilice pinza estéril e incube a 37ºC por 24 hrs.b) Describa macroscópicamente las colonias obtenidas.c) Observe si se trata de un cultivo puro. Realice recuento de colonias bacterianas.

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