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Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales del
daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno a través de
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Introducción
Vitiligo  enfermedad adquirida caracterizada por Ø progresiva de melanocitos.
Etiología y patogénesis
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Introducción
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sustratos sustitutos de la tirosinasa AutoAg
Nuevo Ag Autoinmunidad del melanoc...
Investigar si Bilobalide protege a los
melanocitos humanos normales
contra el daño oxidativo inducido
por H2O2 y explorar ...
Métodos
Aislamiento y cultivo de melanocitos
•Se incubaron durante la noche
•Bilobalide se preparó como una Sol de
reserva...
Métodos
Viabilidad
celular
se incubaron las células con
diversas concentraciones de
bilobalide (0-800µmol /L)
72 horas Cit...
Métodos
Ensayo de liberación de
lactato deshidrogenasa
evaluar integridad de la MC
basada en la cantidad de LDH
citoplásmi...
Métodos
• Extraído de los melanocitos
• Mide niveles de expresión de la
CAT y GPx1
• β-actina como control interno
para la...
Resultados
Bilobalide ejerce un efecto protector contra la citotoxicidad
inducida por H2O2 a los melanocitos
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Resultados
Bilobalide atenúa apoptosis inducida por H2O2 en los melanocitos
ensayo de anexina V-PI
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Resultados
Bilobalide atenúa la elevación de ROS intracelular inducido por H2O2 mediante la
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Discusión
Bilobalide protege a los melanocitos contra la apoptosis inducida por H2O2 y la
liberación de Hsp70.
CAT
GPx1
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Conclusión
Bilobalide puede mejorar el estrés RE y
apoptosis en los melanocitos humanos
inducida por H2O2
Mediante la prom...
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Ficha de maría gabriela gonzález

  1. 1. Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno a través de la promoción de la expresión de la oxidasa y la inhibición del estrés del retículo endoplásmico
  2. 2. Introducción Vitiligo  enfermedad adquirida caracterizada por Ø progresiva de melanocitos. Etiología y patogénesis Estrés oxidativo Autodestrucción de melanocitos Factores genéticos Inicio y progresión de la enfermedad Desequilibrio REDOX Peróxido de hidrógeno (H2O2)  se acumula en la epidermis y el estrés oxidativo que induce: Ø del péptido pro-opiomelanocortina Regulación de la señalización colinérgica Apoptosis directamente en los melanocitos • Estrés en el RE • Promotor de apoptosis en células del epitelio pigmentario de la retina y células HeLa Autoinmunidad
  3. 3. Introducción niveles de H2O2  recambio de sustratos sustitutos de la tirosinasa AutoAg Nuevo Ag Autoinmunidad del melanocito Fenoles inductores de vitiligo células dendríticas producción de IL-6 y IL-8 El extracto de ginkgo biloba Antioxidante Detiene la aparición y progresión de vitiligo Neuroprotector uno de los principales componentes nonflavone. Trilactone sesquiterpeno con PM 326,3Da Bilobalide Propiedad de secuestrar radicales libres Liberación de Hsp 70 de los melanocitos
  4. 4. Investigar si Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales contra el daño oxidativo inducido por H2O2 y explorar los mecanismos moleculares subyacentes implicados en esta respuesta. Objetivo
  5. 5. Métodos Aislamiento y cultivo de melanocitos •Se incubaron durante la noche •Bilobalide se preparó como una Sol de reserva a 100 mmol/L en DMSO •DMSO sin bilobalide se utilizó para las muestras de control negativo •H2O2 preparado a partir de una Sol madre de 30% antes de c/experimento 20ng/ml de bFGF 20µg/ml de IBMX 10ng/ml de TC Suero bovino fetal al 10%
  6. 6. Métodos Viabilidad celular se incubaron las células con diversas concentraciones de bilobalide (0-800µmol /L) 72 horas Citotoxicidad ¿Bilobalide protege a los melanocitos del daño celular inducido por H2O2? pretratados con bilobalide (0-400µmol/L) 1 hora se exponen a 1mmol/L de H2O2 durante 16h solución de MTS a cada pocillo de cultivo y se incubó durante 1h a 37°C. La absorbancia se midió a 490nm con un espectrofotómetro de microplacas y la morfología de las células examinadas bajo un microscopio de luz invertida
  7. 7. Métodos Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa evaluar integridad de la MC basada en la cantidad de LDH citoplásmica liberada en el medio El sobrenadante de cada pocillo de la placa se transfirió al correspondiente pocillo de una placa de ensayo enzimático de 9-6 pocillos y se incubaron con la mezcla de sustrato reconstituida durante 30 min Tinción de Anexina V- yoduro de propidio Detectó apoptosis de melanocitos utilizando un kit comercial Citómetro de flujo (20.000 eventos) La medición de liberación de Hsp 70 Se controló usando un kit de inmunoensayo enzimático comercial (EIA). Medición de ROS intracelulares Citometría de flujo
  8. 8. Métodos • Extraído de los melanocitos • Mide niveles de expresión de la CAT y GPx1 • β-actina como control interno para la normalización Aislamiento de ARN y el análisis de PCR-TR en tiempo real •Postto cel se lavaron una vez con PBS y se lisaron mediante la adición de tampón •La membrana se incubó con Ac 1° contra CHOP, p-eIF2a, eIF2a y β- actina y con Ac 2° fluorescente marcado con colorante Inmunotransferencia
  9. 9. Resultados Bilobalide ejerce un efecto protector contra la citotoxicidad inducida por H2O2 a los melanocitos (a) (b) (d) (e) Análisis estadístico Prueba de Kolmogorov-Smirnov  ANOVA  Prueba Dunnett post hoc usando SPSS 17.0 Comparación de grupos múltiples. Cada experimento se realizó por triplicado y repetido 3 veces Viabilidad celular Pre- tto x 24h 3,5 veces
  10. 10. Resultados Bilobalide atenúa apoptosis inducida por H2O2 en los melanocitos ensayo de anexina V-PI Bilobalide inhibe la secreción de Hsp 70 inducido por H2O2 en los melanocitos ELISA 12% 62% 36% 25% 2,5 veces
  11. 11. Resultados Bilobalide atenúa la elevación de ROS intracelular inducido por H2O2 mediante la promoción de la expresión de la catalasa y la glutation peroxidasa-1 (b)(a) PCR-TR cuantitativa en tiempo real 2 veces 3 veces 1,2 v 2,7 v
  12. 12. Discusión Bilobalide protege a los melanocitos contra la apoptosis inducida por H2O2 y la liberación de Hsp70. CAT GPx1 Ø H2O2 Co-cultivo de bilobalide + H2O2 fue incapaz de aliviar la citotoxicidad en los melanocitos Reducen daño oxidativoExpresión de 2 antioxidantes  Hsp Desencadena respuesta autoinmune  presentación de Ag previamente oculto Refuerza respuesta inmune mediante + CD ≠ concentraciones de H2O2  liberación Hsp70 de los melanocitos Ø tolerancia de cel T hacia Ag propios y mejora reacción citotóxica de infiltración de LyT Prevención de la potencial respuesta autoinmune Inhibición de Ø directa de melanocitos
  13. 13. Conclusión Bilobalide puede mejorar el estrés RE y apoptosis en los melanocitos humanos inducida por H2O2 Mediante la promoción de la CAT y la síntesis GPx1 Mediante el bloqueo de la inducción CHOP relacionada con la apoptosis Posiblemente a través de la modulación de la señalización de la UPR.

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