Tema 12

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Tema 12

  1. 1. Tema 12: ADN Recombinante Nociones de ADN Recombinante El campo de la genética cambió radicalmente en la década del `70 cuando los investigadores desarrollaron procedimientos que permiten construir moléculas de ADN recombinante y la clonación de las mismas (hacer muchas copias de estas). La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible la investigación de la estructura y función de los genes, especialmente los eucarióticos que eran hasta el momento inaccesibles. El clonamiento genera grandes cantidades de ADN puro, tales como genes, los cuales pueden ser manipulados en varias maneras, incluyendo mapeo, secuenciación, mutación y transformación celular. Por ejemplo: supongamos que queremos estudiar el gen que codifica una proteína humana particular, para determinar su secuencia de ADN y cómo su expresión esta regulada. Cada célula humana contiene solamente dos copias de aquel gen, por lo tanto se requiere de un esfuerzo enorme para lograr aislar suficientes copias del gen para el análisis. Por el contrario, un número esencialmente ilimitado de copias puede ser producido por clonación. La tecnología del ADN recombinante es un conjunto de técnicas moleculares usadas para localizar, aislar, alterar y estudiar segmentos de ADN. El uso de la tecnología del ADN Recombinante para manipular genes para el análisis genético o para desarrollar productos u otras aplicaciones es llamado Ingeniería Genética. Técnicas Básicas del ADN recombinante 1. Métodos de obtención de fragmentos específicos de ADN que permitan el análisis, aislamiento y manipulación de genes específicos. 2. Obtención de copias múltiples de fragmentos idénticos de ADN, como clonación y PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). 3. Localización e Identificación de fragmentos específicos de ADN o ARN, por hibridación de Ácidos Nucleicos, esto permite por ejemplo estimar semejanzas entre el origen de distintos organismos. 4. Secuenciación del ADN, lo que hace posible la lectura directa de la información genética codificada. 5. Ingeniería Genética: mediante la cual se puede modificar una secuencia de ADN para generar nuevas versiones de genes, que pueden ser introducidas en una célula u organismo. Para aislar un gen o porciones más pequeñas de ADN, la molécula de ADN debe ser fragmentada. La ruptura puede ser mecánica (entonces la fragmentación es al azar), o bien para obtener fragmentos específicos de ADN se utilizan otros métodos, dentro de los cuales una herramienta importante son las enzimas de restricción sintetizadas por ciertas bacterias. Otra herramienta utilizada, aislada de ciertos virus de ARN, es la Transcriptasa Inversa. Clonación de ADN Para clonar ADN se deben seguir los siguientes pasos: 1. Aislamiento del ADN de un organismo.
  2. 2. 2. Cortar el ADN en fragmentos con Enzimas de Restricción y unir cada fragmento individual a un vector de clonación para obtener una molécula de ADN recombinante. Un Vector de Clonación es una molécula de ADN construida artificialmente, capaz de replicarse en un organismo hospedante, como por ejemplo una bacteria o levadura. 3. Introducir (transformar) la molécula de ADN recombinante dentro de un hospedador como Escherichia coli, levadura, una célula animal o vegetal. La replicación del ADN Recombinante (clonación molecular) ocurre en la célula del hospedante, produciendo muchas copias idénticas llamadas clones. Como el organismo hospedante se reproduce, las moléculas de ADN Recombinante pasan a toda la progenie, dando origen a una población celular portando la secuencia clonada. Enzimas de Restricción Las Enzimas de Restricción fueron descubiertas en la década del `70 en varias especies bacterianas incluyendo a E. coli. En estudios sobre bacteriófagos se encontró que los virus que infectaban a una cepa de E. coli eran a veces incapaces de infectar a otra cepa (ver Tema 11: Lisogenia). Esta restricción de la infección ocurre por la presencia en ciertas especies bacterianas de enzimas de restricción que cortan el ADN extraño (viral) antes de que pueda ser replicado o transcripto, es decir, protegen su ADN del ADN extraño. La característica esencial de estas enzimas es que escinden el ADN solamente en secuencias de nucleótidos específicas, conocidas como Secuencias de Reconocimiento o Sitios de Restricción. Sin embargo estas enzimas cortan el ADN a menos que este esté modificado por adición de un grupo metilo (CH3) a un residuo de Adenina o Citosina en determinadas secuencias, de esta manera las bacterias protegen su ADN mediante la adición de estos grupos metilo durante la replicación del ADN. Una Enzima de Restricción o Endonucleasa de Restricción reconoce una secuencia de pares de bases específica en el ADN, llamada Sitio de Restricción, y corta el ADN dentro de la secuencia (lo que hace es hidrolizar los enlaces fosfodiéster de la molécula de ADN). Todas las Enzimas de Restricción cortan el ADN entre el Carbono 3´ y la mitad del Fósforo del enlace fosfodiéster, de tal manera que los fragmentos producidos por la digestión con enzima de restricción tienen fosfato 5´ e hidroxilo 3´. Las enzimas de restricción se usan para producir fragmentos de ADN para ser clonados; como así también para analizar el posicionamiento de sitios de restricción en una pieza de ADN clonado o en un segmento de ADN en el genoma. Muchas enzimas de restricción son encontradas en bacterias, aunque también ha sido encontrada una enzima de restricción en el alga verde Chlorella. Más de 400 enzimas diferentes han sido aisladas, las mismas se nombran de acuerdo al organismo a partir del cual fueron aisladas. Convencionalmente se utiliza un sistema de tres letras, las mismas deben escribirse con letras itálicas o bien subrayadas, seguido por números romanos. Algunas veces se adicionan letras para significar una cepa particular de bacteria a partir de la cual fue obtenida la enzima. Por ejemplo: EcoRI: obtenida a partir de Escherichia coli cepa RY13, esta enzima corta el ADN solamente en la secuencia GAATTC. Las células además de esta enzima, sintetizan una enzima metiladora específica que añade el grupo metilo para proteger su ADN. La enzima de restricción corta la cadena de ADN con algunos nucleótidos de diferencia, dejando extremos pegajosos, los cuales pueden volver
  3. 3. a aparearse entre sí al formarse puentes de Hidrógeno entre bases complementarias, la enzima ADN ligasa establece un nuevo enlace azúcar- fosfato entre los extremos de cada cadena (este fragmento de ADN originado por la enzima puede unirse con otro fragmento de ADN cortado por la misma enzima, y que tenga los extremos pegajosos complementarios). HindII: obtenida a partir de Haemophilus influenzae cepa Rd, esta enzima de restricción corta el ADN del Fago T7 en 40 fragmentos específicos. Reconoce la secuencia que va a cortar, la metilación para la protección ocurre justo en ese sitio de corte. Corta ambas cadenas en el mismo punto, generando extremos romos (poner dibujo). Ambas enzimas poseen una secuencia con simetría rotacional (180º). Muchos sitios de restricción tienen un eje de simetría a través del punto medio. Por ejemplo: Bam HI la secuencia de bases de 5` a 3` sobre una cadena de ADN es la misma secuencia de bases de 5` a 3` sobre la cadena de ADN complementaria. Entonces se dice que la secuencia tiene “doble simetría rotacional”: 5`...GGATCC... 3` 3`...CCTAGG... 5` Corte Corte 5`...G 3`...CCTAG5` Extremos Pegagosos 5` 5`GATCC... 3` G... 5` Las enzimas de restricción más comúnmente usadas reconocen 4 pb (Hha I) o 6 pb (Eco RI o Hind III), incluso algunas hasta 8 pb (Not I). Otras enzimas de restricción no poseen un sitio de restricción simétrico en el centro. Por ejemplo Hinf I reconoce una secuencia de 5 pb en el cual hay simetría en los dos pares de bases a un lado del centro, pero el par de base central es asimétrico dentro de la secuencia. Las enzimas de restricción cortan el ADN de diferentes formas. Algunas enzimas como por ejemplo SmaI corta ambas cadenas de ADN entre las mismas dos pares de bases para producir fragmentos de ADN con extremos romos. Otras enzimas como BamHI hacen cortes sesgados en la secuencia del par de nucleótidos para producir fragmentos de ADN con extremos pegajosos, tanto extremos sobrexpuestos 5`como BamHI o EcoRI o con extremos 3`sobrexpuestos como PstI. Las enzimas de restricción que producen extremos pegajosos son de particular valor en clonación de ADN porque cada fragmento de ADN, generado al cortar una pieza de ADN con la misma enzima de restricción, tiene la misma secuencia de bases en los dos extremos sesgados. Como cada enzima de restricción corta el ADN en una secuencia específica, el número de cortes que la enzima realiza en una molécula de ADN particular depende del número de veces que el sitio de restricción aparece. Cuando cortamos un número de copias del mismo genoma con una enzima de restricción particular, el ADN es cortado en los sitios de restricción específicos de la enzima, los cuales están distribuidos a través del genoma. Aunque esto produce millones de fragmentos de diferentes tamaños, todos los ADNs cromosomales idénticos en el genoma múltiple cortarán en secuencia de reconocimiento idénticas.
  4. 4. Actuación de las Enzimas de Restricción T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA C C CT T T T T T TA A A A GG GGGG A T G Nucleótido de Adenina Nucleótido de Timina Nucleótido de Guanina Nucleótido de CitosinaC T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA C C CT T T T T T TA A A A GG GGGG Enzima de Restricción Eco RI Corte de Restricción T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA C C CT T T T T T TA A A A GG GGGG Enzima de Restricción Eco RI T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA C C C T T T T T T T A A A A GG GGGG T AA G A A T T C C C C A A T G C CGA C C C T T T T T T T A A A A GG GGGG Extremos Cohesivos A A T T C C C C A A T G C CGA C CT T TA GG GGGG Enzima de Restricción Hae III A A T T C C C C A A T G C CGA C CT T TA GG GGGG Enzima de Restricción Hae III Corte de Restricción A A T T C C C C A A T G C CGA C CT T TA GG GGGG Enzima de Restricción Hae III Corte de Restricción A A T T C C C C A A T GGA C CT T TAGGGG C C GG Extremos Romos Extremo Cohesivo Extremo Romo AAA AAA TTT TTT CCC CCC CCC CCC AAA AAA TTT GGGGGGAAA CCC CCCTTT TTT TTTAAAGGGGGGGGGGGG Secuencia de Clonación Corte de Restricción Enzima de Restricción Eco RI Vectores de Clonación y Clonación de ADN Varios tipos de vectores son usados para clonar ADN. Estos difieren en sus propiedades moleculares y en el tamaño máximo de ADN que cada uno puede clonar. Cada tipo de vector ha sido específicamente construido en el laboratorio.  Plásmidos: son elementos extracromosomales de las bacterias, que se replican autónomamente dentro de la célula. Su ADN es circular y de doble cadena y porta las secuencias requeridas para la replicación del plásmido (origen u ori), y para las otras funciones del plásmido. Los vectores de clonación plasmídicos son derivados de estos plásmidos. Por medio de Ingeniería Genética se logró que tengan características útiles para clonación de ADN.
  5. 5. Citoplasma Cromosoma Plásmido Bacteria Un vector de clonación plasmídico de E. coli debe tener tres características: Un ori (replicación autónoma) Un marcador seleccionable dominante, el cual permite distinguir las células de E. coli que portan dicho plásmido de aquellas que carecen del mismo. Normalmente se trata de un gen de resistencia a antibióticos como por ejemplo: ampiciclina o tetraciclina. Un sitio de clonado único para la inserción de los fragmentos de ADN a ser clonados. La clonación involucra el corte del plásmido en uno de los sitios únicos con la enzima de restricción apropiada y la unión dentro aquel sitio de un fragmento de ADN que ha sido cortado con la misma enzima. Un ejemplo es el plásmido pUC19 que posee 2.686 pb y tiene las siguientes características que lo convierten en útil para clonar ADN en E. coli: 1. Tiene un alto número de copias, aproximadamente 100 copias por célula, entonces muchas copias de ADN pueden ser generadas rápidamente. 2. Tiene un marcador seleccionable de resistencia a Ampicilina. 3. Tiene un número de sitios de restricción único agrupados en una región llamado sitio de clonación múltiple o Polilinker. 4. El Polilinker esta insertado dentro de parte del gen de la β-galactosidasa de E. coli. La inserción fue construida por Ingeniería Genética de tal manera que la β-galactosidasa es producida cuando pUC19 es introducido dentro de una cepa mutante de E. coli lacZ- que hace no funcional a la β-galactosidasa. Entonces cuando una pieza de ADN es clonado dentro del Polilinker, el marco de lectura de la β-galactosidasa es interrumpido, con lo cual E. coli no puede producir β-galactosidasa. El X-gal es incluido en el medio sobre el cual las bacterias fueron plaqueadas, de tal manera que si la β-galactosidasa es producida por una colonia, las colonias se tornarán azul, mientras que si no se produce β- galactosidasa, las colonias serán blancas. Este simple test de selección azul-blanco es usado para identificar colonias de E. coli conteniendo pUC19 con ADN insertado debido a que ellas son blancas, en contraste con las colonias azules que no contienen el inserto. Los experimentos de clonación no siempre involucran cortar el vector y el ADN a ser clonado con una sola enzima de restricción. En muchos casos se usan dos enzimas de restricción, esto es para evitar la recircularización, debido a que los dos extremos del ADN son incompatibles y no pueden ser unidos por la ADN ligasa. Los vectores plasmídicos pueden aceptar fragmentos de 5 a 10 kb. Fragmentos mayores transforman en inestables a los plásmidos y tienden a perder muchos de los fragmentos clonados.
  6. 6.  Vectores Virales: los vectores virales son aquellos virus que permiten incorporar genes de interés dentro de su genoma, ofreciendo muchas ventajas para clonación y la posterior aplicación de los genes clonados. Como los virus infectan a las células con una alta eficiencia, el gen clonado puede ser introducido dentro de una célula a una frecuencia altamente significante que por simple transformación. Algunos vectores virales son especialistas en producir altos niveles de proteínas codificadas por los genes clonados. Otros vectores virales, tales como los basados en M13, bacteriano, son diseñados para facilitar el secuenciamiento y la generación de mutaciones en genes clonados. Los vectores derivados de Retrovirus (virus animal de ARN de simple cadena que emplea un ADN de doble cadena como intermediario para la replicación) puede efectuar la integración estable de ADN clonado dentro de cromosomas de mamíferos, permitiendo la continua expresión del gen. Los vectores virales también son vehículos de elección para estrategias de Terapia Génica.  Fago Lambda (λ) es derivado del bacteriófago λ, que ha sido diseñado de tal manera que el ciclo lítico sea posible pero el lisogénico no. Los vectores de clonación λ linear poseen sitios de restricción útiles para clonar fragmentos de ADN dentro de ellos. Uno de esos vectores, el vector de reemplazo lambda tiene un cromosoma en el cual hay un brazo izquierdo y otro derecho que conjuntamente tienen todos los genes esenciales para el ciclo lítico. Entre los dos brazos hay un segmento de ADN que es “disponible” debido a que no contiene ningún gen necesario para el ciclo lítico. Las uniones entre el segmento central disponible y los dos brazos poseen un sitio de restricción EcoRI. La clonación de un segmento de ADN usando un vector de reemplazo λ se realiza de la siguiente manera: primero el vector es cortado con la enzima EcoRI para separar los dos brazos del segmento reemplazable. Luego, fragmentos de ADN a ser clonados son generados al digerir ADN de alto peso molecular de un organismo con EcoRI. El ADN foráneo es mezclado con los fragmentos de ADN de λ y las piezas son ligadas mediante una ADN ligasa. El ADN ligado es mezclado in-vitro con las diferentes proteínas del fago λ, resultando en la inserción del ADN dentro de la cabeza del fago y el ensamblaje de partículas complejas. Este proceso es llamado Empaquetamiento. La cabeza del fago puede acomodar fragmentos de ADN del orden de los 37 52 kb. Las partículas ensambladas son usadas para infectar cultivos de E. coli. Solamente los fagos en los cuales el ADN foráneo esta insertado entre el brazo izquierdo y el derecho podrán replicarse porque solamente ellos contienen todos los genes necesarios para la reproducción del fago. La clonación del fragmento de interés se produce por las rondas repetidas de infección y lisis que cada fago funcional sufre en el cultivo. El cultivo se convierte en transparente cuando todas las bacterias han sido lisadas, alcanzando una concentración de 1010 a 1011 fagos/mL, con muchos representativos de cada una de las moléculas de ADN recombinante original. Al igual que los vectores plasmídicos, hay diferentes tipos de vectores de clonación fágico. Las versiones más modernas tienen un gran número de sitios de restricción para clonación. Algunos son diseñados para permitir la expresión de genes clonados (vectores de expresión) y un desarrollo reciente permitió transferir el inserto de ADN desde el fago a un plásmido, un proceso llamado subclonación.
  7. 7. Algunos fagos contienen moléculas de ADN de cadena simple, al infectar a una bacteria, la cadena infectante simple es convertida en una forma replicativa de doble cadena, con lo cual puede ser aislada y usada para clonación. La ventaja de usar estos fagos como vectores de clonación es que el ADN de cadena simple es el substrato requerido para la técnica de secuenciación de ADN de Sanger, ampliamente utilizada en la actualidad.  Cósmido: estos vectores son híbridos de fagos λ y plásmidos, y su ADN puede replicarse tanto en bacterias, como un plásmido, o bien ser empaquetado como un fago. Sin embargo, los cósmidos pueden portar insertos de ADN tres veces más grandes a los portados por el propio fago λ (45 kb). Un cósmido esta compuesto por una secuencia ori que permite su replicación en E. coli, un marcador seleccionable dominante tal como ampR y sitios de restricción únicos para la inserción y clonación de fragmentos de ADN. Además los cósmidos tienen un sitio cos que es derivado del fago λ. El sitio cos es el sitio en el cual copias múltiples del genoma λ, reunidas en una pieza larga llamada Concatámero, son reunidas dentro de una pieza de 48 kb para ser introducida dentro de la cabeza del fago. El sitio cos permite el empaquetamiento del ADN dentro de una partícula de fago λ que facilita la introducción de grandes moléculas de ADN dentro de una bacteria. Esta propiedad esta ausente en los plásmidos. Cósmido Sitio cos Amp R Sitio Clonación Ori Esquema de un Cósmido mostrando los sitios mencionadas en el texto. Sitios cos lambda han sido clonados dentro de vectores plasmídicos para producir cósmidos tan pequeños como de 5 kb. Cuando un fragmento de ADN de alrededor de 32 a 47 kb es clonado dentro de tales cósmidos, la molécula de ADN recombinante es del tamaño correcto para ser empaquetada dentro de la cabeza del fago. El fago es entonces usado para introducir el cósmido recombinante dentro de la célula de E. coli hospedante, donde éste se replica como lo hace un plásmido. Cósmidos recombinantes pequeños (<37 kb) o grandes (>52 kb) no pueden ser empaquetados. Esto es una desventaja cuando se quiere usar a estos como vectores. Existen vectores que pueden ser introducidos dentro de dos o más organismos hospedantes. Se denominan Vector Tansbordador (Shuttle vector). Por ejemplo: hay vectores transbordadores que pueden ser transformados dentro y replicado en E. coli (seleccionado por tener un marcador nutricional, tal como el gen URA 3 que confiere crecimiento independiente de Uracilo sobre una célula de levadura mutante ura3). Diferentes tipos de vectores transbordadores levadura-E. coli han sido desarrollados, algunos de los cuales replican y otros no. Estos últimos vectores se
  8. 8. integran dentro del cromosoma de las células hospedante y son replicados cuando aquel cromosoma replica.  Cromosomas Artificiales de Levadura (YACs) Son vectores de clonación que permiten que cromosomas artificiales sean fabricados y clonados en levaduras. Los YACs son vectores lineales que tienen la siguiente característica: TEL TRP 1 ARS CEN Sitio de Restricción para clonación URA 3 TEL Brazo Izquierdo Brazo Derecho 1. Un Telómero de levadura (TEL) en cada extremo. 2. Un Centrómero de levadura (CEN). 3. Un marcador seleccionable sobre cada brazo para detectar el plásmido en levadura (ejemplo: TRP 1 y URA 3 para independencia de Triptófano y Uracilo en razas mutantes trp 1 y ura 3 respectivamente). 4. Un origen de replicación ARS (secuencia replicante autónoma) que permite que el vector se replique en la levadura. 5. Sitios de restricción únicos a el YAC, que pueden ser usados para insertar ADN foráneo. Los YACs pueden usarse para clonar grandes fragmentos de ADN de hasta 500 kb. Se usan para crear mapas físicos de genomas grandes como el humano. Los clones YAC son construidos por ligamiento de fragmentos de ADN de muy alto peso molecular a los brazos del YAC generados por digestión con enzimas de restricción en el sitio de clonación. Los clones son introducidos dentro de la levadura por transformación, por selección para ambos TRP 1 y URA 3, asegurándose que el clon tenga tanto el brazo izquierdo como el derecho del vector YAC.  Cromosomas Artificiales de Bacteria (BACs) Estos son útiles para clonar fragmentos de hasta 200 kb en E. coli. Los BACs son vectores que contienen un origen de replicación de un plásmido natural llamado el “Factor F”, un sitio de clonación múltiple, y un marcador seleccionable y otras características. Aunque los YACs pueden admitir fragmentos más largos que los BACs, estos últimos tienen la ventaja que pueden ser manipulados como plásmidos bacterianos normales. Una vez transformada E. coli, el Factor F mantiene el número de copias del plásmido en uno por célula. Biblioteca de ADN Recombinante En general los investigadores quieren estudiar un gen particular o fragmento de ADN. Cuando el ADN genómico es aislado del organismo y cortado con enzimas de restricción, y la población de fragmentos de ADN es clonado en un vector, se
  9. 9. obtiene una Biblioteca Genómica, una colección de clones conteniendo por lo menos una copia de cada una de las secuencias de ADN en el genoma. Las bibliotecas genómicas han sido construidas para muchos organismos, incluyendo los humanos a través del Proyecto Genoma Humano y muchos virus. Relacionado con las bibliotecas genómicas, están las Bibliotecas Cromosómicas, estas son colecciones de clones de fragmentos de ADN complementario (cDNA), las cuales son colecciones de clones de ADN copias de mARNs aislados de células. Bibliotecas Genómicas Una biblioteca genómica es una colección de clones que contiene por lo menos una copia de cada secuencia de ADN del genoma en estudio. Las bibliotecas genómicas pueden ser usadas para aislar y estudiar un clon particular relacionado con un gen de interés. Las bibliotecas genómicas son construidas usando los mismos procedimientos de clonación que ya han sido descriptos. Se utiliza una enzima de restricción para cortar el ADN genómico, se elige un vector que permita que el genoma este representado en un número manejable de clones. Hay tres procedimientos generales para producir bibliotecas genómicas: 1. El ADN genómico es digerido completamente con una enzima de restricción, y los fragmentos de ADN resultantes son clonados en vectores de clonación. Un inconveniente de esta técnica es que si el gen específico que queremos estudiar, contiene uno o más sitios de restricción para la enzima, el gen será dividido en dos o más fragmento, cuando el ADN sea digerido con la enzima de restricción. Como resultado el gen sería clonado en dos o más piezas. Otro inconveniente es que el tamaño promedio de los fragmentos producidos por digestión de ADN eucariótico con enzimas de restricción es pequeño (alrededor de 4 kb para enzimas de restricción de 6 pb). La mayoría de los genes tienen un tamaño de más de 4 kb, especialmente en los mamíferos. Por otro lado una biblioteca genómica entera debería contener un gran número de moléculas de ADN recombinante, y la selección de un gen específico sería muy laboriosa. 2. Los problemas de la división de genes en fragmentos y el gran número de moléculas de ADN recombinante, puede ser minimizado clonando fragmentos de ADN más grandes en un vector apropiado. Los fragmentos de ADN más grandes pueden ser generados al agitar mecánicamente ADN de alto peso molecular (usualmente 100 a 150 kb). Por ejemplo: el ADN puede ser pasado a través de una aguja de jeringa para producir una población de fragmentos de ADN superpuestos de gran tamaño. Sin embargo, debido a que los extremos de los fragmentos resultantes no han sido generados por enzimas de restricción, es necesario la manipulación enzimática adicional para agregar extremos apropiados para su inserción en los vectores. 3. Otro método para generar fragmentos de ADN de tamaño apropiado es realizando una digestión parcial del ADN con enzimas de restricción, que reconocen frecuentemente 4 pb. La digestión parcial significa que solamente una porción de los sitios de restricción disponibles son cortados por la enzima de restricción. Esto se logra limitando la cantidad de enzima o el tiempo de incubación. El resultado ideal de la digestión parcial es una población de fragmentos superpuestos que representen el genoma entero. La centrifugación en gradiente de sacarosa o electroforesis en gel de agarosa son utilizadas para colectar fragmentos del tamaño deseado para clonación.
  10. 10. Estos fragmentos pueden ser clonados directamente porque los extremos de los fragmentos fueron producidos por la digestión con enzimas de restricción. El número de clones necesarios para incluir todas las secuencias del genoma, depende del tamaño del genoma a ser clonado, y del tamaño promedio de los fragmentos de ADN insertados en el vector. La probabilidad de tener por lo menos una copia de cualquier secuencia de ADN en la biblioteca genómica, puede ser calculada por la fórmula: N = ln (1-P) ln (1-f ) N = número necesario de moléculas de ADN recombinante P = probabilidad deseable f = es la proporción fraccionable del genoma en una molécula de ADN recombinante simple (f es el tamaño promedio en kb de los fragmentos usados para hacer la biblioteca dividido el tamaño del genoma en kb). ln = logaritmo natural Por ejemplo: para un 99% de probabilidad que un fragmento de ADN de levadura esté representado en una biblioteca de fragmento de 15 kb en una biblioteca genómica basada en un vector lambda, donde el tamaño del genoma de levadura es de alrededor de 12.000 kb, se necesitarían 3682 moléculas de ADN recombinante. Para el genoma humano de tamaño aproximado de 3.000.000 kb, se necesitarán más de 920.000 clones, por lo tanto en estos casos se utilizan vectores YACs o BACs. Bibliotecas de cADN El ADN complementario puede ser fabricado a partir de moléculas de mARN presentes en una población de células eucariota en un momento particular. Estas moléculas de mARN pueden ser clonadas para producir una biblioteca de cADN. La biblioteca de cADN refleja la actividad génica del tipo celular en el momento que el mARN es aislado. La construcción y análisis de las bibliotecas de cADN son útiles por ejemplo para comparar actividades génicas en diferentes tipos celulares del mismo organismo, o del mismo tipo celular en diferentes momentos, como en la diferenciación celular durante el desarrollo. Los clones en la biblioteca de cADN representan a los mARNs maduros encontrados en la célula. En los organismos eucariontes los mARNs maduros son moléculas procesadas, por lo que las secuencias obtenidas no son equivalentes a los genes clonados. En particular los Intrones están presentes en los clones génicos, pero no en los clones de cADN. Para cualquier mARN los clones de cADN pueden ser útiles para luego aislar el gen que codifica aquel mARN. El clon génico puede suministrar más información que el cADN, por ejemplo: por la presencia y el ordenamiento de Intrones, y sobre la secuencia reguladora que controla la expresión del gen. Las bibliotecas de cADN son fácilmente construidas a partir de mARNs, debido a que los mARN contienen una cola poly A que los diferencia del resto de los ARNs. Estos mARNs poly A+ pueden ser purificados de una mezcla de ARNs celular, al pasar las moléculas de ARN por una columna en la cual cortas cadenas de Ácido
  11. 11. Deoxitimidílico, llamado cadena oligo (dT), han sido adheridos. Cuando las moléculas de ARN pasan a través de la columna, las colas poly A de las moléculas de mARN se aparean con la cadena poly dT, por lo tanto los mARNs son capturados sobre la columna, mientras que los otros ARNs pasan a través de la misma. Los mARNs son liberados y colectados. Por ejemplo: disminuyendo la fuerza iónica del buffer que pasa a través de la columna, de tal manera que los enlaces hidrógeno se interrumpan. Este método permite un enriquecimiento significativo de mARNs poly A+ en una población mezcla de ARN de alrededor del 50% sobre el 3% en la célula. Para sintetizar cADN el primer paso consiste en el pegado de un primer corto denominado Oligo (dT) a la cola poly A. El primer se extiende por medio de la enzima Transcriptasa inversa (polimerasa de ADN dependiente de ARN) para hacer una copia de ADN de la cadena de mARN. El resultado es una molécula de doble cadena de mARN-ADN. Luego las enzimas RNasa H (un tipo de ribonucleasa), ADN polimerasa I y ADN ligasa son usadas para sintetizar la segunda cadena de ADN. La RNasa H degrada la cadena de ARN en el híbrido mARN-ADN, la ADN polimerasa I fabrica nuevos fragmentos de ADN usando los fragmentos de ARN parcialmente degradados como primers, y finalmente la ADN ligasa une los nuevos fragmentos de ADN para hacer una cadena completa. El resultado es una molécula de cADN de doble cadena que es una copia fiel del mARN del que proviene. Para clonar las moléculas de cADN usando un ligador (linker), al sitio de restricción, el cual es una fragmento de ADN corto de doble cadena compuesto de 8 a 12 pares de nucleótidos de longitud que incluye un sitio de restricción en el ejemplo Bam HI. Tanto la molécula de cADN como el linker tienen extremos romos y ellos pueden ser ligados juntos a una alta concentración de T4ADN ligasa. Los extremos pegajosos son producidos en la molécula de cADN al cortar el cADN con Bam HI. El ADN resultante es insertado dentro de un vector de clonación que ha sido cortado con BamHI y la molécula de ADN recombinante se utiliza para transformar células de E. coli para la clonación. Un problema que se presenta al usar Linkers para clonar cADN, es que puede haber un sitio de restricción dentro del cADN para la enzima usada para cortar los linkers, con lo cual significaría que el cADN debería también ser cortado cuando se cortan los linkers, resultando la división del cADN en fragmentos. Este problema se puede resolver agregando un Adaptador al cADN, que ya tiene un extremo pegajoso adecuado para clonación, de tal manera que el cADN nunca será digerido con la enzima de restricción.

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