Enzimología

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Aspectos básicos de enzimología

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Enzimología

  1. 1. Dra. Evelin Rojas Villarroel
  2. 3. <ul><li>Biocatalizadores de naturaleza proteica. </li></ul><ul><li>Catalizadores orgánicos (Sustrato  Producto). </li></ul><ul><li>Potentes y eficaces </li></ul><ul><li>Aceleran la velocidad de reacción. </li></ul><ul><li>No se consumen. </li></ul><ul><li>Específicas: catalizan reacciones específicas. </li></ul><ul><li>Distintos grados de especificidad: </li></ul><ul><li>Ej. Sacarasa es específica:  sacarosa (sustrato natural) maltosa e isomaltosa </li></ul><ul><li>Máxima eficacia sobre el sustrato natural </li></ul>
  3. 4. <ul><li>Sitio activo comprende: </li></ul><ul><li>Sitio de unión: aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato. </li></ul><ul><li>Sitio catalítico: aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción. </li></ul>
  4. 5. E +S E - S E +P Sustrato: compuesto sobre el que actúa la enzima SITIO ACTIVO: región particular de la enzima donde se une el sustrato <ul><ul><ul><ul><ul><li>Formación de productos: enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción </li></ul></ul></ul></ul></ul>
  5. 6. Según su acción catalítica específica: 6 grupos o clases: OXIDOREDUCTASAS TRANSFERASAS HIDROLASAS LIASAS ISOMERASAS LIGASAS
  6. 7. . <ul><li>Catalizan reacciones de oxidorreducción: </li></ul><ul><li>Transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro. </li></ul><ul><li>Ejemplo: dehidrogenasas </li></ul>
  7. 8. Catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro. Reacción: Ejemplo: glucoquinasa A-B + C A + C-B glucosa + ATP ADP + glucosa-6-fosfato
  8. 9. Catalizan las reacciones de hidrólisis: Ruptura de enlaces en presencia de agua A-B + H 2 O AH + B-OH   H 2 O
  9. 10. Catalizan reacciones de ruptura y/o formación de enlaces covalentes en un sustrato. NH2 A-B A + B
  10. 11. Catalizan la ínterconversión de isómeros: Ej: Fosfotriosa isomerasa Fosfoglucosa isomerasa A B
  11. 12. A + B + XTP A-B + XDP + P i   Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.): Ej: Piruvato carboxilasa: piruvato + CO 2 + ATP oxaloacetato + ADP + P i
  12. 13. <ul><li>Sustrato: interactúa con enzima (energía y orientación adecuada). </li></ul><ul><li>Forma complejo enzima-sustrato ( sitio activo) </li></ul><ul><li>Enzima: modifica las propiedades químicas del sustrato unido . </li></ul><ul><li>Se debilitan los enlaces existentes y se facilita la formación de otros </li></ul>CINÉTICA ENZIMÁTICA http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e
  13. 14. UNIÓN ENZIMA-SUSTRATO. MODELOS Forma en que el sustrato se une al sitio activo de la enzima: Llave-cerradura Estructuras del sustrato y sitio activo de la enzima: Complementarias y rígidas http://enzimass.blogspot.com/2011/06/mecanismos-de-accion-enzimatica.html
  14. 15. Ajuste inducido Sitio activo de la enzima sufre cambio conformacional: En presencia del sustrato UNIÓN ENZIMA-SUSTRATO http://bioquimicafariusblackwolf.blogspot.com/2009/05/bases-de-la-accion-enzimatica-energia.html
  15. 16. <ul><li>Al inicio, la reacción requiere un aporte de energía. </li></ul><ul><li>Energía inicial: energía de activación (Ea). </li></ul><ul><li>Cuanto menor es la Ea más fácilmente transcurre la reacción. </li></ul><ul><li>Los productos finales tienen menos energía libre de Gibbs ( Δ G) que los reactantes. </li></ul><ul><li>En las reacciones espontáneas se libera energía de Gibbs ( Δ G<0). </li></ul>
  16. 17. <ul><li>Acción de los catalizadores: Disminuir la E a . </li></ul><ul><li>Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces: ya que disminuyen la E a aún más que los catalizadores inorgánicos. </li></ul><ul><li>Ej: </li></ul><ul><li>H 2 O 2 H 2 O + O 2 </li></ul><ul><li>Sin catalizador: 18 Kcal/mol </li></ul><ul><li>Catalizador inorgánico (platino): 12 Kcal/mol (20.000 veces) </li></ul><ul><li>Enzima específica (catalasa): 6 Kcal/mol (370.000 veces). </li></ul>
  17. 18. MODO DE ACCIÓN Perfil energético de una reacción espontánea Perfil energético de una reacción catalizada por enzimas
  18. 19. <ul><li>Velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. </li></ul><ul><li>Proporcionan información sobre: </li></ul><ul><li>Mecanismo de la reacción catalítica </li></ul><ul><li>Especificidad de la enzima. </li></ul><ul><li>La medida de la velocidad de una reacción: </li></ul><ul><li>Condiciones óptimas de pH </li></ul><ul><li>Temperatura, </li></ul><ul><li>Presencia de cofactores, etc </li></ul><ul><li>Concentraciones saturantes de sustrato. </li></ul><ul><li>En estas condiciones: la velocidad de reacción = velocidad máxima (Vmax). </li></ul><ul><li>La velocidad puede determinarse midiendo la desaparición de los sustratos o la aparición de los productos. </li></ul>
  19. 20. MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN <ul><li>Finales del siglo XIX. </li></ul><ul><li>En1882: concepto del complejo enzima-sustrato ( intermediario del proceso). </li></ul>Leonor Michaelis y Maud Menten (1913): Ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de las enzimas. Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapa: 1era etapa: se forma el complejo enzima-sustrato 2da etapa: el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto , liberando la enzima libre.
  20. 21.   ECUACIÓN DE DE MICHAELIS-MENTEN V1= k1  E   ES  V2= k2  ES  V3= k3  ES  Velocidad de formación y disociación del complejo E-S es CONSTANTE  = velocidad de la reacci ó n enzim á tica. Vmax= Velocidad máxima  S  = Concentraci ó n del sustrato. K M = Constante de Michaelis
  21. 22. REPRESENTACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN K M :Concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax Vmax: Valor máximo al que tiende la curva.
  22. 23. REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER-BURK <ul><li>Representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]: línea recta. </li></ul><ul><li>Pendiente es K M /V max </li></ul><ul><li>Origen de la abscisa es -1/K M </li></ul><ul><li>Origen de la ordenada es 1/V max </li></ul>
  23. 24. <ul><li>Proteínas  catalizadores. </li></ul><ul><li>Cambios en la conformación  asociados a cambios en la actividad. </li></ul><ul><li>Los factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima son: </li></ul><ul><li>Concentración de sustrato. </li></ul><ul><li>Concentración de enzima </li></ul><ul><li>Temperatura </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>Presencia/concentración de Inhibido r </li></ul>
  24. 25. <ul><li>Baja [S]: velocidad inicial directamente proporcional a la concentración de sustrato ( reacción de primer orden). </li></ul><ul><li>Alta [S]: enzima saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]. Se alcanza la velocidad es máxima (V max ). </li></ul>
  25. 26. <ul><li>Baja  E  : velocidad de la reacción directamente proporcional a la  E  . </li></ul><ul><li>Alta  E  : se alcanza Vmax, se agota el sustrato </li></ul>
  26. 27. Temperatura óptima : la actividad catalítica es máxima. Por encima de la temperatura óptima: pérdida de actividad catalítica debido a la desnaturalización. La actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse EFECTO DE LA TEMPERATURA
  27. 28. EFECTO DEL pH <ul><li>  Enzimas son sensibles a cambios de pH. </li></ul><ul><li>pH óptimo : </li></ul><ul><li>Conformación más adecuada de la enzima para la actividad catalítica: </li></ul><ul><li>Por encima o por debajo del pH óptimo: se afecta la actividad y pueden provocar la desnaturalización de la enzima. </li></ul>
  28. 29. Moléculas que inhiben acción catalítica de una enzima. Pueden ocupar temporalmente el sitio activo por semejanza estructural con el sustrato original ( inhibidor competitivo ). Alteran la conformación espacial de la enzima, impidiendo su unión al sustrato ( inhibidor no competitivo ). INHIBIDORES
  29. 30. Se alcanza la Vmax El K M se altera (aumenta) INHIBICIÓN COMPETITIVA Inhibidor estructuralmente similar a estructura del sustrato (isostérico). Competencia por el sitio activo
  30. 31. No se alcanza la Vmax El K M no se altera <ul><li>Inhibidor se une en sitio alostérico. </li></ul><ul><li>Provoca cambio conformacional del sitio activo </li></ul>INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
  31. 32. El inhibidor se une al complejo E-S Sitio alostérico: diferente al sitio activo INHIBICIÓN ACOMPETITIVA Vmax no se alcanza K M disminuye
  32. 33. <ul><li>CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y PRODUCTOS </li></ul><ul><li>CONCENTRACIÓN DE ENZIMA </li></ul><ul><li>TEMPERATURA </li></ul><ul><li>pH </li></ul><ul><li>PRESENCIA Y CONCENTRACIÓN DE INHIBIDORES </li></ul><ul><li>PRESENCIA DE COFACTORES </li></ul>
  33. 34. <ul><li>Sustancias no proteicas que potencian la actividad de la enzima. </li></ul><ul><li>Cofactores inorgánicos: iobnes Fe ++ , Mg ++ , Mn ++ , Zn ++ etc. </li></ul><ul><li>Cofactor orgánico= coenzima . </li></ul><ul><li>Derivadas de vitaminas hidrosolubles (complejo B y vit. C): ej. NAD+; </li></ul><ul><li>FAD; CoA, NADP. </li></ul><ul><li>Derivadas de vitaminas liposolubles ( A, D, E, K): ej. retinal. </li></ul><ul><li>Cofactores y coenzimas unidos covalentemente a la enzima forman grupos prostéticos. </li></ul><ul><li>La enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima . </li></ul><ul><li>Parte proteica de un holoenzima: apoenzima. </li></ul>COFACTORES apoenzima + grupo prostético= holoenzima
  34. 35. VITAMINAS HIDROSOLUBLES Y SU FORMA COENZIMÁTICA Desconocida Ácido ascórbico ( Vit C) Pirofosfato de Tiamina (PPT) Tiamina (B1) Coenzimas de Flavina (FAD, FMN) Riboflavina ( B2) Fosfato de piriridoxal Piridoxina (B6) Coenzima A (CoA) Ácido pantoténico Coenzimas de nicotinamida (NAD+ y NADP) Ácido nicotínico (niacina) Ácido Tetrahidrofólico (THF) Ácido Fólico Coenzimas de cobalamina: Desoxiadenosilcobalamina Metilcobalamina Cobalamina ( B12) Biocitina Biotina Coenzima Vitaminas Hidrosolubles
  35. 36. VITAMINAS LIPOSOLUBLES Y SU FORMA COENZIMÁTICA Desconocida Vitamina K Desconocida Vitamina E 1, 25-Dihidroxicolecalciferol Vitamina D Retinal Vitamina A Coenzima Vitaminas Liposolubless

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